Nghiên cứu sự di truyền bệnh beta thalassemia trong một số gia đình bệnh nhân khu vục đồng bằng sông cửu long
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.23 MB, 112 trang )
BO Y TE
TRUONG DAI HOC Y DUOC CAN THO
DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC CONG NGHE CAP TRUONG
NGHIEN CUU SU DI TRUYEN
BENH BETA THALASSEMIA TRONG MOT SO
GIA DINH BENH NHAN KHU VUC DONG BANG SONG
CUU LONG
TS. PHAM THI NGOC NGA
Cần Thơ — năm 2019
BO Y TE
TRUONG DAI HOC Y DUOC CAN THO
DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC CONG NGHE CAP TRUONG
NGHIEN CUU SU DI TRUYEN
BENH BETA THALASSEMIA TRONG MOT SO
GIA DINH BENH NHAN KHU VUC DONG BANG
SONG
Chủ nhiệm đề tài:
Cán bộ phối hợp:
CUU
LONG
TS. PHẠM THỊ NGỌC NGA
TS. CAO THỊ TÀI NGUYÊN
CNCD. TRINH MINH THIET
Cần Thơ —- năm 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân và nhóm
nghiên cứu. Các só liệu, kết quả trình bày trong dé tài là trung thực và chưa
được công bố trong bat kỳ nghiên cứu nào trước đây.
Tác giả đề tài
ee
Pham Thi Ngoc Nga
MỤC LỤC
Trang
LOI CAM DOAN
MUC LUC
PHAN I. TOM TAT DE TAI
PHAN 2. TOAN VAN CONG TRINH
DANH MUC CAC CHU VIET TAT
DANH SACH BANG
DANH SÁCH HÌNH
DAT VAN DE
CHUONG 1: TONG QUAN TALI LIỆU ....................................-<2
1.1. Bệnh Beta thaÏSS€THÍA...................
ca La LH TH HH HH ng cey
1.1.1. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia.................
1.1.2. Di truyền bệnh Beta thalassemia.................................---e:
1.1.3. Cơ chế gây mắt chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen beta-
1.1.4. Đột biến gây bệnh Beta thalassemia..............................
1.1.5. Các thể bệnh Beta thaÏassemia..............................-1.1.6. Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia............................-cc---¿
1.1.7. Điều trị Beta thalassermia........................cs-csccsccccccssrevrsecs
1.1.8. Phòng bệnh Beta thaÏassemia.........................-5-5 c
1.2.1. Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ...............
1.2.2. Phương pháp lập phả hệ...............................---.--ccccscscccece1.2.3. Phân tích phả hệ ..............................ch n*esirrrrerree
1.2.4. Các ký hiệu dùng để lập gia hệ...........................
2. csc5cc
CHƯƠNG 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 23
2.1. Đối tượng nghiÊH: CỨU. . . . . . . . . .
à
cnttnn n12
re 23
2.2. Thời gian và địa điểm nghiÊH CỨU........
on
...........
Hee . 23
4.3. Phương pháp nghiÊH CỨU. . . . . . .
ch
24
HH HH Hye
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu...........................- -2--2++222.+tzeEEEAEkrtEEEEEExxeztrrrrrree 24
2.3.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu .....................se........ccScccccccca 24
re
. «csct+.t12110113211xcx
2.3.3. Nội dung nghiên cứu.........
............
...re. 24
2.3.4. Phương pháp thu thập số liệu.....................-¿-2..ccc222222222.22222E22eee 26
0 02122 xnnrrvrtrrrrrrrree 35
2.3.5. Phương pháp hạn chế sai số...........................2.
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu...........................--c-2-2+22EzSEE2SEEEEEExrrrrserrreee 36
2.4. Đạo đức trong HghiÊH CỨN...............cccc
HH HH HHHH H01 ccHHte. 36
CHUONG 3. KET QUÁ NGHIÊN CỨU...............................--ce+vsseevseecczssee 37
3.1. Đặc điểm của đỗi tượng HghiÊn COU coeccccceccccsesscssssssssssessessersseescesssseesen 37
3.2. Phả hệ di truyén của một số bệnh nhân Beta thaÌassemia........................... 37
3.3.1. Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng sàng lọc, xác định người mang
gen và các đột biến trong pha hệ nghiên cứu........................ .--c+e+ttttrrvrere. 37
3.3.2. Xây dựng phả hệ di truyền......................
22. cec2veS2cSEE222215E2ExecEEevrrr
.. e 40
3.3. Tỷ lệ mang gen bệnh, j lệ các kiểu đột biến và các thể bệnh trong phá hệ
HghiÊH CỨN. . . . . . .
.
HH
111k
HH
TT 111201121
33
3.3.1. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu..............................- 53
3.3.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến và tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ........ 54
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................2.--22-cs< csds.kzsEEkeeEExeeoEExsdgEzxsscrrssee 56
4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiÊn CỨU. . . . . . .
cách ng
cvee 56
4.2. Pha hé di truyén của một số bệnh nhân Beta thaÌassemia........................... 56
4.3.1. Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng sàng lọc, xác định người mang
gen và các đột biến trong phả hệ nghiên cứu..........................s-- 22cccc2SEtrcrErrsrvcee 56
4.3.2. Xây dựng phả hệ đi truyền..................
- 6c Ss S222EEE1225E72e1222Ezxee
........ 57
V
4.3. Tỷ lệ mang gen bénh, tp lé cdc kiéu dét bién va cdc thể bénh trong pha hé
nghién cửu............. +.
HH TH HT
HH
HT TT TH
11 11 T11
Tàn
1y 62
4.3.1. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu.............................<. 62
4.3.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến và tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ.......64
KÉT LUẬN VÀ KIỀN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: tờ thông tỉn dành cho bệnh nhân và gia đình nghiên cứu.
Phụ lục 2: phiếu đồng thuận nghiên cứu về bệnh Beta thalassemia
Phụ lục 3: phiếu thông tin
Phụ lục 4: danh sách các đối tượng tham gia trong 12 phả hệ
tì
m
PHAN I
TOM TAT DE TAI
1. Đặt vẫn đề và mục tiêu nghiên cứu
Thalassemia là bệnh Hemoglobin
(Hb) di truyền đơn gen theo kiểu
Mendel phé biến nhất. Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra. Bệnh đa
số di truyền theo quy luật gen lặn, nhưng B-Thai di truyền trội cũng đã được
phát hiện ở người châu Âu và Nhật Bản [43], [58], [82], [83].
Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh
cao. Và theo báo cáo của Chỉ hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ,
năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 2.105 người bị Thalassemia
được các bệnh viện chẩn đốn, nhưng hiện nay chưa tìm thấy nghiên cứu về sự
di truyền bệnh j-Thal trong các gia đình có bệnh nhân mắc bệnh. Đây chính là
lý đo đề tài “Nghiên cứu sự đi truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số. gia
đình bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sơng Cửu Long” được thực hiện nhằm
mục tiêu:
(1). Xây dựng phá hệ di truyền 3 thế hệ của 12 gia đình bệnh nhân BThai ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.
(2). Xác định tý lệ mang gen bệnh, tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh
và các thể bệnh J-Thai trong các phả hệ.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng là bệnh nhân không phân biệt tuổi và giới tính, có hộ khẩu
thuộc 13 tỉnh và thành phố thuộc khu vực Đồng bằng sông Cửu Long được
chân đoán mắc bệnh B-Thal dua theo kết quả điện di Hb va tất cả người thân
có mối quan hệ huyết thống trong phạm vi 3 thế hệ với bệnh nhân.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang
~- Cỡ mẫu: áp dụng cơng thức:
n=Zzÿ' x p(1-p)/4?
Trong đó: Z = 1,96 (hệ số tin cậy với mức ý nghĩa œ = 0;05)
p là tỷ lệ người mang gen bệnh trong các phả hệ của bệnh nhân B-Thal.
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Phượng (2013) thì tỷ lệ này là 17,6%. Do đó,
nghiên cứu chọn p= 0,76.
d= sai số cho phép của nghiên cứu, chọn d = 0,05.
Vậy n= 223 người.
Ước tính trung bình mỗi pha hệ nghiên cứu khoảng 20 thành viên. Như vậy, số
phả hệ cần xây dựng trong nghiên cứu là 12 phả hệ.
- Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiện ở 12 đối tượng được
xác định bệnh B-Thal thé nang theo các nhóm dân tộc sống ở Đồng bằng Sơng
Cửu Long: 07 gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh, 3 gia đình bệnh nhân dân tộc
Khmer,
1 gia đình bệnh nhân dân tộc Hoa và 1 gia đình bệnh nhân dân tộc
Chăm.
- Các bước nghiên cứu:
+ 12 bệnh nhân và người có quan hệ huyết thống 3 thế hệ đồng ý tham
gia nghiên cứu, lấy thông tin và 2mL máu tĩnh mạch, chống đông bằng EDTA.
làm công thức máu 18 thông số.
+ Người nhà tham gia nghiên cứu có kết quả dương tính với chỉ số
MCYV và/hoặc MCH
sẽ được thực hiện kỹ thuật điện đi Hb để tìm người mang
gen bệnh.
+ Người mang gen bệnh sẽ được ly trích DNA và thực hiện xác định 22
kiểu ĐB phổ biến bằng kỹ thuật RDB để xác định thể bệnh -Thal và GAPPCR tìm ĐB gây ơ-Thai.
+ Tổng kết vẽ phả hệ theo quy ước quốc tế, xác định tỷ lệ mang gen bệnh
và tỷ lệ các thể bệnh trong các phả hệ nghiên cứu.
3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Xây dựng phả hệ di truyền
3.1.1. Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng sàng lọc, xác định người mang
gen và các đột biến trong phả hệ nghiên cứu
- Cơng thức máu: 146/251 (58,2%) đối tượng có kết quả dương tính với
chỉ số MCV/MCH (MCV<80f1,, MCH<28pg).
NW
- Điện di Hb: 103/146 (70,5%) người nhà có dương tính gồm: 9 thể phối
hop HbE/B-Thal (HbE va HbF cao), 2 thể đồng hợp HbEE (HbE cao>90%),
59 thể dị hợp tử B-Thal (HbA, >3,5), 33 thé di hop HbE (HbE tang).
- Kỹ thuật RDB tìm đột biến gây bệnh B-Thal: 101/103 (98,1%) bệnh
nhân tìm được ĐB trên gen B-globin; 2 bệnh nhân khơng tìm được ĐB tiếp tục
tìm DB bang ky thuat MLPA.
- Kỹ thuật GAP-PCR tim dét bién gay bénh a-Thal, kết quả có 8 bệnh
nhân mang có đột biến —SEA. Trong đó, 6/8 bệnh nhân là người chỉ mang gen
gây bệnh ơ-Thal và 2/8 bệnh nhân là người mang gen phối hợp œ và B-Thal
(thé dị hợp tử phối hợp ĐB của ø/B-Thai) do cả 2 bệnh nhân này ngồi đột
biến —SEA, kỹ thuật RDB cũng tìm được ĐB gây bệnh B-Thai.
- Kỹ thuật MLPA: 2 bệnh nhân làm MLPA đều mang đột biến giếng
nhau (8B)®'.
3.1.2. Xây dựng phá hệ di truyền
263 thành viên gồm:
12 bệnh nhân B-Thal và 251 người nhà tham gia
trong 12 phả hệ. Trong đó có 141 nữ và 122 nam, ngồi ra các phả hệ cịn có 2
thai nhi bị say, 1 thai dang phát triển và 1 bị chấm dứt thai kỳ đo kết qua chin
đoán trước sinh thai nhi ở thể bệnh B-Thai đồng hợp tử 81⁄2,
11/12 phả hệ có 3 thế hệ, chỉ có đuy nhất một phá hệ kinh có 4 thế hệ. Số
người trưng bình trong mỗi phả hệ là 22 người.
Tất cả các bệnh nhân B-Thal (có hai DB) va người mang gen bệnh (có 1
đột biến) trong pha hé đều được di truyền và tổ hợp các ĐB từ bố mẹ, ông bà ở
thé thé thir I va thir II.
100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên NST thường theo quy
luật của Mendel.
3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu
3.2.1. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu
Ở mỗi phả hệ tỷ lệ mang gen bệnh đều <50%. Tỷ lệ mang gen § khác
nhau: thấp nhất là 9,4% và cao nhất là 50%. Tỷ lệ mang gen HbE cũng dao
động từ 0%-37,5% trong từng phả hệ. Tỷ lệ mang gen bệnh chung cả beta và
ye
HbE của 12 pha hé 34,6% và là 35,4% nếu thêm 0,8% BN mang gen phối hợp
giữa g/B-Thai.
3.2.2 Tỷ lệ các kiểu đột biến và tỷ lệ các thể bệnh B-Thal trong 12 phả hệ
Trong 12 phả hệ, có 145 alen mang ĐB và 6 kiểu ĐB được phát hiện.
Ngoại trừ ĐB gây bệnh œ do mắt đoạn —SEA được phát hiện trong gia đình
mắc bệnh -Thal Kinh 04 và một ĐB gây ƒ° rất hiếm gặp (8B) ở gia đình
Chăm, 4 kiểu gây bệnh -Thal cịn lại đều là ĐB phổ biến ở Việt Nam. Trong
đó B”° chiếm tỷ lệ cao nhất (35,8%), tiếp theo là BoM? (32,4%); Bot!”
(17,9%) và B”(6,2%).
.
Về tỷ lệ các thể bệnh, có đủ 4 thể bệnh B-Thal trong 12 pha hé: đồng hợp
tit, di hop tử kép, dị hợp tử và thể phối hợp HbE/B-Thai. Nếu tách HbE thành
thể bệnh riêng và tính cả thể dị hợp tử phối hop o/B-Thal ở phả hệ Kinh 04, thì
6 kiểu đột biến đã tạo nên 7 thể bệnh trong 12 phả hệ. Tần số xuất hiện của các
thể bệnh khác nhau, cao nhất là thể dị hợp tử -Thal 52,2%, thể dị hợp HbE
27%, thể phối hợp HbE/B-Thai 14,8%. Thể bệnh đồng hợp HbE, thể dị hợp tử
kép, thể phối hợp ơ/B-Thal chiếm tỷ lệ bằng nhau 1,7% và thấp nhất là B-Thal
thể đồng hợp tử 0,9%.
4. Kết luận
12 phả hệ khảo sát ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long đều tuân thủ
theo quy luật di truyền của Mendel. Kết quả nghiên cứu này tạo cơ sở thuận
lợi cho việc tính xác suất mắc bệnh cũng như mang gen cho thế hệ con cháu.
Ngoài ra, tỉ lệ mang gen bệnh rất cao trong các phả hệ cảnh báo gia tăng nguy
cơ xuất hiện thể đồng hợp trong các thế hệ tương lai. Đồng thời sự xuất hiện
của đột biến gây —SEA và đột biến hiếm 8Bdel bên cạnh các đột biến phổ biến,
cho thấy việc cần thiết phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau trong trường
hợp chân đoán bệnh B-Thal. Như vậy, nghiên cứu phả hệ kết hợp với xét
nghiệm sinh học phân tử sẽ là hai công cụ đắc lực giúp bác sĩ trong tư vấn di
truyền và chấn đoán xác định nguy cơ mắc bệnh B-Thal.
PHAN 2
TOAN VAN CONG TRINH
DANH MUC CAC CHU VIET TAT
Từ viết tắt
ARMS
ASO
Tiếng Anh
Tiéng viét
Amplification refractory
Hệ thống nhân bản đột biến
mutation system
chịu nhiệt
Allele-specific
Oligonueleotide đặc trưng alen
oligonucleotide
P-Thai
Beta Thalassemia
Cd
Codon
ddNTP
Dideoxynucleotide
DQ
Dosage quotient
Bộ ba giải mã
Liều lượng
DB
Đột biến
ĐBSCL,
Đồng bằng sông Cửu Long
Hb
HLA
MCH
MCV
Hemoglobin
Human leukocyte antigen
Kháng nguyên bạch cầu người
Mean Corpuscular
Số lượng hemoglobin trung
Hemoglobin
bình trong một hồng cầu
Mean Corpuscular Volume
Thể tích trung bình một hồng
cầu
MLPA
Multiplex Ligation-
Khuếch đại đa đoạn đị
dependent Probe
NST
PCR
Amplification
.
Polymerase chain reaction
Probe
Nhiễm sắc thể
Phản ứng khuếch đại chuỗi
Đoạn đò
RBC
Red blood cell
Hồng cầu
RDB
Reverse Dot Blot
Lai dò ngược
TRC
Thalassemia reseach center
Trung tâm Thalassemia
TIF
Thalassaemia International
Liên đoàn Thalassemia thế giới
Federation
Kù
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bang 1.1
Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức
7
Bang 1.2
Các đột biến B-Thal phố biến ở một số quần thể trên thế giới
9
Bang 1.3
Phân bố các kiểu gen -Thal ở Hy Lạp và Thổ Nhĩ Kỳ
10
Bang 1.4
Các kiểu đột biến thường gặp, mức độ nặng và phân bế theo
I1
chủng tộc
Bang 1.5
:
Kiểu gen, công thức máu, điện di hemoglobin và triệu chứng
12
của các thể bệnh B-Thal
Bang 1.6
Kiểu gen, công thức máu, điện đi hemoglobin và triệu chứng
14
của các thể bệnh -Thal có đột biến HbE
Bang 1.7
Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong chân đoán B-
16
Thal
Bang 2.1
Một số ký hiệu sử dụng trong 12 phả hệ nghiên cứu
25
Bang 2.2
Chỉ số DQ đọc kết quá MLPA
32
Bang 2.3
Trình tự các primer trong phan tng GAP-PCR
33
Bang 2.5
Kích thước các loại đột biến
33
Bang 3.1
Phân bố độ tuổi, giới tính theo các dân tộc của đối tượng xây
37
dựng phả hệ
Bang 3.2
Tỷ lệ mang gen bệnh trong 12 phả hệ
53
Bang 3.3
Tỷ lệ mang gen bệnh theo dân tộc trong 12 phả hệ
54
Bang 3.4
Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 pha hé
54
Bang 3.5
Tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ
55
Kit
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hinh 1.1
Cấu trúc gen B-Thal
4
Hình I2
Di truyền bệnh B-Thai
4
Hình 13
Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân B-Thai
5
Hinh 1.4 — Ban dé phan bé ty 1é bénh B-Thal va HbE 6DongNamA
8
Hinh 1.5
12
= Bénhnhắn B-Thal thénang
~
Hình2.lI
Biéu dé két qua dién di Hemoglobin
Hinh 2.2
Quy trình tách chiết DNA
từ máu
27
ngoại vi bằng Kit
2§
QIAGEN
Hình 2.3
Các bước chính trong kỹ thuật RDB
28
Hinh2.4
Strip mang 22 kiểu đột biến và thể bệnh B-Thal tươngứng
29
Hinh2.5 — Đọc kết quả kỹ thuật RDB
30
Hình 2.6
Cấu tạo đoạn dò trong kỹ thuật MLPA
31
Hinh 2.7
Kết quả của kỹ thuật MLPA
32
Hình 2.8
Hình điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến ø-Thaltrên
34
gel
Hình3.1
Kết quả một số mẫu bệnh nhân phát hiện đột biến bằng
39
RDB
Hình 3.2
Đột biến (6B}” được phát hiện bằng MLPA
40
Hình 5.1
Test sức bền thẩm thấu hồng cầu
125
Hình5.2
Két qua xét nghiệm DCIP mẫu HbE (bên phải) và mẫu
126
bình thường
Sơ đồ 1.1
80 d2.1
Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi œ ở bệnh nhân B-Thal
— Các bước chính trong nghiên cứu
Sơ đồ 3.1 — Các bước sàng lọc, xác định người mang gen và các đột
6
35
38
xiv
biến trong 12 phả hệ nghiên cứu
Sơ đồ 3.2
Phả hệ gia đình Kinh 01
41
Sơ đồ 3.3
Phả hệ gia đình Kinh 02
42
Sơ đồ 3.4
Phả hệ gia đình Kinh 03
43
Sơ đồ 3.5
Phả hệ gia đình Kinh 04
44
Sơ đồ 3.6
Phả hệ gia đình Kinh 05
45
Sơ đồ 3.7
Phả hệ gia đình Kinh 06
Sơ đồ 3.8
Phả hệ gia đình Kinh 07
46
47
Sơ đồ 3.9
Phả hệ gia đình Khmer 01
48
So dé 3.10
Phá hệ gia đình Khmer 02
49
Sơ đồ 3.11
Phả hệ gia đình Khmer 03
50
Sơ đồ 3.12
Phả hệ gia đình Hoa
51
So dé 3.13
Phả hệ gia đình Chăm
80
Biểu đồ 3.1
Tân số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 01
4]
Biểu đồ 3.2
Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 02
42
Biểu đồ 3.3
Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 03
42
Biểu đồ 3.4
Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 04
43
Biểu đồ 3.5
Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 05
44
Biểu đồ 3.6
Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 06
45
Biểu đồ 3.7
Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 07
46
Biểu đề 3.8
Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 01
47
Biểu đồ 3.9
Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 02
48
Biểu đồ 3.10. Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 03
49
Biểu đồ 3.11
50
Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Hoa
Biểu đồ 3.12 Tần số mắc bệnh trong pha hệ gia đình Chăm
51
ĐẶT VẤN ĐÈ
Thalassemia
14 bénh Hemoglobin
(Hb) di truyén đơn gen theo kiểu
Mendel phổ biến nhất. Bénh do dét bién (PB) trén gen globin gây ra. Bệnh đa
sé di truyén theo quy luật gen lặn, nhưng B-Thal di truyén trội cũng đã được
phát hiện ở người châu Âu và Nhật Bản [43], [58], [82], [83].
Hiện có khoảng 71% quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân
sé thé giới mang gen bệnh. Bệnh phân bố rộng từ Địa Trung Hải qua Trung
Cận Đông, châu Á đến Đông Nam Á,... thường là ở những nước có nguồn lực
thấp và tạo ra một gánh nặng lên hệ thống y tế của các nước này [53], 54],
[82]. Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe
nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là
một trong những ưu tiên về di truyền người [4], [8], [43], [48], [61].
Trẻ mắc bệnh B-Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển
cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biển chứng của nó. Việc điều trị chủ yếu
là truyền máu, thải sắt rất tến kém, ít hiệu quả và chỉ để duy trì sự sống tạm
thời nên trẻ thường tử vong sớm trong những năm đầu của cuộc sống. Ghép
tuỷ xương giúp cải thiện bệnh nhưng chỉ hạn chế ở một vài trường hợp. Đây là
lý do khiến bệnh thalassemia trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Vì
vậy, việc phòng bệnh được đặt ra như một giải pháp nhằm
ngăn chặn sự lan
tràn của bệnh đi truyền này [30], [31], [35], [36], [40], [50], [53], [70].
Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh
cao. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh p-
Thal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc, một số thể bệnh -Thal.
Theo hiệp hội Tan huyết Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân
nặng cần điều trị, mỗi năm có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh. Và theo
báo cáo của Chỉ hội Tan máu bẩm
sinh khu vực Tây Nam
Bộ, năm 2015,
Đồng bằng sơng Cửu Long có khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các
bệnh viện chẳn đoán, nhưng hiện nay chưa tìm thấy nghiên cứu về sự di truyền
bệnh B-Thal trong các gia đình có bệnh nhân mắc bệnh. Đây chính là lý do đề
tài “Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia đình
bệnh nhân khu vực Đẳng bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm mục
tiêu:
(1). Xây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của 12 gia đình bệnh nhân ÿThai ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.
(2). Xác định tỷ lệ mang gen bệnh, tỷ lệ các kiểu đột biển gen gây bệnh
và các thể bệnh B-Thal trong cdc pha hé.
Chương 1
TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh Beta thalassemia
Bệnh B-Thai là một loại bệnh Hb xảy ra đo các đột biến gen làm giảm
hoặc không tổng hợp được chuỗi B-globin của phân tử Hb.
Kết quả tạo nên
các Hb bất thường dẫn đến giảm hoặc không thực hiện được chức năng vận
chuyển khí cho cơ thể. Nếu ĐB gen làm chuỗi œ-globin giảm hay không được
tạo thành gọi là bệnh œ-Thal. Cũng có trường hợp cả hai chuỗi B và œ bị thiếu
hụt hơn bình thường, trường hợp này gọi là thể phối hợp 0/B thalassemia.
Bệnh hemoglobin E (HbE) do ĐB sai nghĩa tại vị trí nucleotide 129 cha
chuỗi B-globin (bộ ba mã hoá thứ 26 trên exon 1): GAG bị thay bằng AAG,
lam cho acid amin vị trí thứ 26 1a Glutamic acid bi thay bang Lysine, din dén
giảm số lượng chuỗi B-globin. Như vậy, HbE cũng là §-Thai thể nhẹ.
1.1.1. Đặc điểm phân tử của bệnh Betu thalassemia
Cụm gen j-giobin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể (NST) số 11
(1lp15.5), với đoạn DNA đài 73.308 cặp base, mã số trên ngân hàng gen là
U01317, bao gồm các gen có trật tự: 5'— epsilon — gamma — G — gamma — A —
delta — beta — 3’.
Gen
ÿ-globin dài
1606
cặp base, nằm
ở vị tri nucleotide
5203272-
5204877 của NST số 11, tương ứng với nueleotide 62137-63742 của cụm gen
B-globin và đoạn khởi động sát đầu 5° ở vị trí các nucleotide thứ 62061, 62106
và 62144.
Gen B-globin cé 3 exon va 2 intron mã hoá cho chuỗi
acid amin. Exon
I ở nucleotide
B-globin dài 146
I-142 và mã hoá các acid amin
1-30, acid
amin thir nhat bat dau tir vj tri nucleotide 50. Exon 2 6 nucleotide 273-495 va
mã hoá các acid amin 31-104. Exon 3 bắt dau tir nucleotide 1346-1606 va ma
hoá các acid amin 105-146. Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc và
chức năng của chuỗi 8-globin. Exon 1 và exon 3 nằm phía ngồi chủ yếu là
các acid amin wa nước. Exon 2 nằm bên trong phân tử tạo bởi các acid amin
ky nước. Khi có ĐB gen xảy ra thì trình tự các acid amin sẽ thay đổi. Các acid
amin ở bề mặt bị thay bằng các acid amin ky nước và tạo ra các thay đổi hoá
học dẫn đến giảm đàn hỏi, gây mất ỗn định của phân tử protein, tạo ra các
chuỗi -globin bị lỗi [23], [45], [86], [87].
————
CCAAT ATAAA
—
B--globin gene ~1700 bp
|
~800 bp
~600 bp
Hình 1.1. Cấu trúc gen B-Thai (Chanane Wanapirak et al, 2009)
1.1.2. Di truyén bénh Beta thalassemia
Beta thalassemia 14 bệnh di truyền lặn trên NST thường, theo quy luật đi
truyền Mendel. Khi chỉ có cha hoặc mẹ mang gen bệnh, 50% khả năng con
sinh ra là thalassemia di hop ti và khơng có trẻ đồng hợp tử bị bệnh. Nếu cả
cha và mẹ đều bị thalassemia đị hợp tử thi 25%
kha nang sinh con bình
thường, 50% khả năng con dị hợp tử và 25% khả năng con đồng hợp tử [10],
[26], [79], [87].
Bố ho§š mã mắc bệnh, người kia mang gen ben
Nguy cơ cho com:
~ Mắc bệnh thalassemia; 25%
„ "Người manggen!50%
Mắc thệnh
ie
ue
lang
gen bệnh
gen bệnh
©
6
@
má nhạy Manager birh Thalassemia
Hình 1.2. Di truyền bệnh B-Thal
`...
Me:
Khơng
Đế:
Mang
dc hénh
_—
Z5
foe
®
Nguy co cho con:
"~.....
"Cha:
lang
Bố hoặcn me mang gen:hệnh
«Mic thalassemia: 03
Mang gen bệnh: 50%
Nang gen
LER
Bố và mỹ mang gen benh |
Nguy cơ cho con:
~ Mc bnh: 50%
SN
h
đ
oOo
@
sen
en bnh
s
â
1.1.3. C ch gõy mt chức năng sinh bọc của các kiểu đột biễn gen
beta-globin
Khi cdc DB xuat hiện trên gen B-globin tùy theo vị trí mà DB nay sẽ làm
thay đổi cấu trúc và số lượng của phân tử Hb và tạo ra các hằng cầu với nhiều
biến đổi khác nhau. Thông thường các ĐB đều làm giảm hoặc không tổng hợp
loại Hb bình thường nên hồng cầu có biểu hiện nhược sắc và tăng sinh các
hồng cầu non trong tủy.
Đột biến gây thiếu hụt chuỗi § dẫn đến dư thừa chuỗi œ. Các chuỗi œ dư
thừa tạo thành các hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng
cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu
mat độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành tế bao cứng nên khó vượt qua các “màng
lọc” ở lách [5], [44], [66]. [75], [82].
NORMAL
oB
Ba 6
ø¿%
Gea)
Œ~THAL
af
Ba
BBof
&B
:
—THAL
BB
3
| Be wa] |
aa
a.
8 08
g s
Hình 1.3. Hình dạng hằng cầu bắt thường của bệnh nhân 8-Thai [23]
Mặt khác, các hạt tủa cũng làm cho màng hồng cầu tăng diện tiếp xúc, dễ
bị các tác nhân oxy hóa phá hủy. Đồng thời tính thấm của màng thay đổi nên
kali ở bên trong tế bào thốt ra ngồi huyết tương. Những tác hại trên của các
hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xương,
các hạt tủa gắn lên nguyên sinh chất và màng của hồng cầu non, làm cho hồng
cầu bị chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu trong
tủy, gây nên các biến dạng xương, tăng hấp thu sắt dẫn đến nhiễm sắt cho cơ
thể. Hiện tượng các hồng cầu non bị chết sớm không đến được giai đoạn
trưởng thành như trên gọi là hiện tượng sinh hồng cầu không hiện quả. Như
vậy, dư thừa chuỗi œ dẫn đến tuỷ xương sinh hồng cầu không hiệu quả, đây là
cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi về lâm sảng và huyết học ở những bệnh
nhân B-Thal thé nang (So dé 1.1) [51], [66], [75], [82].
Ở thể dị hợp tử, các biển đổi về hồng cầu cũng tương tự như đồng hợp
tử, nhưng mức độ không tram trong, vi thể chỉ có hiện tượng thiếu máu nhẹ.
Cũng tương tự, ở các bệnh nhân thể nhẹ, sự mất cân bằng giữa chuỗi œ và
chuỗi B không nặng nề nên bệnh nhân hầu như khơng có biểu hiện lâm sảng
thiếu máu [73].
Dự thừa quả mức
chuỗi a-globin
eo
:
-
7
77-7
Biến chất
^
Thành lậpheme
| và hemichtome
ở
ý Ngộ độc sắt
CB
|
TÃNG TỐNG HỢP | ¡Giảm
RYTHROPOIETINÌ
`
cùng cấp axy mơ
Loại bỏ hổng cầu
bị tổn thương
x~
NI
1S.
OĂNG VÀ BIẾ
DANG XUGNG/
~~
CC
Nở
CC
TỦY
ˆ
Tang
=-
ẢẨÔ3
So dé 1.1. Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi œ ở bệnh nhân B-Thal
1.1.4. Đột biên gây bệnh Beta thalassemia
De Siva, S. ø/ ai, 2000 cho biết bệnh B-Thai phân bố rộng rãi từ Dia
Trung Hải, Trung Đông, Án Độ qua Pakistan cho đến Đông Nam Á (Hình 1.4)
[42]. Bệnh cũng có tần số cao ở một số vùng thuộc Liên Xô cũ và Trung
Quốc. Ở châu Âu, châu Phi bệnh tương đối ít gặp, gần đây do sự đi dân, gen
bệnh phát tán đi khắp nơi và thalassemia trở thành vấn nạn toàn cầu [65], [72].
Đức, một quốc gia không nằm trong vành đai phân bé cha bénh B-Thal
là một minh chứng. Theo nghiên cứu của Elisabeth Kohne va Enno Kleihauer
(2010) B-Thal chiếm 23,2% trên tổng số bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu tại
Đức [44]. Trong tổng số 23.330 bệnh nhân mắc bệnh B-Thal ở quốc gia này,
số người có nguồn gốc bản địa là 3.693 chiếm chỉ 15,8%. 84,2% bệnh nhân
còn lại được di cư từ các quốc gia Địa Trung Hải nằm ở phía nam châu Âu và
Thổ Nhĩ Kì.
Bảng 1.1. Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức
Thể bệnh Ð-thaìi
Sénguai(%)
6- tha[
23.330(100)
|19.637 (84,2)
B.693 (15,8)
B- thai thê ân
21.555 (92,4)
[18.101 (84)
B.454 (16)
861 (3,7)
§58 (99,7)
3 (0,3)
196 (0,4)
94 (97,9)
2 (2,1)
584 (73,4)
P34 (26,6)
_ JB- thai thể nặng
B- thai thể trung gian
ð- thai dạng phối hợp B18 (3,5)
|Dân nhập cư (%) [Dan bản xứ (%)
Ngày nay, gần 200 kiểu ĐB khác nhau trên gen B-globin đã được mơ tả.
Có rất nhiều đạng như: ĐB
diém (point mutations), DB khung (frameshift
mutation), DB v6 nghia (nonsense mutations),... xuất hiện trên tất cả các vùng
của gen j-globin bao gồm cả intron, vùng promotor. Các ĐB xuất hiện tùy
theo kiểu và vị trí mà sẽ ảnh hưởng nhiều hay ít đối với việc tổng hợp chuỗi B
gây ra bệnh B-Thai với biểu hiện thiếu máu mức độ nặng, nhẹ khác nhau. Các
DB chi yéu roi vào các nhóm sau [72]. [83]:
- Nhóm
1; đột biến gây mất hồn toản chuỗi -globin, gọi là p°
thalassemia: gồm các ĐB vô nghĩa, lệch khung hoặc ĐB cắt/nối RNA. - Nhóm
2: đột biến gây giảm tổng hợp chuỗi B globin, goi 1a B* thalassemia: gdm cdc
ĐB ở đoạn khởi động, poly A, đầu 5' hoặc đầu 3' không địch mã hoặc do cắt
nối RNA. Có thể chia các ĐB như sau:
+ Đột biến đoạn khởi động: có 18 đột biến đoạn khởi động được phát
hiện. Các ĐB này ảnh hưởng đến phiên mã do làm giảm khả năng gắn enzyme
RNA polymerase và chỉ gây giảm số lượng chuỗi B-globin với các biểu hiện
lâm sàng -Thai thể trung gian. Ví dụ: đột biến c.-78A>G (-28A>GQ).
+ Đột biến cắt/nỗi mRNA: sau phiên mã, mRNA được cắt/nối để loại bỏ
intron. Cac DB cat néi có thể gây mất hồn tồn hoặc giảm một phân q trình
cắt/nối bình thường hoặc tạo ra vị trí cắƯnốổi mới intron hoặc ở exon gây ra 8°
hoặc §” thalassemia như các đột biến c.92+1 G>T (IVS1.1 G>T), c.316-197
C>T (IV§2.654 C>T).
HOE 435)
B inwassaecwa (8)
z
v
sS ¬ÀPtones
ie
oO
oF
rune
Fane
ve
=>»
tt
Thy
Hình 1.4. Ban dé phan bố tỷ lệ bệnh 6-Thal va HbE 6 Déng Nam A [42]
+ Đột biến tạo mRNA khơng có chức năng:
. Đột biến vô nghĩa: xây ra khi thay thế một nucleotide này bằng một
nucleotide khác làm xuất hiện mã dừng, gây chấm dứt dịch mã sớm tạo chuỗi
globin khơng hồn chỉnh, nhanh chóng bị thối hố. Các ĐB này gây ra kiểu
hình B thalassemia. Ví dụ: đột biển c.52A>T (Cd17AAG>TAG).
. Đột
biển
lệch
khung:
xảy
ra khi
mất
hoặc
thêm
một
hoặc
vài
nucleotide ở vùng mã hoá của gen làm thay đổi khung đọc bình thường bắt
đầu từ vị trí ĐB và tạo mã vùng xuất hiện sớm, tạo ra các chuỗi B- globin
khơng hồn chỉnh. Đây là ĐB nghiêm trọng, gây ra kiểu §° thalassemia. Một
số ĐB loại này là đột biến c.124-127delTTCT (Cđ41/42 ~TTCT), c.214insA
(Ca 71/72 +A) và c.28insA (Cd95 +A) [68], [62].
Bang 1.2. Các đột biến 6-Thal phổ biến ở một số quần thể trên thế giới
Quan thé | Dat biến
Đột biến
-28 A>G
-28 A>G
Codon L7 AAG>TAG
Codon 17 AAG>TAG
Codon 26 GAG>AAG
Codon 41/42 -TTCT
Việt Nam | Codon 41/42 -TTCT
Codon 71/72 +A
Trung
Quốc
Quan thé
Déng Nam
A
Codon 26 GAG>AAG
IVS 1-5 G>C
IVS 2-654 C>T
IVS 2-654 C>T
Codon 95 +A
Codon 8-AA
IVS1-1 G>T
-29 A>C
Codon 17 AAG>TAG
Codon 8/9 +G
Codon 26 GAG>AAG
Codon 41/42 -TTCT
Trung
Đông
IVS 1-5 G>C
Codon 39 CAG>TAG
Codon 71/72 +A
Codon 44 —C
IVS 2-654 C>T
IVS 2-1 G>A
IVS 1-1 GA
Codon 8/9 +G
Dia
IVS 1-6 T>C
IVS 1-1 G>T
Trung
IVS 1-110 G>A
Hai
Ấn Độ
IVS 1-5 G>C
Codon 39 CAG>TAG
Codon 41/42 ~-TTCT
IVS 2-745 C>G
619 bp deletion
Theo m6t vai tac gia nhu Weatherall, D. et al, 2001; Loukopoulos, D.
and Kollia, P., 2001; Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2013, 6 những vùng có tỷ lệ
gen bệnh cao, thường có một số ĐB mang tính phổ biến, các ĐB nảy có tính
đặc trưng theo đân tộc và vùng miền [1ó]. [65], [83]. Thường mỗi cộng đồng
có khoảng 4 đến I0 đột biến phổ biến như ở Án Độ Dương và các nước lân
cận: các ĐB hay gặp là c.92+5 G>C, c.46 G>A, c.27-28 +G và c.124-127 —
TTCT. Một số khu vực khác, các kiểu ĐB được trình bày trong bảng 1.2.
Tại vùng Địa Trung Hải, tần số người mang bệnh cao (6,8 - 15% dân số).
Đột biến hay gặp nhất tại khu vực nảy là B”: IVS1.110 G>A. Tuy nhiên, ở mỗi
quốc gia trong khu vực này có một số đột biến đặc trung. Vi du: tai Iran:
IVS2.1 G>A, IVS1.1 G>A, Codon 8/9 +G, Cd8 -AA, IVS1.110 G>A, Cd39
C>T, IVS1.6 T>C), I1VS2.745 C>G), IVS1.5 G>C), Cd5 -CT. G Hy Lạp và
Thổ Nhĩ Kỳ được trình bày trong bảng 1.3 [65]. Các loại ĐB thường gặp này
sẽ biểu hiện mức độ thiếu máu khác nhau trên bệnh nhân và cũng phân bố đặc
trưng theo các chủng tộc (Bảng 1.4) [66].
Bang 1.3. Phân bố các kiểu gen B-Thal ở Hy Lạp và Thể Nhĩ Kỳ
IKiéu gen
Hy Lap (989 alen)
L101 (C>T)
L87 (C>G)
F30 (T>A)
L28 (A>C)
IVS1.1 (G>A)
[VS1.5 (G>A, C, T)
IYS1.6 (T>G)
I'VS1.110 (G>A)
IVS2.1 (G>A)
Cd 39 (C>T)
IFS5 (-CT)
IFS6 (- A)
IFS8 (-AA)
FS8/9 (+G)
ĐB khác
Chưa rõ
Thỗ Nhĩ Kỳ (1227 alen)
3
19
1
135
5
81
425
20
193
6
28
9
1
7
6
12
33
3
54
19
181
519
91
48
22
5
81
19
-
14
86
Ở Việt Nam theo các nghiên cứu, có 8 loại ĐB phổ biến (Bảng 1.2). Các
ĐB này luôn chiếm >90%
các trường hợp khi nghiên cứu trên người Việt
Nam, trong đó Cd95 +A (c.286insA) là ĐB đặc trưng của nước ta.
