Kỹ thuật phân tử
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.53 MB, 73 trang )
CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT
ACID NUCLEIC
2/2016
1
DNA
DNA tái tổ hợp
(recombinant DNA)
RNA
DNA bộ gen
(genomic DNA)
Guanidium thiocyanate
Phenol và SDS
PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA
Bước 1. Phá màng tế bào và màng nhân, giải phóng
DNA và phân hủy các protein liên kết với DNA.
Tế bào, mô được nghiền trong hỗn hợp chất tẩy (SDS,
sarcosyl) và proteinase (proteinase K, lysozyme)
Bước 2. Loại bỏ các thành phần không mong muốn
trong mẫu (protein, polysaccharide, lipid, RNA).
Sử dụng phenol:chloroform làm biến tính protein
Bước 3. Nucleic acid có thể được kết tủa trong ethanol
(tỉ lệ 2:1) hay isopropanol (tỉ lệ 1:1) kết hợp nồng độ
muối cao, sau đó được thu nhận bằng cách ly tâm.
3
4
Một số dụng cụ trong ly trích các phân tử
sinh học
1000 -100 10 -
5
Những lưu ý khi sử dụng micropipette
Khoảng thể tích sử
dụng của micropipette
Cách điều chỉnh thể
tích lấy mẫu
Loại đầu tip sử dụng
6
Pha lỏng
DNA
protein
Pha hữu cơ
RNA, lipid
Tách chiết DNA sử dụng phenol:chloroform:isoamyl
alcohol, pH 8; DNA nằm ở pha lỏng của hỗn hợp.
7
DNA kết tủa
trong ethanol
70%
Cột silica chứa mẫu DNA trong
buffer có nồng độ ion cao
8
Monogram for estimation of
centrifuge rpm setting
9
PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RNA
Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng gồm các
bước cơ bản như phương pháp tách chiết DNA.
Tế bào, mô được nghiền trong dung dịch gồm chất tẩy
mạnh, một tác nhân gây biến tính protein mạnh
(guanidinium thiocyanate), một chất khử (β-mercapto
ethanol).
Các protein được loại bỏ khỏi mẫu qua xử lí
phenol:chloroform và li tâm.
RNA hòa tan trong nước được tủa bằng ethanol và thu
nhận thông qua li tâm.
10
11
PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT mRNA
mRNA chiếm 1-5% RNA tổng số của tế
bào với điểm chung là cấu trúc đuôi
polyA.
Dựa vào liên kết bổ sung T-A, cột
oligodT-cellulose được sử dụng để
tách mRNA ra khỏi mẫu RNA tổng số
(hình bên)
mRNA có thể được tinh sạch bằng các
kỹ thuật như siêu li tâm, sắc kí hay
điện di
Cột oligodT
cellulose 12
Ly trích RNA tổng số
13
Ly trích mRNA từ dịch trích RNA tổng số sử dụng cột oligodT
cellulose
14
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG THƠ
ACID NUCLEIC
6/2011
15
Định lượng bằng quang phổ kế (Spectrophotometer)
Phương pháp cho phép ước lượng tương đối nồng độ
nucleic acid, protein, tế bào trong dung dịch.
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự hấp thu
ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (OD260)của
phân tử acid nucleic.
Một dung dịch acid nucleic tinh sạch thường có tỉ số
OD260/OD280 trong khoảng 1,8 -2.
1 đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ DNA sợi đôi
50 μg/ml và dung dịch RNA hay DNA sợi đơn 40
μg/ml.
16
17
Cấu tạo cơ bản của quang phổ kế
18
Quang phổ kế
19
PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI
20
Phương pháp điện di
Được sử dụng trong phân tích định tính và thu nhận
mẫu nucleic acid.
Nguyên tắc của phương pháp dựa vào đặc tính cấu trúc
và sự tích điện của phân tử. Dưới tác động của điện
trường, các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương.
Tính linh động của phân tử phụ thuộc vào khối lượng
phân tử của chất điện di và nồng độ các chất cấu thành
gel.
Việc lựa chọn gel, nồng độ gel phụ thuộc vào kích
thước của phân tử cần phân tách.
21
Nồng độ gel điện di phương nằm ngang
22
Điện di với gel agarose
Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để
phân tách các nucleic acid có kích thước từ 0,5 – 20 kb.
Gel được chuẩn bị trên giá thể nằm ngang và điện di được
thực hiện theo phương nằm ngang.
Sự di chuyển của nucleic acid trong gel được đánh dấu bởi
chất nhuộm mẫu (sample loading dye).
Kết quả điện di được quan sát dưới tia UV sau khi nhuộm
gel với ethidium bromide (EtBr).
Kích thước của mẫu điện di được xác định dựa vào “thang
chuẩn” hay “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử”
(Molecular weight marker)
23
SAFE DNA gel stain
và Ethidium
Bromide
24
Gel agarose được dùng để
phân tách DNA/RNA .
A Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. B. Gel sau khi điện di
được nhuộm EtBr và quan sát dưới tia UV; phân tử EtBr xen vào giữa các
base và khiến phân tử DNA phát quang khi được chiếu tia UV.
25
