HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA NƠNG HỌC

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH
(Candidatus Liberibacter asiaticus)
TRÊN CÂY CĨ MÚI

Người thực hiện

: ĐỖ VĂN HỊA

Mã SV

: 632032

Lớp

: K63BVTVA

Người hướng dẫn

: PGS.TS. HÀ VIẾT CƯỜNG

Bộ môn

: BỆNH CÂY

HÀ NỘI – 2022

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong báo cáo này là hoàn toàn trung thực chưa được sử dụng, công bố trong
các báo cáo, luận văn, luận án và các cơng trình nghiên cứu khoa học trước đây.
Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn được sử dụng trong luận văn
đều được ghi nguồn gốc rõ ràng, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định.
Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 8 năm 2022
Sinh viên

Đỗ Văn Hòa

i


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp tơi đã được thầy cơ,
gia đình và bạn bè hướng dẫn rất tận tình chu đáo.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS. Hà
Viết Cường, người đã trực tiếp hường dẫn cho tôi về một số kỹ thuật trong bệnh
cây, giúp tôi cả về vật chất, kiến thức và tinh thần để tơi có thể hồn thành thật tốt
khóa luận tốt nghiệp của mình.
Khóa luận được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam và một số vùng trồng cây ăn quả có múi tại huyện Văn
Giang, tỉnh Hưng n. Tơi đã nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ Bộ môn Bệnh
cây khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Các chị kỹ thuật viên tại
trung tâm bệnh cây nhiệt đới trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi
xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đã dành cho tôi.

Chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị và các bạn trong nhóm khóa luận
nghiên cứu bệnh cây đã ln chia sẻ kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu và
giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần tơi trên mọi phương diện, để tơi hồn thành
tốt khóa luận này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 8 năm 2022
Sinh viên

Đỗ Văn Hòa

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Lời cảm ơn ......................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................... vi
Danh mục bảng ................................................................................................ vii
Danh mục hình .................................................................................................. ix
PHẦN 1.MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
1.1.

Đặt vấn đề .............................................................................................. 1

1.2.

Mục đích và yêu cầu ............................................................................... 3

1.2.1. Mục đích nghiên cứu .............................................................................. 3
1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu ................................................................................ 3

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 4
2.1.

Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước và ngồi nước .................... 4

2.1.1. Nghiên cứu trong nước. .......................................................................... 4
2.1.2. Nghiên cứu nước ngồi........................................................................... 6
2.2.

Tổng quan cây có múi. ........................................................................... 7

2.2.1. Cây có múi tại Hưng Yên ....................................................................... 7
2.3.

Thành phần bệnh chính gây hiện tượng vàng lá cây có múi .................... 8

2.3.1. Bệnh chảy gôm (Phytophthora citrophthora citrus) ................................. 8
2.3.2. Bệnh tàn lụi (Citrus tristeza closterovirus, CTV) .................................... 8
2.3.3. Bệnh thiếu kẽm (Zinc deficiency) ........................................................... 8
2.3.4. Bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter asiaticus) .................... 9
2.4.

Tổng quan về bệnh vàng lá gân xanh (HLB) .......................................... 9

2.4.1. Lịch sử và phân bố bệnh vàng lá gân xanh ............................................. 9
2.4.2. Tác nhân gây bệnh – Vi khuẩn Candidatus liberibacter (Ca.L) ............. 11
2.4.3. Triệu chứng, dấu hiệu bệnh .................................................................. 11
2.5.

HỆ THỐNG BIỂU HIỆN VÀ CÁC KĨ THUẬT DÙNG TRONG

NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 15

2.5.1. Hệ thống biểu hiện ............................................................................... 15
2.5.2. Hệ thống vector biểu hiện ..................................................................... 16
iii


2.5.3. Các kỹ thuật dung trong nghiên cứu ..................................................... 17
PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 22
3.1.

Thời gian và địa điểm ........................................................................... 22

3.2.

Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 22

3.2.1.

Sinh Phẩm ........................................................................................... 22

3.2.2. Các chất kháng sinh .............................................................................. 22
3.2.3. Hóa chất ............................................................................................... 22
3.2.4. Mơi trường ........................................................................................... 24
3.2.5. Các thiết bị máy chủ yếu ...................................................................... 24
3.3.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 24

3.4.


Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 25

3.4.1. Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh vàng lá greening và mức độ phổ biến
trên đồng ruộng .................................................................................... 25
3.4.2. Phương pháp tách chiết DNA và RNA tổng số bằng CTAB(Doyle,
1991) .................................................................................................... 26
3.4.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR. ........................................................... 27
3.4.4. Quy trình tinh chiết DNA bằng phương pháp NaOH(Wang, 1993) ...... 27
3.4.5. Điện di SDS - PAGE ............................................................................ 28
3.4.6. Phương pháp PTA- ELISA (Plate Trapped Antibody - Enzyme
Linked Immune Sorbent Assay)( Hà Viết Cường, (2020)) .................... 29
3.4.7. Phục hồi dòng vi khuẩn Rosetta............................................................ 30
3.4.8. Biế n na ̣p plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta bằng kĩ thuật xung
điện ....................................................................................................... 30
3.4.9. Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ .................................................... 30
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 32
4.1.

Tình hình bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi tại Văn Giang
(Hưng Yên) và văn chấn (Yên Bái) năm 2022 ...................................... 32

4.1.1. Tình hình bệnh vàng lá gân xanh tại Văn Giang (Hưng Yên) năm
2022 ..................................................................................................... 32
4.1.2. Tình hình bệnh vàng lá gân xanh tại Văn Chấn (Yên Bái) năm 2022 .... 33

iv


4.2.


Đánh giá khả năng chẩn đoán bệnh vành lá gân xanh bằng kỹ thuật
PCR ...................................................................................................... 34

4.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện vi khuẩn Ca.Las trong lá, thân, rễ của
cây cam bệnh sử dụng phương pháp chiết nhanh bằng NaOH .............. 35
4.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện vi khuẩn Ca.Las trong lá, thân, rễ của
cây cam bệnh sử dụng phương pháp chiết bằng CTAB......................... 37
4.3.

Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh bằng kĩ thuật PCR trên các mẫu
thu thập tại miền bắc 2022 .................................................................... 40

4.3.1. Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh bằng kỹ thuật PCR trên các mẫu
bưởi đầu dòng thu tại tỉnh Hải Dương năm 2022 .................................. 40
4.3.2. Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh bằng kỹ thuật PCR trên các mẫu
cam thu tại Yên Bái năm 2022 .............................................................. 44
4.3.3. Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh bằng kỹ thuật PCR trên các mẫu
cam thu tại Văn Giang (Hưng Yên) năm 2022 ...................................... 49
4.3.4. Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh bằng kỹ thuật PCR trên các mẫu
quýt Jeju thu tại Quỳ Hợp (Nghệ An) năm 2022 ................................... 52
4.4.

Lây nhiễm Ca.las từ cây cam sang cây dừa cạn và cà chua ................... 54

4.5.

Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn ca.las bằng kháng sinh trên cành
cam giâm ............................................................................................. 57


4.6.

Nghiên cứu tạo kháng huyết thanh thỏ chẩn đoán Ca.Las ..................... 60

4.6.1. Chuẩn bị kháng nguyên tái tổ hợp của Ca.Las ...................................... 61
4.6.2. Gây miễn dịch trên thỏ ......................................................................... 64
4.6.3. So sánh kháng huyết thanh thu được bằng kỹ thuật PTA-ELISA .......... 65
4.6.4. Đánh giá khả năng phát hiện Ca. Las bằng xử lý kháng nguyên với
Urea...................................................................................................... 69
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 72
5.1.

Kết luận ................................................................................................ 72

5.2.

Kiến nghị .............................................................................................. 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 74
Phụ lục………………………. ......................................................................... 99

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AP
APS
Ca. L
Ca. Las
Dream Taq MM

CTAB
CTV
DNA
E.coli
OMP
HLB
TPTG
OMP
Kb
kDa
PCR
RT - PCR
l
Ml
NPP
OD
ELISA
PTA - ELISA
LB
SDS-PAGE
TAE
TEMED
β-ME

Alkaline phosphate
Amonium persulfate
Candidatus Liberibacter
Candidatus Liberibacter aseaticus
Dream Taq Master Mix
Cetyltrimethylammonium bromide

Bệnh tàn lụi (Citrus tristeza closterovirus)
Deoxyribonucleic acid
Escherichia coli
Outer membrain protein
Huanglongbinh
Isopropyl – b, D – thiogalactoside
Outer membrain protein
Kilo base
Kilodalton
Polymerase Chain Reaction
Reverse Transcription - Polymerase Chain
Reaction
Microliter
Mililiter
Nitro Phenyl Phosphate
Optical density
Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay
Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay
Luria Bertani
Sodium dedecyl sulfate – polyacrylamide gel
electrophoresis
Tris acetate EDTA
Tetramethyl ethylenediamine
β - Mercaptoethanol

vi


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................ 26
Bảng 3.3. Thành phần các gel dung trong SDS – PAGE................................... 28
Bảng 4.1. Điều tra bệnh vàng lá gân xanh trên cây cam tại xã Liên Nghĩa
(Văn Giang – Hưng Yên) năm 2022 ..................................................... 33
Bảng 4.2. Điều tra bệnh vàng lá gân xanh trên cây cam tại Văn Chấn (Yên
Bái) năm 2022 ...................................................................................... 34
Bảng 4.3. PCR phát hiện vi khuẩn Ca. Las từ 3 loại mô cam (gân lá, thân, rễ)
được chiết nhanh bằng NaOH ............................................................... 36
Bảng 4.4. PCR phát hiện vi khuẩn Ca. Las từ 3 loại mô cam (gân lá, thân, rễ)
được chiết bằng CTAB ......................................................................... 38
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra PCR trên 23 mẫu bưởi đầu dòng làm vật liệu
chọn giống thu tại tại Hải Dương năm 2022 ......................................... 42
Bảng 4.6. PCR phát hiện Ca. Las trên 33 mẫu cam thu thập tại Văn Chấn
(Yên Bái) năm 2022 (kết hợp 2 lần PCR) ............................................. 45
.Bảng 4.7. PCR phát hiện Ca. Las trên 10 mẫu cam thu thập tại Văn Giang
(Hưng Yên) năm 2022 (kết hợp 2 lần PCR). ......................................... 50
Bảng 4.8. PCR phát hiện Ca. Las trên 5 mẫu quýt Jeju thu tại Quỳ Hợp (Nghệ
An) năm 2022 ....................................................................................... 53
Bảng 4.9. Kết quả lây nhiễm Ca. Las từ cây cam sang cây cà chua và cây dừa
cạn bằng dây tơ hồng ............................................................................ 56
Bảng 4.10. PCR phát hiện Ca. Las từ lá mới mọc trên cành giâm cam được
phun kháng sinh .................................................................................. 59
Bảng 4.11. Kết quả cảm ứng biểu hiện protein OMP-N và OMP-C bằng vi
khuẩn E. coli chủng Rosetta DE3 ........................................................ 62
Bảng 4.12. PTA-ELISA so sánh khả năng phát hiện Ca. Las của kháng huyết
thanh HLB-N năm 2021, 2022.............................................................. 66

vii



Bảng 4.13. PTA-ELISA so sánh khả năng phát hiện Ca. Las của kháng huyết
thanh HLB-C năm 2020, 2021, 2022 .................................................... 68
Bảng 4.14. Đánh giá ảnh hưởng của xử lý Urea đến khả năng phát hiện Ca.
Las của kháng huyết thanh HLB-N năm 2021 và năm 2022 ................. 70
Bảng 4.15. Đánh giá ảnh hưởng của xử lý Urea đến khả năng phát hiện Ca.
Las của kháng huyết thanh HLB-C năm 2021 và năm 2022 ................. 71

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Phân bố bệnh vàng lá gân xanh (HLB) trên Thế giới ........................ 10
Hình 2.2. Triệu chứng bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi do vi khuẩn Ca.Las
gây ra (Bové, 2006a; Kumar, 2018; Nehela & Killiny, 2020a) ................. 13
Hình 2.3. Vector rầy chổng cánh châu Á (Diaphorina citri) truyền bệnh vàng lá
gân xanh................................................................................................ 14
Hình 2.4. Cấu trúc vector pET 28a(+) .............................................................. 17
Hình 4.1. PCR phát hiện vi khuẩn Ca. Las từ 3 loại mô cam (gân lá, thân, rễ)
được chiết nhanh bằng NaOH. Phản ứng được thực hiện với cặp mồi
OMP-N5 và OMP-N3m. M: Generuler 1 kb DNA ladder (Thermo).
Các giếng L1, L2, L3: số thứ tự các mẫu lá; T1,T2,T3: số thứ tự các
mẫu thân; R1, R2, R3: Số thứ tự các mẫu rễ. .......................................... 37
Hình 4.2. PCR phát hiện vi khuẩn Ca. Las từ 3 loại mô cam (gân lá, thân, rễ)
được chiết bằng CTAB. Phản ứng được thực hiện với cặp mồi OMPN5 và OMP-N3m. M: Generuler 1 kb DNA ladder (Thermo). Các
giếng L1, L2, L3: số thứ tự các mẫu lá; T1,T2,T3: số thứ tự các mẫu
thân; R1, R2, R3: Số thứ tự các mẫu rễ ................................................. 39
Hình 4.3. PCR trên 23 mẫu bưởi đầu dòng làm vật liệu chọn giống thu tại tại
Hải Dương năm 2022. Phản ứng PCR với cặp mồi OMP-N5 và
OMP-N3m. DNA được chiết từ gân lá tươi bằng phương pháp
CTAB. Phản ứng PCR được thực hiện ngày 16/3/2022. M: Generuler

1 kb DNA ladder (Thermo). +Ve: Đối chứng dương (cam bệnh). 1 –
23: số thứ tự các mẫu như ở Bảng 4.5. .................................................. 43
Hình 4.4. Kiểm tra băng PCR không đặc hiệu của mẫu bưởi 15. Sản phẩm
PCR của mẫu đối chứng dương +ve (Hình 4.3) được hịa lỗng 10
lần với nước. Thời gian điện di tăng lên 40 phút. M: Generuler 1 kb
DNA ladder (Thermo). ........................................................................ 43

ix


Hình 4.5. Triệu chứng của một số mẫu bưởi đầu dòng thu tại Hải Dương năm
2022. Một số mẫu như 1, 3, 18, 22 có triệu chứng vàng lá, lá nhăn
nheo hoặc biến dạng. ............................................................................ 44
Hình 4.6. PCR (mồi OMP-N5/OMP-N3m) phát hiện Ca. Las trên 33 mẫu
cam thu tại Yên Bái năm 2022 với DNA được chiết bằng CTAB.
Generuler 1 kb DNA ladder (Thermo). +Ve: Đối chứng (+). Các số
thứ tự tương ứng bảng 4.6. .................................................................. 47
Hình 4.7. PCR (mồi OMP-N5/OMP-N3m) phát hiện Ca. Las trên 23 mẫu cam
thu tại Yên Bái năm 2022 với DNA được chiết bằng NaOH. M:
Generuler 1 kb DNA ladder (Thermo). +Ve: Đối chứng (+). Các số thứ
tự tương ứng Bảng 4.6 ........................................................................... 48
Hình 4.8. Triệu chứng trên lá của các mẫu cam thu tại Văn Chấn ( Yên Bái)
năm 2022. ............................................................................................. 49
Hình 4.9. Băng điện di sản phẩm DNA của 10 mẫu thu thập tại Văn Giang
đã chiết DNA bằng CTAB. M: Marker, + Ve: Đối chứng, VG1 –
VG10: số thứ tự các mẫu. ..................................................................... 51
Hình 4.10. Băng điện di sản phẩm DNA của 2 mẫu cam thu thập tại Văn Giang
đã chiết DNA bằng NaOH. M: Marker, + Ve: Đối chứng, VG01, VG09:
số thứ tự các mẫu. ................................................................................. 51
Hình 4.11. Triệu chứng trên lá của các mẫu thu thập tại Văn Giang (Các mẫu

từ 01- 10) .............................................................................................. 52
Hình 4.12. Băng điện di sản phẩm PCR của 5 mẫu quýt Jeju thu thập tại Quỳ
Hợp Nghệ An năm 2022. M: Marker, + Ve: Đối chứng, NA13,
NA14,NA15,NA16,NA17: số thứ tự các mẫu. ...................................... 53
Hình 4.13. PCR phát hiện Ca. Las trên tơ hồng và trên cây dừa cạn và cà
chua lây nhiễm. DNA được chiết bằng CTAB. PCR được thực hiện
với mồi OMP-N5/OMP-N3m. M: Marker, +ve: đối chứng dương
(cam bệnh). cc1,cc2: cà chua; Dc1,Dc2: dừa cạn .................................. 56

x


Hình 4.14. Lây nhiễm Ca. Las từ cây cam sang cây dừa cạn bằng dây tơ
hồng. ĐC: Đối chứng âm, 1,2: số thứ tự các cây dừa cạn lây nhiễm ..... 57
Hình 4.15. Lây nhiễm Ca. Las từ cây cam sang cây cà chua bằng dây tơ hồng.
ĐC: Đối chứng âm, 1,2: số thứ tự các cây cà chua lây nhiễm. .............. 57
Hình 4.16. PCR phát hiện Ca. Las từ lá mới mọc trên cành giâm cam được
phun kháng sinh. M: Maker; ĐC 1, ĐC 2: đối chứng không phun;
S1, S2,S3,S4,S5,S6 : Streptomycin+ silwet 408; A1,A2,A3,A4,A5:
Ampicilin + silwet 408 ......................................................................... 60
Hình 4.17. Thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế Ca. Las trên cành giâm cam
bằng phun kháng sinh ampicillin, streptomycin kết hợp chất hoạt
động silwet 408 .................................................................................... 60
Hình 4.18. Cảm ứng biểu hiện 2 protein OMP-N và OMP-C từ 2 dòng vi
khuẩn Rosetta DE3 mang cấu trúc biểu hiện. Các dịng vi khuẩn được
ni cấy trên mơi trường tự cảm ứng ZYM5052. ................................. 63
Hình 4.19. Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra phân đoạn tinh chiết các
protein tái tổ hợp. Kích thước sản phẩm mong đợi OMP-N 38,08
kDa, OMP-C: 42,17 kDa (Chú ý hình điện di cũng chứa protein CP
của CTV) .............................................................................................. 63

Hình 4.20. Thu hoạch kháng huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với protein
OMP-N và OMP-C. Các kháng huyết thanh được ký hiệu là HLB-C
và HLB-N ............................................................................................. 64

xi


TĨM TẮT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên khóa luận: Nghiên cứu bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter
asiaticus) trên cây có múi
Người thực hiện: Đỗ Văn Hòa
Mã sinh viên: 632032
Lớp: K63BVTVA - Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. HÀ VIẾT CƯỜNG
Bộ mơn: Bệnh cây
Mục đích nghiên cứu:
Điều tra bệnh vàng lá gân xanh trên các cây có múi tại khu vực Hưng Yên
(đại diện vùng đồng bằng Sông Hồng) và Yên Bái (đại diện vùng Đông Bắc).
Đánh giá loại mô cây và phương pháp chiết DNA phù hợp để chẩn đoán vi
khuẩn Ca. Las bằng PCR.
Phát hiện vi khuẩn Ca. Las trên các mẫu cây có múi thu thập được tại các
tỉnh miền Bắc bằng PCR.
Thử nghiệm lây nhiễm vi khuẩn Ca. Las từ cây cam sang cà chua và dừa cạn
bằng tơ hồng.
Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh thỏ từ nguồn protein tái tổ hợp biểu hiện
trong vi khuẩn E. coli và cải thiện khả năng phát hiện vi khuẩn Ca. Las từ các
nguồn kháng huyết thanh tạo được.
Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh vàng lá greening và mức độ phổ biến trên
đồng ruộng

Phương pháp tách chiết DNA và RNA tổng số bằng CTAB(Doyle, 1991)
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR.
xii


Quy trình tinh chiết DNA bằng phương pháp NaOH(Wang, 1993)
Điện di SDS - PAGE
Phương pháp PTA- ELISA (Plate Trapped Antibody - Enzyme Linked
Immune Sorbent Assay)(Hà Viết Cường (2020))
Phục hồi dòng vi khuẩn Rosetta
Biế n nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta bằng kĩ thuật xung điện
Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ
Kết quả nghiên cứu:
1. Điều tra bệnh vàng lá gân xanh dựa trên cây có múi, chủ yếu là cam, dựa

vào triệu chứng tại Văn Giang – Hưng Yên (đại diện vùng Đồng Bằng Sông Hồng)
và Văn Chấn - Yên Bái (đại diện vùng Đông Bắc) năm 2022 thấy bệnh rất phổ
biến tại 2 địa điểm. Tất cả các vườn điều tra (5 vườn tại Văn Giang, 11 vườn tại
Văn Chấn) đều nhiễm bệnh. Mức độ nhiễm bệnh tại 2 địa điểm cũng rất cao, trung
bình 58.4 % tại Văn Giang và 83.4 tại Văn Chấn.
2. Đánh giá loại mô và phương pháp chiết DNA cho chẩn đốn bệnh vàng

lá gân xanh cho thấy mơ gân lá phù hợp hơn mô vỏ thân và mô rễ. Phương pháp
chiết nhanh DNA từ mơ cây có múi bằng NaOH phù hợp để chẩn đốn bệnh.
Phương pháp có ưu điểm nhanh, giảm thiểu nhiễm chéo giữa các mẫu.
3. Kiểm tra PCR trên 23 mẫu bưởi đầu dịng (phần lớn khơng biểu hiện

triệu chứng) thu tại Hải Dương năm 2022 cho thấy tất cả các mẫu đều không
nhiễm vi khuẩn Ca. Las. Kiểm tra PCR trên 10 mẫu cây cam biểu hiện triệu chứng
thu tại Văn Giang (Hưng Yên) năm 2022 cho thấy có tới 9/10 mẫu bị nhiễm vi

khuẩn Ca. Las. Kiểm tra PCR trên 33 mẫu cây cam, quýt biểu hiện triệu chứng
thu tại Văn Chấn (Yên Bái) năm 2022 cho thấy có tới 21/33 (63 %) mẫu bị nhiễm
vi khuẩn Ca. Las. Cuối cùng kiểm tra PCR trên 5 mẫu quýt JeJu thu tại Quỳ Hợp
(Nghệ An) năm 2022 cho thấy 3/5 mẫu bị nhiễm vi khuẩn Ca. Las.
4. Thí nghiệm đánh giá khả năng phịng chống vi khuẩn Ca. Las bằng kháng

xiii


sinh với hỗ trợ của chất hoạt động bề mặt cho thấy chất hoạt động bề mặt Silwett
408 không vận chuyển đủ 2 kháng sinh ampicillin và Streptomycin qua bề mặt
cành cam qua 1 lần phun.
5. Thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn Ca. Las từ cam sang cà chua và dừa cạm

bằng tơ hồng cho thấy tơ hồng có thể tiếp nhận dễ dàng và hiệu quả vi khuẩn
nhưng không truyền được vi khuẩn sang cà chua và dừa cạn.
6. Đã sản xuất tạo được kháng huyết thanh thỏ từ 2 nguồn protein tái tổ

hợp là protein OMP-N và OMP-C. Sử dụng qui trình PTA-ELISA thơng thường
cho thấy trừ kháng huyết thanh HLB-C (tạo ra năm 2021) thì tất cả các kháng
huyết thanh thỏ được tạo ra năm 2020, 2021 và 2022 đều không phản ứng với cây
khỏe nhưng cũng không phát hiện được Ca. Las trên cây bệnh.
7. Đáng chú ý, xử lý kháng nguyên sau khi cố định vào bản ELISA bằng

Urea 8M đã cải thiện đáng kể khả năng phát hiện Ca. Las của kháng huyết thanh
HLB-N được tạo ra năm 2021. Kháng huyết thanh không phản ứng với dịch cây
cam, bưởi và chanh khỏe nhưng có phản ứng rõ rệt với dịch cây cam bệnh.

xiv



PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Tầm quan trọng của cây có múi tại Việt Nam. Cây ăn quả có múi gồm
cam, quýt, bưởi, chanh, là một trong những cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng và
kinh tế cao đã và đang được ưu tiên trồng và phát triển trên nhiều nước trên thế
giới. Ở Vệt Nam cây ăn quả có múi được trồng rộng khắp các tỉnh thành trên
cả nước, từ trung du, miền núi phía Bắc đến đồng bằng sông Hồng, sông Cửu
Long .Theo trung tâm khuyến nơng quốc gia, những năm gần đây, diện tích và
sản lượng cây có múi (cam, quýt, bưởi) của cả nước tăng khá nhanh. Từ năm
2013 đến nay diện tích cây cam tăng đáng kể, từ 53.800ha lên đến 90.700 ha.
Từ năm 2008 - 2017, diện tích bưởi tăng từ 43.500 ha lên đến 74.200 ha và diện
tích quýt tăng từ 7.400 ha lên đến gần 22.000 ha .Năm 2017, tổng diện tích cây
có múi (cam, qt, bưởi) của cả nước là 186.800 ha. Xu hướng vẫn còn tiếp tục
tăng, đến hết tháng 9/2018 đạt trên 192.000 ha. Ở mỗi vùng cam, quýt đều có
những giống đặc sản như cam Canh, bưởi Diễn của Hưng Yên, cam Sành của
Hà Giang, Tuyên Quang , quýt đỏ Bắc Quang, Hà Giang, bưởi Đoan Hùng –
Phú Thọ, cam Xã Đoài Nghệ An, bưởi Năm Roi, Da Xanh của đồng bằng sông
Cửu Long…
Cây ăn quả có múi là sản phẩm chủ lực của tỉnh Hưng n, năm 2021,
tồn tỉnh có khoảng 4.250 ha cây ăn quả có múi, sản lượng ước tính 65.000 tấn;
trong đó diện tích trồng cây cam, quýt trên 2.100 ha; bưởi trên 2000 ha; cịn lại
là cây có múi khác như chanh, quất . . . Tồn tỉnh đã có 28 vườn cây có múi
(cam, bưởi) được chứng nhận đạt tiêu chuẩn vườn cây có múi đầu dịng, mỗi
năm có khai thác khoảng 60 vạn mắt ghép phục vụ nhu cầu nhân giống, phát
triển trồng mới của nông dân trong và ngồi tỉnh. Đến hết tháng 9/2021, tồn
tỉnh đã có 65 vùng sản xuất cây ăn quả có múi (cam, quýt, bưởi) với tổng diện
tích trên 1000 ha, sản lượng khoảng trên 20.000 tấn quả tươi được chứng nhận
tiêu chuẩn VietGap.
1



Trong vài năm trở lại đây, hiện tượng cây cam bị bệnh “vàng lá, chết
cây” đã gây quan ngại cho sản xuất cam ở Hưng n. Chẩn đốn các bệnh
có triệu chứng như vàng lá, thối gốc rễ, chết cây thường rất khó do nhiều tác
nhân gây bệnh, kể cả các yếu tố dinh dưỡng, thổ những có thể gây ra các
triệu chứng trên. Tại Việt Nam, các tác nhân gây bệnh gồm vi khuẩn
Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca. Las), Citrus tristeza virus (CTV),
Phytophthora spp., nấm Fusarium spp., tuyến trùng Meloidogyne spp., đã
được xác định trên cây có múi khắp cả nước.
Bệnh Vàng lá gân xanh (tên tiếng Anh là Huanglongbinh hay cũ hơn là
Greening) do vi khuẩn biệt dưỡng Ca. Las gây ra, là bệnh nguy hiểm nhất trên
cây có múi tại châu Á, đặc biệt trên cây cam. Tương tự, tại Việt Nam, khắp cả
nước, bệnh là một trong các nguyên nhân chính cản trở việc phát triển sản xuất
cây có múi. Cây bị bệnh vàng lá gân xanh sinh trưởng rất còi cọc; bộ lá, đặc
biệt là lá non, bị biến vàng; quả nhỏ, lệch, bị biến vàng phần cuống trước khi
chín, khơng có giá trị sử dụng. Tác nhân gây bệnh, Ca.Las, thuộc nhóm vi khuẩn
biệt dưỡng nên không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo. Vi khuẩn
lan truyền ngoài tự nhiên qua ghép và rầy chổng cánh (Diaphorina citri). Các
chiến lược quản lý bệnh chủ yếu trên thế giới dựa vào (i) sử dụng vật liệu giống
sạch bệnh, (ii) loại bỏ sớm cây bệnh, (iii) phòng chống vector và (iv) tạo giống
kháng bệnh.
Do tầm quan trọng của cây cam, mục tiêu của nghiên cứu này nhằm phát
hiện sự có mặt và mức độ nhiễm của tác nhân gây bệnh quan trọng, Ca. Las,
trên cam tại một số vùng trồng cam chính.
Đề tài “ Nghiên cứu bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter
asiaticus) trên cây có múi ” được thực hiện để nhằm mục đích xác định được
mức độ nhiễm bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi tại Hưng yên và một số
tỉnh khác nhằm đánh giá được khả năng sử dụng kháng thể chẩn đoán bệnh
vàng lá gân xanh. Đánh giá khả năng phát hiện Ca.Las trên cây có múi bằng

kháng thể thỏ thu được. Hiện nay Việt Nam chưa có kháng thể nên có được
2


kháng thể chẩn đốn là quan trọng.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá được hiện trạng nhiễm bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi tại
miền Bắc bằng điều tra thực địa và kiểm tra PCR. Đánh giá được biện pháp chẩn
đoán vi khuẩn Ca. Las bằng PCR và ELISA dựa trên kháng huyết thanh thỏ tạo
được.
1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu
1. Điều tra bệnh vàng lá gân xanh trên các cây có múi tại khu vực Hưng
Yên (đại diện vùng đồng bằng Sông Hồng) và Yên Bái (đại diện vùng Đông
Bắc).
2. Đánh giá loại mô cây và phương pháp chiết DNA phù hợp để chẩn
đoán vi khuẩn Ca. Las bằng PCR.
3. Phát hiện vi khuẩn Ca. Las trên các mẫu cây có múi thu thập được
tại các tỉnh miền Bắc bằng PCR.
4. Thử nghiệm lây nhiễm vi khuẩn Ca. Las từ cây cam sang cà chua và
dừa cạn bằng tơ hồng.
5. Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh thỏ từ nguồn protein tái tổ hợp
biểu hiện trong vi khuẩn E. coli và cải thiện khả năng phát hiện vi khuẩn Ca.
Las từ các nguồn kháng huyết thanh tạo được.

3


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

2.1.1. Nghiên cứu trong nước.
Ở Việt Nam bệnh vàng lá Greening (vàng lá cam chanh, HLB) được ghi
nhận từ những năm 1960. Nhiều tác giả đã cho rằng bệnh có thể lây lan từ
Quảng Đông (Trung Quốc) vào Việt Nam. Bệnh vàng lá gân xanh là bệnh hại
nguy hiểm, đã xuất hiện từ lâu song nghiên cứu về bệnh chưa nhiều, mới chỉ
tập trung vào sản xuất cây giống sạch bệnh. Kết quả điều tra năm 1990 – 1994
do Viện Bảo vệ thực vật tiến hành cho thấy bệnh gây hại cây có múi (cam, quýt,
bưởi, chanh) ở tất cả các vùng miền với tỷ lệ cây bị bệnh từ 16,7 – 100%. Mức
độ bị bệnh tùy thuộc vào điều kiện canh tác, phương pháp nhân giống và kỹ
thuật phòng trừ sâu bệnh, các vùng trồng cam quýt bị bệnh từ 54,2 – 82,5% .
Bệnh vàng lá gân xanh gây hại trên cam, quýt nặng hơn trên bưởi. Trên cam
quýt tại Tuyên Quang tỷ lệ bị nhiễm bệnh vàng lá gân xanh là 60%, Hà Giang
63%, Hịa Bình 54%, Nghệ An 65%. Trên Bưởi tỷ lệ ở các tỉnh là Hà Nội 18%,
Phú Thọ (20%), Hà Tây cũ (15%), Hịa Bình (17%) và Hà Tĩnh (25%) .
Điều tra phân bố và mức độ gây hại của bệnh vàng lá gân xanh ở miền
Bắc Việt Nam vào những năm 1990 – 1991 cho thấy bệnh lan truyền và nhiễm
trên hầu hết các vùng trồng cam, quýt và gây hại ở mọi lứa tuổi của cây, làm
giảm Các vùng trồng cây ăn quả có múi chính ở phía Bắc Việt Nam bị nhiễm
bệnh vàng lá gân xanh với tỷ lệ bệnh 10,49 - 50,93%. Bệnh vàng lá gân xanh
thường phát sinh cùng các bệnh virus. Trong tổng số mẫu dương tính với bệnh
vàng lá gân xanh có 58,33 - 73,33% mẫu hỗn hợp cùng bệnh tristeza với triệu
chứng sưng nổ gân lá, cây thấp lùn, vàng lá gân trong và 35,07% mẫu bị nhiễm
cùng với các bệnh tristeza, tatter leaf, bệnh exocortis tuổi thọ, năng suất và chất
lượng quả.
Theo( Trang Kiên Bush, 2019), ở vùng nhiệt đới triệu chứng bệnh vàng
lá gân xanh xuất hiện quanh năm trên lá. Phiến lá bị đổi mầu từng phần, lá lốm
4


đốm xanh vàng, gân xanh, lá vàng, cong giống như triệu chứng thiếu kẽm. Bệnh

không ảnh hưởng tới mô gỗ nhưng ảnh hưởng đến mô libe, sự vận chuyển
đường ở diệp lục và nhu mô đến các phần trên cây bị bệnh. Cành có thể bị khơ,
chết. Triệu chứng lốm đốm được cho là một triệu chứng điển hình, sau đó lá
chuyển sang màu vàng rõ rệt. Cây bị bệnh thường cho trái méo mó. Khi cây bị
nhiễm bệnh vàng lá gân xanh lá ở một số cành chuyển sang màu vàng và cuối
cùng cây sẽ bị chết trong một vài năm, khi lá cây bệnh chuyển màu vàng cành
cây bệnh bị chết khô. Theo ( Trang Kiên Bush, 2019), khi cây cam sành bị bệnh
vàng lá gân xanh thì các hàm lượng trong cây bị giảm theo (Kẽm là 77,13%;
Canxi là 28,91%); nhưng hàm lượng Na, Fe và Al lại tăng cao. Quả bị bệnh
giảm trọng lượng 52,29%, độ Brix giảm 1,54%, tương tự ở quýt đường giảm
theo là 66,93 và 0,04%.
Theo Hà Minh Trung (1995) cho rằng: Sự lan truyền bệnh qua ghép và
qua côn trùng môi giới. Một cá thể rầy mang nguồn bệnh chích hút trên cây
quýt Ponkan 3 ngày đã truyền được bệnh với tỷ lệ 3/10 cây bị bệnh. Với 10 cá
thể rầy trên cây sau lây nhiễm và tỷ lệ cây bị bệnh là 5/10 cây, nếu 20 rầy tỷ lệ
nhiễm là 6/10 cây. Triệu chứng đều biểu hiện sau lây nhiễm ở tháng thứ 6 và
bảy. Đối với gốc ghép đã sử dụng 4 loại gốc ghép khác nhau gồm: C.
volkameriana; C. jambhini; C. taiwanica và Chấp. Tất cả các loài gốc ghép
trên đều bị nhiễm bệnh ở các dạng triệu chứng khác nhau.
Theo Lê Mai Nhất (2014), bệnh vàng lá gân xanh nhanh biểu hiện triệu
chứng trên cam Xã Đoài, cam Canh sau 45 ngày ghép lây bệnh nhân tạo. Mật
độ rầy chổng cánh là 6 con/cây hoặc 9 con/cây tiếp xúc trong 24 giờ, triệu
chứng bệnh (tương ứng) chỉ xuất hiện sau 9 tháng và 6 tháng lây nhiễm trên
giống cam Xã Đoài và cam Canh. Bằng phản ứng của mẫu bệnh vàng lá gân
xanh với cây chỉ thị và một số chủng loại cây ăn quả (cam, quýt, bưởi, quất)
kết hợp với kỹ thuật duplex-PCR đã xác định được vi khuẩn gây bệnh vàng lá
gân xanh ở phía Bắc thuộc chủng I và II. Chủng II lần đầu tiên ghi nhận ở một
số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Tại Hà Nội, Bắc Giang, Hà Giang, Nghệ An và Hòa
5



Bình có tỷ lệ mẫu nhiễm chủng I cao hơn tỷ lệ mẫu nhiễm chủng II (tương ứng
là 53,84 - 66,67% và 33,33 - 46,16%). Ở Hưng Yên và Thừa Thiên Huế có tỷ
lệ mẫu nhiễm chủng I là 33,33 - 40%, thấp hơn tỷ lệ mẫu nhiễm chủng II (60 66,67%). Tại Quảng Ninh tỷ lệ mẫu nhiễm hai chủng ngang nhau.
2.1.2. Nghiên cứu nước ngoài
(Garnier & Bové, 1983), đề xuất kỹ thuật quan sát trực tiếp vi khuẩn gây
bệnh Greening như sau: Cắt nhỏ gân lá bị bệnh có triệu chứng lốm đốm thành
từng mảnh nhỏ khoảng 1mm, cố định với 4% glutaldehyde trong chất đệm
0,1M caccodylate (Phosphate), pH 7,5% trong 6 giờ. Với cùng loại chất đệm
trên nhúng 3 lần, sau đó cố định với 1% osmium tetroxide SO4 trong cùng chất
đệm rồi dùng máy cắt vi mẫu nhỏ để cắt mẫu nhuộm với citrate và quan sát
dưới kính hiển vi điện tử. Các nghiên cứu gần đây đã phát triển được kháng thể
đơn dòng và sản xuất được các probe DNA, phương pháp chẩn đoán và giám
định indexing nhanh chóng và chính xác.
Những nghiên cứu của (Tirtawidjaja, 1981), cho thấy bệnh Greening
không truyền qua hạt giống, cây được gieo từ hạt lấy từ quả của cây bị bệnh
không biểu hiện triệu chứng, tuy nhiên trong số những cây này có một số cây
có hiện tượng vàng lá và cây còi cọc do sức sống của hạt kém.
Năm 1992 kính hiển vi đa được sử dụng rộng rãi trong các thí nghiệm
quan sát và phân biệt các tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, theo Garnier và Bové,
1996 chủng HLB châu Á và Châu Phi không thể phân biệt được khi quan sát
dưới kính hiển vi điện tử.
Hiện nay, 3 loài vi khuẩn gây bệnh VLGX đã được xác định trên thế giới
(Bové, 2006a) gồm:
1. Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca.Las): có mặt ở châu Á, châu
Mỹ, truyền bằng rầy chổng cánh (Diaphorina citri)
2. Candidatus Liberibacter africanus: Có mặt ở châu Phi, truyền bằng
rầy Trioza erytreae)
3. Candidatus Liberibacter americanus: Mới được phát hiện tại Brasil
6



và cũng truyền bằng rầy chổng cánh D. citri.
Các loài Candidatus Liberibacter spp. đều là các vi khuẩn biệt dưỡng (tức
là không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo) và thuộc nhóm khu trú
trong nguyên tố rây của mạch phloem (Bové, 2006a; Nehela & Killiny, 2020a)
2.2. TỔNG QUAN CÂY CĨ MÚI.
Thành phần cây có múi gồm cam, qt, bưởi, chanh,.. là một trong những
cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao đã và đang được ưu tiên trồng
và phát triển ở Việt Nam. Ở Vệt Nam cây ăn quả có múi được trồng rộng khắp
các tỉnh thành trên cả nước, từ trung du, miền núi phía Bắc đến đồng bằng sơng
Hồng, sơng Cửu Long .Theo trung tâm khuyến nông quốc gia, những năm gần
đây, diện tích và sản lượng cây có múi (cam, qt, bưởi) của cả nước tăng khá
nhanh. Từ năm 2013 đến nay diện tích cây cam tăng đáng kể, từ 53.800ha lên
đến 90.700 ha. Từ năm 2008 - 2017, diện tích bưởi tăng từ 43.500 ha lên đến
74.200 ha và diện tích quýt tăng từ 7.400 ha lên đến gần 22.000 ha .Năm 2017,
tổng diện tích cây có múi (cam, qt, bưởi) của cả nước là 186.800 ha. Xu
hướng vẫn còn tiếp tục tăng, đến hết tháng 9/2018 đạt trên 192.000 ha.
2.2.1. Cây có múi tại Hưng Yên
Thành phần cây có múi gồm cam, quất, bưởi, chanh,.. là một trong những
cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao đã và đang được ưu tiên trồng
và phát triển tại nhiều địa phương trong tỉnh Hưng Yên.Cây ăn quả có múi là
sản phẩm chủ lực của tỉnh Hưng Yên, năm 2021, tồn tỉnh có khoảng 4.250 ha
cây ăn quả có múi, sản lượng ước tính 65.000 tấn; trong đó diện tích trồng cây
cam, quýt trên 2.100 ha; bưởi trên 2000 ha; cịn lại là cây có múi khác như
chanh, quất . . . Tồn tỉnh đã có 28 vườn cây có múi (cam, bưởi) được chứng
nhận đạt tiêu chuẩn vườn cây có múi đầu dịng, mỗi năm có khai thác khoảng
60 vạn mắt ghép phục vụ nhu cầu nhân giống, phát triển trồng mới của nơng
dân trong và ngồi tỉnh. Đến hết tháng 9/2021, tồn tỉnh đã có 65 vùng sản xuất
cây ăn quả có múi (cam, quýt, bưởi) với tổng diện tích trên 1000 ha, sản lượng

khoảng trên 20.000 tấn quả tươi được chứng nhận tiêu chuẩn VietGap.
7


2.3. Thành phần bệnh chính gây hiện tượng vàng lá cây có múi
2.3.1. Bệnh chảy gơm (Phytophthora citrophthora citrus)
Triệu chứng: Ở phần gốc có những vết nhũn nước, nhựa chảy ra, lúc đầu
có màu vàng, sau đó khơ cứng lại có màu nâu. Vết bệnh sau cùng khơ và nứt,
ngay vết bệnh vỏ trong bong ra. Bệnh có thể phát triển nhanh vịng quanh thân
hoặc rễ chính làm lá bị vàng, nhất là gân lá, kế đó lá rụng, bệnh nặng lá trên
cành rụng gần hết, cành khô chết.
Đặc điểm gây hại: Bệnh do nấm Phythopthora spp. gây ra, phát triển
nhiều trong điều kiện thời tiết nóng và mưa nhiều, vườn cây rậm rạp nhất là
chùm quả khuất trong tán lá, nơi có vết cắn phá của cơn trùng trên quả cũng
khiến nấm bệnh dễ dàng xâm nhập và phát triển. Bệnh gây hại nặng vào mùa
mưa, đặc biệt là những vườn canh tác lâu năm, thường xuyên bị ngập úng, điều
kiện vệ sinh vườn kém, mật độ trồng dày ít được bón phân hữu cơ.
2.3.2. Bệnh tàn lụi (Citrus tristeza closterovirus, CTV)
Triệu chứng: Triệu chứng bệnh xuất hiện khác nhau trên cây có múi tuỳ
theo giống, dịng virus nhiễm, tiêu biểu nhất là gây gân trong, sưng gân, vàng
lá, cây bị lùn, cả thân và nhánh cây bị lõm nặng khi bóc vỏ khỏi thân. Từ đó,
làm giảm năng suất và kích thước trái, cành trở nên giịn và dễ gãy. Khi cây ra
trái đạt kích thước bằng trái pingpong thì bị vàng từ phần đít lên cuống trái, trái
rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng cho nhà vườn.
Đặc điểm gây hại: Virus gây bệnh là Closterovirus có dạng sợi dài với
kích thước 11 x 2.000 µm. Rệp muội là mơi giới truyền bệnh tàn lụi trên cây
có múi. Virus khơng truyền qua cơ giới nhưng có thể truyền qua chiết ghép.
2.3.3. Bệnh thiếu kẽm (Zinc deficiency)
Triệu chứng tác hại do thiếu kẽm trên cây có múi
Triệu chứng thiếu kẽm là lá vàng gân vẫn xanh. Đây là một trong những

tổn hại lớn và phổ biến về rối loạn dinh dưỡng của cây có múi, lá nhỏ dần và
đóng lá dầy, có khuynh hướng mọc thẳng đứng, thân, cành không phát triển,
cành non dễ chết, trái nhỏ, chất lượng kém.
8


Triệu chứng vàng lá gân xanh do thiếu kẽm trên cây có múi. Ngay trong
giai đoạn đầu tiên, thiếu kẽm sẽ làm giảm năng suất, giảm sinh lực cây và làm
cho trái nhỏ, chất lượng kém. Triệu chứng lá nhỏ, lá hẹp (ít lá) và màu trắngvàng khu vực giữa các tĩnh mạch (đốm lá).
2.3.4. Bệnh vàng lá gân xanh (Candidatus Liberibacter asiaticus)
 Triệu chứng gây hại
Vi khuẩn Ca.Las gây một loạt các triệu chứng khác nhau, dễ bị nhầm sang
các triệu chứng liên quan đến dinh dưỡng(Bové, 2006b; Nehela & Killiny,
2020b)
 Nguyên nhân
Hiện nay, 3 loài vi khuẩn gây bệnh VLGX đã được xác định trên thế giới
(Bové, 2006b) gồm:
- Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca.Las): có mặt ở châu Á, châu
Mỹ, truyền bằng rầy chổng cánh (Diaphorina citri)
- Candidatus Liberibacter africanus: Có mặt ở châu Phi, truyền bằng
rầy Trioza erytreae)
- Candidatus Liberibacter americanus: Mới được phát hiện tại Brasil
và cũng truyền bằng rầy chổng cánh D. citri.
Các loài Candidatus Liberibacter spp. đều là các vi khuẩn biệt dưỡng
(tức là không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo) và thuộc nhóm khu
trú trong nguyên tố rây của mạch phloem(Bové, 2006b; Nehela & Killiny,
2020b).
2.4. Tổng quan về bệnh vàng lá gân xanh (HLB)
2.4.1. Lịch sử và phân bố bệnh vàng lá gân xanh
Bệnh vàng lá gân xanh được ghi nhận đầu tiên ở đông nam Trung Quốc vào

năm 1919. Vào năm 1921, theo một số báo cáo bệnh xuất hiện tại philipin nhưng bị
nhầm lẫn với triệu chứng thiếu kẽm. Tại miền nam châu Phi bệnh xuất hiện dưới
nhiều tên gọi khác nhau như chổi vàng (Yellow shoot) hay Greening và vào năm
1937 lần đầu tiên HLB được mô tả và tính độc và giả thiết cơ chế gây bệnh.Từ năm
9


1941 – 1955 các nghiên cứu về HLB được tiến hành mở rộng ở đông nam Trung
Quốc. Năm 1960 bệnh xuất hiện lần đầu tiên tại Thái Lan. Năm 1965, một số nghiên
cứu chỉ ra rằng bệnh được truyền qua gốc ghép và bời 1 loài rầy châu Phi (Trioza
erytreae) gây hại trên họ cây có múi. Tại Philipin và Ấn Độ vào năm 1966 , một số
nhà nghiên cứu nhận thấy rằng có sự giống nhau giữa các triệu chứng là lốm đốm
và bệnh gây chết cây có múi do HLB ở Đài Loan, Trung Quốc và bệnh vàng lá ở
Châu Phi. Các nhà khoa học ở Philipin đã chứng minh rằng lá lốm đốm (mottle
leaf) và gây chết cây có múi (citrus dieback) được truyền bở rầy chổng cánh châu
Á (Diaphorina citri).Năm 1998, rầy chổng cánh châu Á xuất hiện tại Florida, Mỹ.
Bệnh xuất hiện tại Brazil vào năm 2004. Năm 2005, bệnh được ghi nhận tại
Florid(Bové, 2006b).
Hiện nay bệnh đã được ghi nhận ở hơn 40 quốc gia trên toàn Thế giới trải
dài từ châu Á, châu Phi châu Mỹ. Tác nhân gây bệnh được tìm ra là 1vi khuẩn
chứ không phải là virus như nhận định ban đầu, đây là lồi vi khuẩn gram âm,
khơng ni cây được trong môi trường nhân tạo, truyền qua vector. Bệnh gây
ra các triệu chứng ở mức độ nặng, nhẹ khác nhau ở các khu vực khác nhau, do
đó có những tên gọi khác nhau như: “Greening” ở Nam Phi, “Mottle leaf” tại
Philipin hay “Dieback citrus” ở Ấn Độ.

Hình 2.1. Phân bố bệnh vàng lá gân xanh (HLB) trên Thế giới
(Nguồn: Cabi.org)
10