BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG CĐ KINH TẾ CÔNG NGHỆ TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*****************







GVGD: ThS. Lê Thanh Hải



TPHCM, tháng 03 năm 2013





- i -
MỤC LỤC

LI NÓI U 1

NI QUY THC TP 2

BÀI 1: NH LƯNG NITƠ ACID AMIN BNG PHƯƠNG PHÁP CHUN 

FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN) 3

1/

Nguyên tc 3

2/

Thc hành 3

2.1.

Nguyên liu và hóa cht 3

2.2.

Dng c và thit b 3

2.3.

Tin hành 3

2.4.

Kt qu 4

BÀI 2: PHN NG BIURE 5

1/


Nguyên tc 5

2/

Thc hành 5

2.1.

Nguyên liu và hóa cht 5

2.2.

Dng c và thit b 5

2.3.

Tin hành 5

2.4.

Kt qu 5

BÀI 3: XÁC NH IM NG IN CA PROTEIN CASEIN 6

1/

Nguyên tc 6

2/


Thc hành 6

1.1.

Nguyên liu và hóa cht 6

1.2.

Dng c và thit b 6

1.3.

Tin hành 6

1.4.

Kt qu 6

BÀI 4: SO SÁNH TÁC DNG XÚC TÁC CA ENZYME VI XÚC TÁC VÔ CƠ 7

1/

Nguyên tc 7

2/

Thc hành 7

2.1.


Nguyên liu và hóa cht 7

2.2.

Dng c và thit b 7

2.3.

Tin hành 7

2.4.

Kt qu 8

BÀI 5: TÍNH C HIU CA ENZYME 9

1/

Nguyên tc 9

2/

Thc hành 9

2.1.

Nguyên liu và hóa cht 9

- ii -
2.2.


Dng c và thit b 9

2.3.

Tin hành 9

2.4.

Kt qu 10

BÀI 6: TÁC DNG CA CHT KÍCH THÍCH VÀ CHT KÌM HÃM 11

1/

Nguyên tc 11

2/

Thc hành 11

2.1.

Nguyên liu và hóa cht 11

2.2.

Dng c và thit b 11

2.3.


Tin hành 11

2.4.

Kt qu 12

BÀI 7: XÁC NH HOT TÍNH CA ENZYME LIPASE 13

1/

Nguyên tc 13

2/

Thc hành 13

2.1.

Nguyên liu và hóa cht 13

2.2.

Dng c 13

2.3.

Tin hành 13

2.4.


Tính kt qu 14

BÀI 8: KHO SÁT HOT TÍNH ENZYME ASCOBATOXIDASE 15

1/

Nguyên tc 15

2/

Thc hành 15

2.1.

Nguyên liu và hoá cht 15

2.2.

Dng c 15

2.3.

Tin hành 15

2.4.

Cách tính kt qu: 16

BÀI 9: XÁC NH HÀM LƯNG PROTEIN TRONG DCH CHIT T QU DA

(PHƯƠNG PHÁP LOWRY) 17

1/

Nguyên tc 17

2/

Thc hành 17

2.1.

Nguyên liu và hoá cht 17

2.2.

Dng c và thit b 17

2.3.

Tin hành 17

2.4.

Tính kt qu 19

BÀI 10: KHO SÁT HOT TÍNH ENZYME BROMELIN 20

1/


Nguyên tc 20

2/

Thc hành 20

2.1.

Dng c 20

2.2.

Hoá cht 20

- iii -
2.3.

Cách tin hành 20

2.4.

Kt qu 21

BÀI 11: XÁC NH HOT TÍNH ENZYM α-AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH
VÀ ROE 22

1/

Nguyên tc 22


2/

Thc hành 22

2.1.

Nguyên liu và hoá cht 22

2.2.

Dng c và thit b 22

2.3.

Cách tin hành 23

2.4.

Tính kt qu 25





- 1 -
LỜI NÓI ĐẦU
Giáo trình “Thc hành công ngh protein – enzyme” ưc biên son nhm phc v cho môn
hc thc hành công ngh protein – enzyme ca sinh viên chuyên ngành công ngh thc phm
và sinh hc ng dng – Khoa Công ngh Sinh hc – Trưng Cao ng Kinh t Công ngh
TPHCM. Giáo trình ưc biên son da trên cơ s tham kho các tài liu và sách thí nghim

v protein – enzyme trong và ngoài nưc.
Trong tài liu này gm 11 bài thc hành nhm giúp sinh viên làm quen vi các phương tin
và quy tc an toàn thí nghim, s dng dng c, thit b và thc hành thí nghim nh tính,
nh lưng acid amin, protein, enzyme t ơn gin n phc tp.
Các bài thí nghim này giúp sinh viên nm vng tính cht ca protein – enzyme và hiu rõ
hơn các kin thc lý thuyt ã hc t môn hc Công ngh Protein – Enzyme.

Tác giả
ThS. Lê Thanh Hi



- 2 -
NỘI QUY THỰC TẬP
1. Sinh viên phi có mt ti phòng thí nghim úng gi, nu ngh hc phi có lý do chính
áng, phi xin phép giáo viên.
2. Sinh viên phi c k, nm vng ni dung bài thí nghim  nhà và chun b sn bn báo
cáo kt qu thí nghim trưc khi thí nghim.
3. Trong phòng thí nghim phi mc áo blouse, rt thn trng khi s dng dung môi d cháy
n và hóa cht c hi.
4. Áp dng tr im 20% tng bài thí nghim trong các trưng hp sau: không chun b
trưc, không có áo blouse, i tr quá 10 phút không gi trt t, tác phong không nghiêm
túc, vi phm ni quy phòng thí nghim, thao tác cu th không thn trng.
5. Khi làm thí nghim phi trt t, cn thn, gi sch nơi làm thí nghim, tit kim hóa cht,
làm v hay gây hư hng thit b thì phi bi thưng.
6. Sau khi thí nghim, sinh viên phi ra sch dng c, sp xp li dng c, hóa cht úng
ch, lau sch bàn thí nghim và bàn giao cho cán b ph trách phòng thí nghim.
7. Cui bui sinh viên phi np báo cáo kt qu li cho giáo viên hưng dn.



Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 3 -
BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
CHUẨN ĐỘ FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN)
1/ Nguyên tắc
Các aldehyde d kt hp vi nhóm amin. Khi cho formaldehyde tác dng vi acid amin,
nhóm amin b methylen hóa to thành dn xut methylen imino acid.
Hp cht to thành có tính acid mnh hơn acid amin t do, các nhóm carboxyl ca chúng d
dàng nh phân bng kim, qua ó gián tip tính ưc lưng nitơ amin ca các acid amin có
trong dung dch.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Nưc mm : 1ml
- Dung dch NaOH 0,05N : 100ml
- Dung dch HCl 0,05N : 30ml
- Formol trung tính : 10ml
- Bromthymol blue 0,04% : 20ml
- Phenolphtalein 0,5% : 20ml
- Dung dch m phosphate pH = 7 : 50ml
o Dung dich A: 27,8 g NaH
2
PO
4
hoà tan trong 1000ml
o Dung dch B: 53.05g Na
2
HPO
4

.7H
2
O hoc 71.1g Na
2
HPO
4
.12H
2
O pha trong
1000ml
o  pha dung dch m phosphate pH =7 hút dung dch A và dung dch B theo t
l sau:
Dung dich A: 39 ml + dung dich B: 61ml thêm nưc va  200ml.
- Dung dch m phosphate pH = 9,2 : 50ml
(Hòa tan 456g kali hydro phosphate ngm 3 phân t nưc (K
2
HPO
4
.3H
2
O) trong
1000ml nưc ct)
2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Bình nh mc 100ml : 1 bình
- Pipette 1ml : 2
- Pipette 10ml : 2
- Erlen 100ml : 6 bình
- Burette 25ml : 1
- Becher 100ml : 4 cái
2.3. Tiến hành

Chuẩn bị thang màu có pH 7 và pH 9,2
Ly 2 erlen 100ml:
- Cho vào bình th nht: 20ml dung dch có pH 7,0 và 5 git bromthymol blue
0,04%.
- Cho vào bình th hai: 20ml dung dch có pH 9,2; 5 git bromthymol blue 0,04%
và 3 git phenolphtalein 0,5%
Khi ó dung dch trong bình 1 có màu xanh lc nht, dung dch trong bình 2 có màu tím xanh.
Màu ca các dung dch trên gi trong bình kín có th bn trong na tháng.

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 4 -
Xác định hàm lượng nitơ amin trong nước mắm:
Nưc mm là mt dung dch thy phân protein có th nh lưng nitơ bng phương pháp
chun  formol. Do nưc mm có màu ti cn phi pha tht loãng mi có th so màu ca
cht ch th.
Ly 1ml nưc mm cho vào bình nh mc 100ml, dùng nưc ct nh mc thành 100ml, lc
u.
Ly vào bình erlen có cùng dung tích vi 2 bình màu chun 20ml dch mu pha loãng t bình
nh mc, thêm 5 git bromthymol blue. Nu dung dch có màu xanh dương thì thêm tng
git HCl hay H
2
SO
4
0,05N; nu dung dch có màu vàng thì thêm tng git NaOH 0,05N cho
n khi dung dch có màu ng vi màu ca bình 1 có pH 7,0.
Thêm 3 git phenolphtalein 0,5%; 4ml formol trung tính ri chun  bng NaOH 0,05N cho
n khi hn hp có màu ng vi màu ca dung dch trong bình 2 có pH 9,2.
Song song tin hành làm thí nghim kim chng, thay dung dch nghiên cu bng nưc ct.

2.4. Kết quả
S gram nitơ acid amin có trong 1 lít nưc mm:
ݔ =
ሺ
ܽ − ܾ
ሻ
× ܶ × 0,0007 × 100 × 1000
20 × ܸ

Trong ó:
x: lưng gram nitơ acid amin có trong 1 lít nưc mm
a: s ml dung dch NaOH 0,05N dùng  chun dung dch thí nghim
b: s ml dung dch NaOH 0,05N dùng  chun dung dch kim chng
T: h s hiu chnh nng  ca dung dch NaOH em dùng so vi nng  chun
V: s ml nưc mm cho vào bình nh mc
0,0007: s gram nitơ vi 1ml NaOH 0,05N

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 5 -
BÀI 2: PHẢN ỨNG BIURE
1/ Nguyên tắc
ây là phn ng thưng dùng  phát hin liên kt peptide (-CO-NH-). Phn ng xy ra i
vi các cht cha t hai liên kt peptide tr lên. Phn ng này dùng  nh lưng protein
bng cách lp  th chun vi các dung dch protein chun có nng  xác nh nh k thut
so màu. Nng  protein ti thiu  nh lưng chính xác là 10mg/ml.
Tùy thuc vào gc R mà màu phn ng có th là màu xanh tím, tím hoc hng.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất

- Dung dch CuSO
4
1% : 10ml
- Dung dch NaOH 10% : 10ml
- Ure : 2 – 3g
- Dung dch lòng trng trng 1% : 10ml
2.2. Dụng cụ và thiết bị
- ng nghim : 04 ng
- Pipette 1ml : 02 pipette
- Pipette 5ml : 01 pipette
- Becher 50ml : 03 cc
2.3. Tiến hành
Ly ng nghim khô, sch cho vài tinh th ure, un nh ti nóng chy, khô cng to thành
biure khi có NH
3
bay hơi, nhn bit bng mùi hoc th bng giy quỳ o pH.  ngui thêm
vào 2 ml dung dch NaOH 10%, lc u cho tan ht và thêm 2 – 3 git dung dch CuSO
4
1%.
Ly ng nghim th hai cho 1ml dung dch lòng trng trng, 1ml dung dch NaOH 10%, thêm
2 – 3 git CuSO
4
1%, lc u.
2.4. Kết quả
Chp hình, ghi màu và vit phương trình phn ng ca 2 phn ng trên.

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 6 -

BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN CASEIN
1/ Nguyên tắc
Các phân t protein là các polymer có tính in ly lưng cc. Trong dung dch, khi pH thay
i nó phân ly to thành các nhóm tích in dương và các nhóm tích in âm khác nhau. i
vi mi protein s có mt giá tr pH xác nh mà ti ó tng s in tích âm bng tng s in
tích dương, khi ó phân t protein trung hòa v in, pH ó gi là im ng in ca protein.
Ti im ng in, dung dch protein không bn, d b kt ta.
2/ Thực hành
1.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Dung dch acid acetic (CH
3
COOH) 0,1N : 100ml
- Dung dch natri acetate (CH
3
COONa) 0,1N : 100ml
- Dung dch casein 0,4%: Cân 0,4g casein cho vào becher 100ml và thêm 20ml dung
dch CH
3
COONa 0,1N. t lên ni cách thy un nóng  hòa tan hoàn toàn.
Chuyn sang bình nh mc 100ml và nh mc ti 100ml bng dung dch
CH
3
COONa 0,1N.
- Nưc ct : 50ml
1.2. Dụng cụ và thiết bị
- ng nghim : 10 ng
- Pipette 1ml : 02 pipette
- Bình nh mc 100ml : 01 bình
- Becher 100ml : 03 cc
- Ni cách thy : 01 cái

1.3. Tiến hành
Ly dung dch CH
3
COOH 0,1N và nưc vào 5 ng nghim theo th t như bng sau:
Lc u, sau ó thêm vào mi ng 1ml dung dch casein và theo dõi s bin i ca chúng
trong mi ng nghim.
Bảng 1. Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện của protein casein
TT ống nghiệm 01 02 03 04 05
CH
3
COOH 0,1N (ml) 0,1 0,2 1,0 4,0 8,0
Nưc ct (ml) 8,9 8,8 8,0 5,0 1,0
Dung dch casein 0,4% (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
pH 5,6 5,3 4,7 4,1 3,8
Mc  kt ta
1.4. Kết quả
 ng nghim có nhiu kt ta nht là im ng in ca casein.
Chp hình và ghi li kt qu xác nh pH ng in ca casein.
Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 7 -
BÀI 4: SO SÁNH TÁC DỤNG XÚC TÁC CỦA ENZYME VỚI XÚC TÁC
VÔ CƠ
1/ Nguyên tắc
Cht xúc tác là cht làm cho phn ng xy ra nhanh hơn nhưng không b tiêu hao trong quá
trình phn ng. Enzyme là các cht xúc tác ca các h thng sinh hc. Chúng có kh năng xúc
tác c bit, thưng mnh hơn nhiu so vi các cht xúc tác tng hp. Tác dng xúc tác ca
chúng mang tính c hiu cao i vi cơ cht, làm tăng áng k tc  các phn ng hóa hc
xy ra trong môi trưng nưc  iu kin nhit  và pH ôn hòa.

2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Enzyme amylase : 5ml
- Dung dch HCl 1% : 5ml
- Nưc ct : 5ml
- Dung dch h tinh bt 10% : 10ml
2.2. Dụng cụ và thiết bị
- ng nghim : 04 ng
- Pipette 1ml : 02 pipette
- Ni un cách thy : 01 cái
- T m : 01 cái
- Becher 50ml : 03 cc
2.3. Tiến hành
Ly 4 ng nghim ã ghi s, mi ng 2ml dung dch tinh bt 10%. Sau ó thêm vào:
- ng th nht: 1ml nưc ct
- ng th hai: 1ml dung dch enzyme amylase
- ng th ba: 1ml dung dch enzyme amylase
- ng th tư: 1ml dung dch HCl 1%
Sau ó t các ng nghip th nht và th hai  nhit  phòng, ng th ba vào t m 60
o
C.
t ng th tư vào ni cách thy ang sôi. Sau 10 phút ly các ng nghim ra, cho vào mi
ng 5ml thuc th Lugol. t c 4 ng vào ni cách thy trong 2 phút. Ly ra làm ngui và
quan sát hin tưng trong các ng nghim

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 8 -
2.4. Kết quả

Chp hình và ghi kt qu vào bng sau:
Bảng 2. Bảng kết quả thí nghiệm so sánh tác dụng xúc tác của enzyme với xúc tác vô cơ
Ống nghiệm Cơ chất Xúc tác
Nhiệt độ
(
o
C)
Phản ứng
Lugol
1
Tinh bt Không 30
2
Tinh bt Amylase 30
3
Tinh bt Amylase 60
4
Tinh bt HCl 100
Nhn xét v tác dng ca tng loi xúc tác và nh hưng ca nhit .

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 9 -
BÀI 5: TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME
1/ Nguyên tắc
Tính cht c hiu là biu hin kh năng xúc tác ca enzyme i vi cơ cht nht nh.
Enzyme có tính c hiu rt cao. Tính cht c hiu ca enzyme cho thy s khác bit rt ln
gia enzyme vi các cht xúc tác khác.
Mi loi enzyme ch có kh năng xúc tác cho s chuyn hóa mt hay nhiu cht nht nh
theo mt kiu phn ng nht nh. Tính cht c hiu ca enzyme biu hin  mt s kiu

c hiu sau:
Đặc hiệu kiểu phản ứng: mi enzyme ch xúc tác cho mt kiu phn ng chuyn hóa nht
nh trong các kiu phn ng như phn ng oxy hóa kh, phn ng chuyn b, phn ng thy
phân…
Đặc hiệu kiểu cơ chất: có 3 kiu c hiu cơ cht
- c hiu tuyt i: mi enzyme ch xúc tác i vi mt cơ cht nht nh
- c hiu tương i: mi enzyme ch xúc tác i vi mt kiu liên kt hóa hc nht nh
- c hiu quang hc (c hiu lp th): mi enzyme ch xúc tác i vi mt dng ng
phân quang hc ca cơ cht (cis hoc trans)
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Enzyme amylase : 5ml
- Dung dch HCl 1% : 5ml
- Nưc ct : 5ml
- Dung dch h tinh bt 10% : 10ml
2.2. Dụng cụ và thiết bị
- ng nghim : 04 ng
- Pipette 1ml : 02 pipette
- Ni un cách thy : 01 cái
- T m : 01 cái
- Becher 50ml : 03 cc
2.3. Tiến hành
Ly 4 ng nghim ã ghi s, sau ó thêm vào:
- ng th nht: 2ml dung dch h tinh bt 5% + 1ml dung dch enzyme amylase
- ng th hai: 2ml dung dch h tinh bt 5% + 1ml dung dch enzyme bromelin
- ng th ba: 2ml dung dch casein 2% + 1ml dung dch enzyme amylase
- ng th tư: 2ml dung dch casein 2% + 1ml dung dch enzyme bromelin
Lc u và  vào t m  37
o
C trong 15 phút. Ly ra, cho vào ng nghim th nht và th

hai mi ng 02 git thuc th Lugol và t vào b iu nhit ang sôi trong 2 phút thì ly các
ng nghim ra, làm ngui ti nhit  phòng.
Cho ng th ba và th tư mi ng 02 git thuc th Folin.

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 10 -
2.4. Kết quả
Chp hình và ghi kt qu vào bng sau:
Bảng 3. Bảng kết quả thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của enzyme
Ống nghiệm Cơ chất Xúc tác Phản ứng thử Kết quả
1
Tinh bt Amylase
2
Tinh bt Bromelin
3
Casein Amylase
4
Casein Bromelin
Nhn xét v tính c hiu ca enzyme.


Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 11 -
BÀI 6: TÁC DỤNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH VÀ CHẤT KÌM HÃM
1/ Nguyên tắc
Các cht có tác dng làm tăng hot tính ca enzyme gi là các cht hot hóa enzyme. Các

cht hot hóa có th là nhng anion, các ion kim loi (t ô th 11 n ô th 55 trong bng h
thng tun hoàn), các cht hu cơ có cu trúc phc tp. Các cht hot hóa thưng làm nhim
v chuyn nhóm hydrogen hoc nhng cht có kh năng phá v mt s liên kt trong phân t
tin enzyme hoc các cht có tác dng phc hi các nhóm chc năng trong trung tâm hot
ng ca enzyme.
Các cht kìm hãm hot ng ca enzyme thưng là các cht có mt trong phn ng enzyme,
làm gim hot tính enzyme nhng không b enzyme làm thay i tính cht hóa hc, cu to
hóa hc và tính cht vt lý ca chúng. Các cht gây kìm hãm hot ng ca enzyme bao gm
các ion, các phân t vô cơ, các cht hu cơ và c protein.
- Cht kìm hãm cnh tranh: là nhng cht có cu trúc tương t như cu trúc ca cơ cht.
Chúng thưng là cht kim hãm thun nghch. Chúng có kh năng kt hp vi trung tâm
hot ng ca enzyme và chim ly v trí ca cơ cht trong trung tâm hot ng.
- Cht kìm hãm không cnh tranh: nhng cht này không chim trung tâm hot ng ca
enzyme mà liên kt vi v trí ngoài trung tâm hot ng làm thay i cu trúc không
gian ca phân t enzyme theo chiu hưng bt li cho hot ng xúc tác.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Enzyme amylase : 5ml
- Dung dch NaBr 0,5% : 5ml
- Dung dch CuSO
4
0,5% : 5ml
- Nưc ct : 5ml
- Dung dch h tinh bt 1% : 20ml
- Thuc th Lugol : 5ml
- Thuc th Fehling : 5ml
2.2. Dụng cụ và thiết bị
- ng nghim : 03 ng
- Pipette 5ml : 01 pipette
- Pipette 1ml : 01 pipette

- B iu nhit : 01 thit b
- Becher 50ml : 03 cc
2.3. Tiến hành
Cho vào 03 ng nghim mi ng 5ml dung dch h tinh bt 1%, sau ó cho vào:
- ng th nht: 1ml nưc ct
- ng th hai: 1ml dung dch NaBr 0,5%
- ng th ba: 1ml dung dch CuSO
4
0,5%
Sau ó cho vào c ba ng mi ng 1ml dung dch enzyme amylase. Lc u và  vào t m 
37
o
C trong 15 phút. Ly ra, cho vào mi ng 2 git thuc th Lugol, lc u.
Tip tc cho vào mi ng 5ml dung dch Fehling và t vào b iu nhit ang sôi trong 2
phút, làm ngui ti nhit  phòng

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 12 -
2.4. Kết quả
Chp hình và ghi kt qu vào bng sau:
Bảng 4. Bảng kết quả thí nghiệm xác định tác dụng của chất hoạt hóa và kiềm hãm hoạt tính của enzyme amylase
Ống nghiệm Cơ chất Xúc tác Phản ứng thử Kết quả
1
Tinh bt Amylase
2
Tinh bt Amylase
3
Tinh bt Amylase

Nhn xét v tác dng ca cht hot hóa và cht kim hãm n hot tính ca enzyme amylase.

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 13 -
BÀI 7: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE
1/ Nguyên tắc
Lipase là enzym thuc nhóm thy phân, phân nhóm esterase – xúc tác phn ng thy gii các
ni ester gia glycerine và các acid béo trong glyceride.
Nh hot ng ca lipase, các acid béo ưc gii phóng làm tăng  chua ca môi trưng
phn ng. Lưng acid ó s ưc chun  bng kim và ch s hot  ca enzym s là
lưng kim cn  trung hòa các acid béo mi ưc hình thành.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
- Tu tng ng vt : 4g
- Sa tươi : 100ml
- KOH 0,1N : 100ml
- Cn 96% : 50ml
- Phenolphtalein 1% : 15ml
- Hn hp nưc - glycerin : 40ml (t l 3 nưc : 1glycerin)
- H2SO4 0,1N chun : 100ml
- Vi màn : 1
- Giy lc : 4
- Phu lc
2.2. Dụng cụ
- Erlen 100ml : 7
- B iu nhit : 1
- Buret 25ml : 1
- Bercher 100ml : 4

- Pipet 5ml : 2
- Pipet 10ml : 2
- Ci s : 1
- Bp in : 1
2.3. Tiến hành
Chuẩn bị chế phẩm lipase từ tuỵ tạng động vật: Cân 1g ty tng ng vt, cho vào ci
nghin 5ml hn hp nưc – glycerin (t l 3:1), nghin k t 3 – 5 phút. Sau ó, li cho thêm
5ml hn hp nưc – glycerin và nghin tip 1 -2 phút. Lc vt hn hp qua vi màn, sau ó
lc li qua giy lc, thu dch lipase  làm thí nghim
Xác định hoạt tính của enzyme lipase:
Ly 02 erlen 100ml, cho vào mi bình 10ml sa tươi
- Erlen 1 (erlen thí nghim): cho vào 2 ml lipase, lc u, t vào b iu nhit  37
0
C –
40
0
C trong 1 gi
- Erlen 2 (erlen i chng): un sôi sa trong bình, sau ó cho ngay 2ml lipase vào và un
sôi tip 5 phút.  ngui n nhit  phòng. Sau ó t vào b iu nhit  37
0
C –
40
0
C trong 1 gi
Sau 1 gi ly erlen ra, thêm vào mi bình 8ml cn 96%, vài git phenolphtalein, chun  c
hai erlen bng KOH 0,1N.
Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 14 -

Tin hành thí nghim 2 ln. Ly kt qu là giá tr trung bình ca 2 ln thí nghim
Cách xác định hệ số hiệu chỉnh k:
- Chun  10ml dung dch KOH 0,1N bng dung dch H
2
SO
4
0,1N chun, thuc th màu
là phenolphtalein cho n khi dung dch va mt màu hng thì dng li
- Xác nh lưng H
2
SO
4
0,1N chun cn dùng
- Tin hành thí nghim 3 ln. Ly kt qu là giá tr trung bình ca 3 ln thí nghim
2.4. Tính kết quả
Hệ số hiệu chỉnh k được tính như sau:
- Tính nng  KOH thc t:
ܥ
௄ைு௧
× ܸ
௄ைு௧
= ܥ
ு2ௌை4
× ܸ
ு2ௌை4

- H s hiu chnh k:
݇ =
ܥ
௄ைு௧

ܥ
௄ைு௣
ℎ݋ặܿ݇ = 
ܸ
௄ைு௣
ܸ
௄ைு௧

Trong ó:
C
KOHt
: Nng  dung dch KOH thc t
V
KOHt
: Th tích dung dch KOH thc t
C
KOHp
: Nng  dung dch KOH pha
V
KOHp
: Th tích dung dch KOH pha
Hoạt độ lipase: ưc biu th bng s ml KOH ã dùng  chun  acid béo to thành t s
thy phân lipid có trong 1 lít sa và ưc tính theo công thc sau:
ܺ =
ሺ
ܸ
1
− ܸ
2
ሻ

× ݇ × 100
Trong ó:
X : Hot  ca enzyme lipase (UI)
V
1
: S ml KOH 0,1N ã dùng  chun  erlen thí nghim (erlen 1)
V
2
: S ml KOH 0,1N ã dùng  chun  erlen i chng (erlen 2)
k : H s hiu chnh ca dung dch KOH

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 15 -
BÀI 8: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME ASCOBATOXIDASE
1/ Nguyên tắc
Ascobatoxidase là enzym thuc lp oxi hoá kh (oxireductase) có nhiu trong các loi rau qu
tươi và nhiu nht  lp v qu. Enzym này oxi hoá acid ascorbic thành acid dehydroascorbic.
Trong thành phn ca enzym này có s hin din ca ion Cu2+.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hoá chất
- Dưa chut : 100g
- Dung dch m photphat 0,15M pH7 : 150ml
- Acid ascorbic (nng  1mg/ml) : 100ml
- Dung dch KI 10% : 50ml
- Dung dch HCl 5% : 100ml
- Dung dch h tinh bt 1% : 50ml
- Dung dch KIO3 0,01N : 150ml
- Dung dch Na

2
S
2
O
3
0,01N : 100ml
- Cách pha dung dch m phosphate pH 7:
o Dung dich A: 27,8 g NaH2PO4 hoà tan trong 1000ml
o Dung dch B: 53.05g Na
2
HPO
4
.7H
2
O hoc 71.1g Na
2
HPO
4
.12H
2
O pha trong
1000ml
o  pha dung dch m phosphate pH =7 hút dung dch A và dung dch B theo t
l sau:
Dung dich A: 39 ml + dung dich B: 61ml thêm nưc va  200ml.
2.2. Dụng cụ
- Ci s : 1
- Becher 50ml : 2
- Becher 100ml : 2
- Erlen 100ml : 3

- Bình nh mc 50ml : 2
- Erlen 250ml : 4
- Buret 25 ml : 1
- Pipet 5ml : 2
- Pipet 10ml : 2
- Giy lc : 4
- Phu lc : 2
2.3. Tiến hành
Chiết tách enzym ascobatoxidase: Cân 30g dưa chut (b ht) cho vào ci s, nghin vi 10
– 15ml dung dch m phosphat 0,15M pH 7. Dch chit ưc cho vào bình nh mc 50ml
và thêm dung dch m n vch nh mc. Lc u nhiu ln và  yên trong 1 gi. Lc thu
dch lc. Dch lc là ch phm enzym ascobatoxidase.
Khảo sát hoạt tính enzym ascobatoxidase
- Hút 10 ml dung dch enzym cho vào becher 100ml. Sau ó cho thêm 10ml dung dch
acid ascorbic. Lc u,  yên  nhit  phòng 30 phút. Tip theo un sôi trc tip trên
bp  ngng phn ng, ri cho vào bình nh mc 50 ml và làm y bng nưc ct.
Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 16 -
- Ly 10ml dch trong bên trên cho vào erlen 250ml, thêm 5ml dung dch KI 10%, 10 ml
dung dch HCl 5%, 10 git h tinh bt 1% và 10 ml dung dch KIO
3
0,01N. Lc u, 
yên 5 phút ri chun  bng dung dch Na
2
S
2
O
3

0,01N n khi mt màu xanh.
- Làm mt mu i chng tương t như trên vi 10ml dung dch enzym ã ưc un sôi
trong 2 phút và làm lnh.
- Tin hành thí nghim 2 ln. Kt qu là giá tr trung bình
Xác định hệ số hiệu chỉnh của Na
2
S
2
O
3
0,01N bằng dung dịch KIO
3
0,01N chuẩn (tương t
như cách xác nh h s hiu chnh ca dung dch KOH 0,1N)
2.4. Cách tính kết quả:
Hot tính ca enzym ascobatoxidase ưc hin th bng s mg acid ascorbic b oxi hoá dưi
tác ng ca enzym có trong 1g nguyên liu trong thi gian 1 phút.
Hot tính ca enzym ưc tính theo công thc:
ܺ =
ሺ
ܸ
1
− ܸ
2
ሻ
× ݇ × 0,088
݉ × ݐ

Trong ó
X : Hot  ca enzyme ascorbatoxidase (UI)

V
1
: Th tích Na
2
S
2
O
3
dùng  erlen thí nghim
V
2
: Th tích Na
2
S
2
O
3
dùng  erlen i chng
k : H s hiu chnh ca dung dch Na
2
S
2
O
3
0,01N
0,088 : S mg acid ascorbic tương ng vi 1 ml dung dch Na
2
S
2
O

3
0,01N
m : Khi lưng nguyên liu  chit enzym (g)
t : Thi gian phn ng (phút)

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 17 -
BÀI 9: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT TỪ
QUẢ DỨA (PHƯƠNG PHÁP LOWRY)
1/ Nguyên tắc
Hu ht các protein u cha Tyrosin và Tryptophan. Hàm lưng ca nhng acid amin này
tùy thuc vào tng loi protein. Vì vy nhng protein cùng mt loi vi nhau có hàm lưng
các acid amin này ging nhau.
Khi cho các protein tác dng vi thuc th Folin s to thành mt phc cht có màu. Cưng
 màu ca cht này t l vi hàm lưng Tyrosin và Tryptophan (tương ng vi hàm lưng
protein). Vì vy có th dùng phương pháp so màu  xác nh hàm lưng protein.
2/ Thực hành
2.1. Nguyên liệu và hoá chất
- Da (thơm) xanh : 1 trái
- Dung dch albumin 0,1% : 100ml
- Dung dch A: : 100ml
(Cân 2g Na
2
CO
3
hòa tan trong NaOH 0,1N va  100ml)
- Dung dch B: : 100ml
(Cân 0,5g CuSO

4
.5H
2
O hòa tan trong dung dch citrat natri 1% va  100ml)
- Dung dch C : 50ml
(Là hn hp ca 2 dung dch A và B theo t l 49:1 (ch pha dùng trong ngày))
- Thuc th Folin : 0,2ml
2.2. Dụng cụ và thiết bị
- ng nghim : 20
- Pipet 1ml : 2
- Pipet 10ml : 1
- Máy o mt  quang : 1
- Curvet : 20
- Erlen 100ml : 4
- Becher 250ml : 2
- Máy xay sinh t : 2
- Vi màn : 1
- Giy lc : 4
- Phu lc : 2
2.3. Tiến hành
Chuẩn bị dịch protein mẫu từ quả dứa: Chn trái thơm xanh tươi, gt b v ngoài, ct nh
và xay nát trong máy xay sinh t. Lc qua tm vi màn và vt nưc. Lc bng giy lc thu
dch lc trong. Dch lc là dung dch protein mu.

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 18 -
Xây dựng đường chuẩn albumin:
Bảng 5. Bố trí thí nghiệm xác định đường chuẩn albumin

Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ protein (µg/ml) 0 50 100 150 200 250

Dung dch albumin 0,1%
(ml)
0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Nưc ct (ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5
Từ mỗi nồng độ khác nhau hút ra 0,4 ml cho vào các ống nghiệm
khác nhau
Dung dch protein (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Dung dch C (ml) 2 2 2 2 2 2
Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng 5 phút
Thuc th Folin (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng 10 phút
Nưc ct (ml) 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4
o mt  quang  bưc sóng 500 nm
V  th biu din s bin thiên ca mt  quang (OD) theo nng  protein chun
(g/ml) vi trc tung là OD, trc hoành là nng  protein.

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme


- 19 -
Xác định hàm lượng protein trong mẫu
Bảng 6. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein trong mẫu dứa
Ống nghiệm số 0 1 2 3
Dung dch protein mu (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4
Dung dch C (ml) 2 2 2 2
Lc u và  yên  nhit  phòng 5 phút
Thuc th Folin (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2

Lc u và  yên  nhit  phòng 10 phút
Nưc ct (ml) 2,4 2,4 2,4 2,4
o mt  quang  bưc sóng 500 nm
sao cho giá tr OD nm trong khong 0,05 – 0,25
Tin hành thí nghim 2 ln. Kt qu là giá tr trung bình.
2.4. Tính kết quả
T ưng chun so sánh mt  quang ca ng nghim cha mu protein. T ó suy ra hàm
lưng protein ca nguyên liu là a (µg/ml)
Lưng protein (M) có trong 1 g nguyên liu ưc tính theo công thc:
ܯ =
ܽ × 10
ି3
× ܦ
݉

ሺ
݉݃݌ݎ݋ݐ݁݅݊/1݃
ሻ

Trong ó
a : hàm lưng protein (µg/ml dung dch)
D : h s pha loãng
m : khi lưng nguyên liu ly phân tích (g)