Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh cây diếp cá (houttuynia cordata thunb) có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn staphylococus aureus atcc tại cần thơ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.86 MB, 79 trang )
;
BO Y TE
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG
PHAN LAP VA DINH DANH VI KHUAN
NOI SINH CAY DIEP CA (Houttuynia cordata Thunb)
CO HOAT TINH KHANG KHUAN VOI VI KHUAN
Staphylococcus aureus ATCC
TAI CAN THO
Chủ nhiệm đề tài: ThS. HUYNH VAN TRUONG
Cán bộ tham gia: CN. LÝ TÚ HƯƠNG,
PGs.Ts. TRÀN ĐỖ HÙNG
Cần Thơ - Năm 2019
t
LỜI CAM ĐOAN
Chúng tôi xin cam đoan kết quả này là cơng trình nghiên cứu thật sự của
chúng tơi. Tất cả các số liệu và kết quả nghiên cứu đã được trình bày trong nghiên
cứu này là trung thực và chưa từng được cơng bố đưới bất kỳ hình thức nào.
Chúng tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của chính mình.
Chủ nhiệm đề tài
CE
Huỳnh Văn Trương
MỤC LỤC
PHAN 1. TOM TẮT ĐỀ TÀI........................
2+
ELfxtevSEEEEEESEEEEEEEEvrtggEvrkrvrreerer i
TOM TAT DE TAL ....seccssscssessscsssesssessssesscssesssccssssnecssceasegecssecasesssesecsssessscssvessssssssers ii
20A1. 0200101377... ..44..............À.. ii
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................-.--.s-cscc¿ ........ ii
Phân lập vi khuẩri nội sinh trong cây DiẾp cá...................... i4. sex crecrxvEgresrxereeree iv
KET QUA NGHIEN CUU ooeeecsssssssessessscsssscssssccssssssssssssesstssssssussessvenrevecsececeuccscseaes iv
Kết quả phân lập vi khudn n6i sinh.......ccsecssssesssessessessessssssssssessusssssssssscsseesnesseesees V
Đặc tính hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA................... V
Đặc điểm tế bào vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá........................ coccscoccecrkerrrkerrrereseree v
Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh cây Diếp CÁ. Q0
HH H914 1H00 ng 026051 kká vi
Định danh vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 vcssssccccsssssssssesssecssccsesseenes vi
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn nội sinh câyDiếp cá với vi khuẩn
Staphylococcus qureus ATC
2592À...............
..
HH HÌn HH HH
ng H101 e1
re vì
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.........................---<©+©cSe©zz+vservxeerrserrreeerree vi
900097.) 01 .—--.”Ầ................ vii
PHAN 2. TOAN VAN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU.........................
5° 6ceczxszeesee ix
DANH MUC CAC TU VIET TAT uccsccsscsssssssssssscsscssssssecesssssssssuccassceesessesessesesaness x
DANH MỤC BẢNG.............................-ccccscccccccc THẾ 1111814 1451181157115 11050ecrre xi
DANH MỤC HÌNHH ..............................2-.
2< Sssx2 S3 Chất kEkEersrkrressrke ii
DAT VAN DE wueccsssssssssssssssecssecsssssscsssesavcesscescssecssussssssscsssssscesevsncessvssucsseenseanueareeess
MUC TIEU NGHIEN CUU
Churong 1. TONG QUAN .oceccsssssssssesscssessssscsssssssvecssssasecssssstssecssavecnssecassacseresecnessenss
L.1. Dac diém thye vat cAy Diép cA .eecccecccsessssssessstssssssssesssscsssnvcesucssscenssssssvessssesssseess 4
1.2. Phân bố sinh thái và phan lodi......cesssssssscssssecssssscssssssessssecssssuscarsevessnseeessssessessneeeeerees 4
1.3. Thành phần hóa hc ..sccsssssssssssesesssssessssssesssssessssssssssssesssseessssecesssesessanesereesssseaseneesecs 5
1.4, Cong
na
ốốố ốốốố.ốố.ố.ố.e............
1.5. Sơ lược về vi khuẩn nội sinh thực vật.....
8
LH th TH ng 1400111188011
7507804 05 geze 11
1.6. Vi khuẩn gây bệnh sử dụng trong nghiên cứu là vi khuẩn
Staphylococcus
tt
1.7. Sơ lược về phương pháp khuếch tán qua vòng giấy loc (Disk diffusion assay).... 15
1.8. Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử............................--2 cs22vks2xxsverxesvvrxeeoree 15
1.9. Phần mềm phiân tích trình tự DNNA.............................-22-c2ccs
...18
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......
.20
2.1. Thời gian, địa điểm và cỡ mâu nghiên cỨU.........................-.--s25 v23 3 veetssrsesrsrsrsee 20
2.2. Phương tiện nghiên GỨU .........................
- 5° < cà
3110101100 101101401 01010804013 se 20
2.3. Phirong phap nghién CU...
nh.
................... 23
2.4. Phân lập vi khudn ndi sinh trong cAy Di€p CA.....ssecsscesssssssessssssesssssessssassssssneetessens 25
2.5. Khảo sát các đặc tính của các dịng vi khuẩn nội sinh........................+ se ccxzezeecrs 26
2.6. Khảo sát tính kháng khuẩn của các đòng vi khuẩn nội sinh với các đòng vi
khuẩn ®/aplyylococcus aureus A'TCC25923............................
tt 221...
eo 29
2.7. Nhận diện một số dòng vi khuẩn đã phân lập có triển VỘNE........................ecscscscscee 30
2.8. Nhận dién bang k¥ thudt PCR .v....sssssssscsssssesccsssssessssssseecesssssesssssssvesssessssssseessseeeens 31
2.9. Kr LY 86 LSU eeccessssssscsssesssssccssssacssscssssssssusessssssssusssasessasessussssesessnscesnseensuscensussesnecess 33
Chương 3. KÉT QUA NGHIEN CUU.....cssscssssesssssscsessesecessssecessnesscsssessssssscsesssnes
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh
3.2. Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc, hình dạng và sự chuyển động của các
dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá..............................--o5-5c m.............. 34
3.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh................................------ccccceseeee 34
3.2.2. Đặc điểm tế bào vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá...........................---ccsccccsrevceceee 38
3.2.3. Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá..........................--..5-2cccscei 40
3.3. Phân lập và định danh vi khudn Staphylococcus aureus ATCC 25923................. 41
3.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá với vi khuẩn
Staphylococcus qureus A TC 25923.............. HH
HH HH HH
11118011111csrke 42
3.4.1, Tính kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gay bénh S.
aureus ATCC 25923 & mat sO LOCUM vessecssssssssssssssssssssssssssesscrsssssssetssssssesscssesecees 42
3.4.2. Kết qua khao sat hoat tinh Khéng KHUaM ..c..scesssscsssssssssscsceeccsescecsscccescescneesssssesss 44
3.5. Nhận điện một số dong vi khuẩn triển 1
.................
45
0018 8:7. 0000/0000. ............
46
4.1. Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA của dịng PĐTT2........................---cc-ss©cxscsscscree 46
4.2. Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA của địng BTT4...........................--cccsccreeerrxee 47
4.3. Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA của đồng NK'T3................................-scc.veccsee 47
4380097001157...
4581620121155 ...................
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................-2..
+ 2t. t7 1111k ecreereerkerrerrssee
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4..................... .................
PHU LUC 5
PHU LUC 6
PHU LUC 7
PHU LUC 8
49
50
50
d
PHAN 1. TOM TAT DE TÀI
TOM TAT DE TAI
DAT VAN DE
Cây Diếp cá (Houffuynia cordafa Thunb.) là loại rau khá phơ biến ở nước ta,
có vị đẳng, tính ơn và được sử dụng trong dân gian để điều trị một số bệnh như:
kháng viêm, lợi tiểu, táo bón,.(Đỗ Tắt Lợi, 2000). Trên thế giới, nhiều nghiên cứu
đã được tiến hành để khảo sát dược tính và các hợp chất có trong cây Diếp cá. Tuy
nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về hệ vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá được
thực hiện
Ở mỗi loài cây chủ có những vi khuẩn nội sinh đặc trưng và được chia thành
hai nhóm, nội sinh bắt buộc hoặc nội sinh tùy nghỉ. Chúng là nguồn nguyên liệu
thiên nhiên tiềm năng sử dụng trong y học, nông nghiệp và công nghiép (Strobel et
ai., 2003). Vĩ khuẩn nội sinh tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh
học cao với nhiều ứng dụng trong nông dược, điều chế thuốc kháng sinh, tăng tinh
miễn dịch, kháng ký sinh trùng, chất chống oxy hóa và hỗ trợ điều trị ung thư
(Gunatilaka e¿ ai., 2006). Cho đến nay, nhiều chủng vi khuẩn nội sinh đã được
nghiên
cứu
như
Azorhizobium,
Bacillus,
Bradyrhizobium,
Gluconacetobacter,
Klebsiella, Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas va Streptomyces (Hollman et
al, 1997). Vi khuẩn nội sinh từ cay Andrographis paniculata (Xuyén tam lién) cho
thấy
hoat
déng
chéng
ca
vi
khudn
Gram
duong
va
Gram
4m
gây
bệnh
(Arunachalam et al., 2010). Chat chuyén héa thứ cấp do vi khuẩn nội sinh Bacillus
pumilus MAIIIM4A cho thay kha nang rc ché manh các loại nắm và một số vịng vi
khuẩn gây bệnh.
Do đó nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài:” Phân lập và định danh vi khuẩn
nội sinh ờ cây điếp cá có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn S/aplyiococcus
aureus ATCC tai Can Tho” dugc thuc hiện với các mục tiêu như sau:
1. Xác định các đặc điểm của các đòng vi khuẩn nội sinh của cây diếp cá tại
Phong Điền, Bình Thủy và Ninh Kiều của thành phố Cần Thơ.
it
r
Nụ
2. Phân lập và định danh một số dong vi khuẩn nội sinh của cây diếp cá có
hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923 tai Phong
Điền, Bình Thủy và Ninh Kiều của thành phố Cần Thơ.
Hi
TS
Vy
PHUONG PHAP NGHIEN CUU
Nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh của cây Diếp cá, mẫu cây diếp cá được thu
được ở Phong Điền, Bình Thủy và Ninh Kiều của thành phố Cần Thơ.
Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá
- Ly tâm địch trích mẫu vi khuẩn 2000 rpm ở 4°C để loại bỏ xác bã cịn
sót
lại. Hút địch trong ở phía trên cho vào mơi trường bán rắn. Ủ từ 3 — 5 ngày ở nhiệt
độ 30°C và ghi nhận sự xuất hiện của vòng pellicle, màng mỏng trắng đục, cách bề
mặt môi trường từ 2 — 4 mm, vòng này chứng tỏ sự hiện điện của vi khuẩn nội sinh.
- Hút 50 uL dung dịch của vùng này trải sang mơi đường PDA trên đĩa, sau
đó được ủ ở 30°C đề vi khuẩn phát triển. Tiếp tục cấy chuyển vi khuẩn đến khi ròng.
- Độ ròng của vi khuẩn sẽ được kiểm tra bằng cách quan sát đưới kính hiển vi.
Khảo sát tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn
Staphylococcus aureus ATCC25923
iv
t
ix
KET QUA NGHIEN CUU
Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh
Từ rễ, thân, lá và thân ngầm của các mẫu Diếp cá thu được ở các địa điểm
trong nghiên cứu và phân lập được các đòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập
trên môi trường PDA.
Tiến hành đánh giá khả năng tạo vịng pellicle trong mơi trường Nfb bán đặc
nhằm xác định sự hiện diện của các vi khuẩn nội sinh có trong các bộ phận rễ, thân,
lá và thân ngầm của cây Diếp cá. Kết quả cho thấy, vi khuẩn nội sinh hiện diện ở
các bộ phận rễ, thân, lá và thân ngầm của cây Diếp cá, thể hiện qua vịng sáng màu
trắng cách mặt rnơi trường từ 2 — 5 mm.
Đặc tính hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA.
Qua 20 déng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá phân lập được ở Phong Điền có
06 dịng phân lập được từ lá, 09 từ thân và 05 từ rễ, trong đó màu sắc của các dịng
vi khuẩn có màu trắng 01, trắng đục 03, trắng ngà 04 và màu vàng 04, màu vàng
nhạt 08, hình trịn khơng đều là 08, trịn là 12, dạng răng cưa là 04, dạng nguyên 16.
Độ nổi có dạng rhơ là 08 và dạng lài là 12, kích thước khuẩn lạc từ 1 — 3mm.
Phân lập được 21 đòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá phân lập ở Ninh Kiều
có 08 dịng phân lập được từ lá, 07 từ thân và 06 từ rễ, trong đó màu sắc của các
dịng vi khuẩn có trắng đục 01, trắng ngà 11 và màu vàng 04, màn vàng nhạt 05,
hình trịn khơng đều là 06, trịn là 15, dạng răng cưa là 06, dạng nguyên 15, độ nỗi
có dạng mô là 11 và dạng lài là 10.
Tương tự phân lập được 20 dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá ở Bình Thủy
có 06 dịng phân lập được từ lá, 06 từ thân và 08 từ rễ, màu sắc của các dịng vi
khuẩn có trắng đục 02, trắng ngà 07 và màu vàng 07, màu vàng nhạt 04, hình trịn
khơng đều là 04, trịn là 16, dang răng cưa là 04, đạng ngun 16, độ nỗi có dang
mơ là 15 và dạng lài là 05.
<
Đặc điểm tế bào vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
Đặc điểm hình thái, khả năng chuyển động của các dòng vi khuẩn nội sinh
phân lập, được quan sát trên kính hiển vi quang học, độ phóng đại 1000 lần. Kết quả
thê hiện ở
Trong 61 dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá phân lập được có 39 địng có
hình dạng vi khuẩn hình que ngắn là 39 dịng và có 22 dịng vỉ khuẩn hình que dài,
có 28 dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá khi nhuộm bắt màu gram âm và 33 đòng
vi khuẩn gram đương. Tính đi động của vỉ khuẩn nội sinh cây Diếp cá có 06 dịng vi
khuẩn và cịn lại có 55 dịng vi khuẩn khơng có tính đi động.
Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá
Phân lập ở Phong Điền, Bình Thủy và Ninh Kiều của thành phố Cần Thơ
được 61 dong vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá phân lập trên môi trường PDA. Khuẩn
lạc của các địng vi khuẩn có dạng trịn hoặc khơng đều, màu trắng hoặc màu vàng.
Trong đó có 33 dịng vi khuẩn có dạng hình que, gram dương có một số dòng di
động.
Định danh vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25923
Vi khuẩn Saphyloceus aureus phân lập là những vi khuẩn hình cầu, khơng
di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 #m, tế bào xếp thành hình chùm nho.
Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với Iysotaphin, S.azrews là những vi
khuẩn hiểu khí hay ki khí tùy nghi
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn nội sinh cây Diếp
cá với vi khuẩn
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Từ 61 đòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
voi Staphylococcus aureus thu duge 14 dong vi khudn ndi sinh gram dương có hoạt
tinh khang khudn véi vi khudn Staphylococcus aureus ATCC 25923 với vịng vơ
khuẩn từ 10 - 40 mm.
Kết q khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Từ 14 dịng vi khuẩn nội sinh có 03 dịng có hoạt tỉnh kháng khuẩn cao là
PĐT2, BTT4, NKT3, được phân lập từ quận Phong Điện, Ninh Kiều và Bình thủy
vi
nN
a"
của thành phố Cần Thơ để giải trình tự. Kết quả cho thấy ba dong vi khuẩn PĐT2,
BTT4
và NKT3
được nhận diện lần lượt là 8acillus dmyloliquefuciens strain
CD2901, Bacillus megaterium strain 22 va Bacillus subtilis strain 534.
vii
vít
KÉT LUẬN
Từ 61 dịng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá được phân lập từ lá, thân và rễ thu
ở Phong Điền, Bình Thủy và Ninh Kiều của thành phố Cần Thơ có 14 dịng có khả
năng kháng được vi khn S/aphyloccocus aureus ATCC 25923 với vịng vơ khuẩn
từ 10-40 mm trong đó có 03 địng vỉ khuẩn nội sinh cây Diếp cá có hoạt tính kháng
khuẩn
cao
PĐT2,
BTT4
và NKT3
được
nhận
điện
theo
thứ
tự là Bacillus
amyloliquefaciens strain CD2901, Bacillus megaterium strain 22 va Bacillus subtilis
train 534.
Nghiên cứu này là tiền đề cho các nghiên cứu sau vẻ các vi khuẩn nội sinh ở
cây Diếp cá cũng như vi khuẩn nội sinh từ các cây được liệu khác có hoạt tính
kháng khuẩn với các loại vi khuẩn gây bệnh ở người
vii
“=7
=,
PHAN 2. TOAN VĂN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
ix
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
DANH MUC CAC TU VIET TAT
ATP
CFU
ĐC
GNEMM
NFb
nif
OD
WHO
BLAST
Adenosine diphosphate
Adenosine triphosphate
Colony Forming Units
Đối chứng
Glucose Nitrogene Free Mineral Medium
Indole acetic acid
Khối lượng
Nitrogen free Bromothymol
Nitrogen fixing
Optical density
World Health Organization
Basic Local Alignment Search Tool
(Công cụ so sánh trình tự chudi nucleotide)
Colony Forming Dnt
(Đơn vị tính mật số khuẩn lạc)
Đường kính
Deoxyribonueleic acid
(Vật liệu di truyền cấp độ phân tử)
Escherichia coli
Human Immunodeficiency Virus
(virus gây bệnh suy giảm miễn dich ở người )
Herpes simplex virus (Virus gây bệnh mụn rộp)
Indole-3- lactic acid
(Kích thích tố sinh trưởng thực vat, Auxin)
Khuẩn lạc
National Center for Biotechnology Information
(Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học của Mỹ)
Nitrogen fixing bacteria
(Môi trường không đạm NFb)
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen)
Potato dextrose agar
rRNA
S. aureus
(Môi trường dinh dưỡng PDA)
„
Ribosomal ribonucleic acid (RNA tham gia cấu tao Ribosome)
Staphylococcus aureus (Tu cau vang)
vv
DANH MỤC BẢNG
Bang 2. 1. Thành phần môi trường PDA.............................22
-622vk c2 vteLveeELxeevrxesssrrvee 21
Bảng 2. 2. Thành phần môi trường NEb..............................22-55-CcecCCCSzCEEe
Bảng 2. 3. Thành phần dung dich vi lượng.........................--s-222cccscccC2ccseserrrrercee 22
Bảng 2. 4. Thành phần dung địch vitamin.........................---s-ccc2ccegEEAexcrkksvsrxeerrrevee 22
Bảng 2. 5. Địa điểm nơi thu mẫu................................-
...23
Bang 2. 6. Thành phần hóa học cho phản ứng PCR....
-32
Bang 3. 1. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn của cây Diếp cá.............................occcceoscco 34
Bảng 3. 2. Đặc tính hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phận lập môi trường PDA.....35
Bang 3. 3. Đặc điểm hình dạng của vi khuẩn nội sỉnh........................... --cscscccsscerccee 38
Bảng 3. 4. Khảo sát vòng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá với
Staphylococcus qureus A TCC 25923 .........................
uc cán.
42
Bang 3. 5. Kha năng kháng khuẩn của 14 dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá với
Staphylococcus aureus ATCC 2592..........................
«cà HH H1 010801050.11 506 45
Bảng 3. 6. Kết quả giải trình tự của 03 địng vi khuẩn nội sinh
xi
ya
DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1. Cay Di€p C8 .ceescsscssssessssesssssssssscssssesssseessseessscsssseessesssassssssesssseesssessssseessass 20
Hinh 2. 2. Than cay Diép CA...cccscsssssscssssesssessssssscssssssssscssssiesssssssssssessssesssessesesssenses 24
Hình 2. 3. Các bộ phận của cây Diếp cá.................................
...25
Hình 2. 4. Vịng pelliele xuất hiện trong môi trường nuôi day...
...26
Hinh 2. 5. Qui trình phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá............
...26
Hình 2. 6. Vi khuẩn nội sinh nhuộm bắt màu gram dương............................--------: 28
Hình 2. 7. Qui trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn nội sinh
bì.
01...
.......... AM...
30
Hình 2. 8. Qui trình ly trích DNA của vi khuẩn nội sinh............................------s-cccs«e 31
Hình 2. 9. Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCI...........................c series
32
Hình 3. 1. Vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá chụp qua kính hiển vỉ 1
41
Hinh 3. 2. Vi khnan Staphylococcus aureus ATCC25923 chyp qua KHV SEM.....41
Hình 3. 3. Vịng vơ khuẩn khi khảo sát tính kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn nội
Ơn ............âÂâỔỞỞ,.,ộ,,,,,,HL.... 42
Hình 3. 4. Đĩa mơi trường thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh
với Staphylococcus aureus ATCC 25923 ..........................«cà nh
HH ghe 44
xi
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
DAT VAN DE
Quay về với thiên nhiên là xu hướng của thế kỷ XXI. Trong lĩnh vực thuốc
có nguồn gốc từ được liệu ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Trước đây, người ta
thường hiểu chỉ có một số nước phương Đơng như Trung Quốc, Việt Nam,...mới
có nhiều sản phẩm từ thiên nhiên. Thực tế, theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO)
hiện có tới 60% dân số sử đụng các sản phẩm này từ các nước châu Á như Ấn Độ,
Thái Lan đến các nước Châu Phi và Mỹ La Tinh. Việt Nam là nước nhiệt đới gió
mùa, động thực vật phong phú là tiền đề tốt để phát triển các sản phẩm từ dược liệu.
Nguồn được liệu dỗi dào là nền tảng cho việc hình thành các cơ sở sản xuất thuốc từ
được liệu. Theo thống kê của Bộ Y tế, cả nước hiện có hơn 300 cơ sở sản xuất
thuốc từ được liệu trong nước, trong đó có 10 cơ sở đông dược đạt chuẩn thực hành
tốt sản xuất thuốc của WHO. Nhiều cơng ty dược cũng có thương hiệu riêng từ thế
mạnh của cây được liệu.
Trong tự nhiên có rất nhiều lồi thực vật có chứa chất kháng sinh và được sử
dụng từ hàng ngàn năm trước để làm gia vị và bảo quản thực phẩm, cũng như để
điều trị các rối loạn về sức khỏe và để ngăn ngừa bệnh dịch. Các kiến thức về đặc
tính chữa bệnh của thực vật được lưu truyền qua nhiều thế kỷ trong và giữa các
cộng đồng dân cư của nhân loại (Silva và Fernandes Júnior, 2010). Ở các nước
Phương Đơng, các loại thuốc thảo được có lịch sử rất lâu đài; đặc biệt, người Trung
Quốc đã biết sử dụng thảo được và thực vật để điều trị nhiều bệnh khác nhau trong
hơn 8000 năm (Drasar và Moraveova, 2004). Việc sử dụng và tìm kiếm các loại
thuốc có nguồn gốc từ thực vật đã tăng nhanh trong những năm gần đây (Cowan,
1999). Kháng sinh từ thực vật rất bền vững và dễ hịa tan trong nước, nên có thể sử
dụng dưới dạng thuốc sắc là đạng bào chế đơn giản và thơng dụng nhất.
Hiện nay, đữ liệu về hoạt tính kháng khuẩn của nhiều loài thực vật đã được
khẳng định một cách khoa học. Tuy nhiên, trong vài thập kỷ qua, sử dụng thuốc
kháng sinh gặp nhiều trở ngại điển hình như kháng thuốc.
Do đó, nhu cầu tìm ra các loại kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên đang trở nên cấp
bách và rất cần thiết. Chính vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều đến kháng sinh
thực vật và có xu hướng trở lại với cây thuốc hoặc sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên.
Việt Nam với địa hình và khí hậu nhiệt đới, lượng thực vật sử dụng làm thuốc rất
dồi đào đã mở ra triển vọng nghiên cứu các loại thuốc kháng sinh có nguồn gốc tự
nhiên để đáp ứng nhu cầu chữa bệnh trong và ngồi nước.
Trong đó cây Diếp cá có nhiều tác dụng trị bệnh cũng như đã được sử dụng
rất lâu trong lịch sử. Đã có rat nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và công
dụng của cây Diếp cá nhưng những nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh có tính kháng
khuẩn ở cây Diếp cá vẫn chưa được phơ biến.
Chính vì thế, đề tài: “Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp Cá
(Houttuynia cordata Thunh) có hoạt tính kháng khuân với vi khuẩn Sfaphylococcus
aureus ATCC25923 tai Cần Thơ “ được tiến hành.
(ae
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Xác định các đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh của cây diép ca tai Phong
Điền, Bình Thủy và Ninh Kiều của thành phố Cần Thơ.
2. Phân lập và định danh một số vòng vỉ khuẩn nội sinh của cây diép cá có hoạt tính
kháng khuẩn với vi khudn Staphylococcus aureus ATCC 25923 tại Phong Điền, Bình Thủy
và Ninh Kiều của thành phố Cần Thơ.
Chương 1. TỎNG QUAN
Cây Diếp cá cịn có tên là cây giấp cá, ngư tỉnh thảo (Đỗ Tất Lợi, 1999), rau
giấp cá, tập thái, cỏ vảy mèo (Thái), rau ven, phắc hoảy (Tày), cù mua mía (Dao).
Tên nước ngồi là dokudame
(Nhật Bản); E-Sung-Cho
(Hàn Quốc); Khao-tong
hoặc Plu-khao (Thái Lan) (Fu, et al., 2013); Tsi (Anh); Houttuynia (Phap) (D6 Huy
Bich, ctv., 2004). Tén khoa học là Houttuynia cordata Thunb. (Đã Tat Loi, 1999),
1.1. Đặc điểm thực vật cây Diếp cá
Cây Diếp cá là một loại cây thân thảo, mọc lâu năm; ưa chỗ ẩm ướt có thân
rễ mọc ngầm dưới đất, màu trắng. Thân đứng nhẫn, màu lục hoặc tím đỏ. Rễ nhỏ
mọc ở các đốt, thân mọc đứng cao 40 cm, có lơng hoặc ít lơng. Lá mọc cách, hình
tim, đầu lá hơi nhọn hay nhọn hẳn, mặt trên màu lục, mặt dưới màu tím. Hoa nhỏ
màu vàng nhạt, khơng có bao hoa, mọc thành bơng, có 4 lá bắc màu trắng: nhìn tồn
bộ bề ngồi của cụm hoa và lá bắc giống như một cây hoạ đơn độc, toàn cây vị có
mùi tanh như cá. Hoa nở về mùa hạ vào các tháng từ tháng 5 đến tháng 8 (Đỗ Huy
Bich, ctv., 2004, Đỗ Tắt Lợi, 1999).
1.2. Phân bố sinh thái và phân loại
Diếp cá phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á, từ Nhật
Bản, Trung Quốc
đến Việt Nam, Lào, Án
Độ và các nước Đông Nam Á khác (Đã
Huy Bich, ctv., 2004). Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở khắp nơi âm thấp trong nước ta.
Cây thường được trồng ở nhiều nơi để làm rau và làm thuốc, nhân dân thường hái về
ăn kèm. Tồn cây hái về đùng tươi hay phơi khơ hoặc sấy khô (Đỗ Tất Lợi, 1999).
' Phân loại: (Kumar, et al., 2014, Watson va Dallwitz, 1992)
Giới Thực Vật (Plantae)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Hành (Liliopsida)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân Lớp Ngọc Lan (Magnoliidae)
Bộ Hồ Tiêu (Piperales)
Họ Lá Giấp (Saururaceae)
Chi Diếp cá (Houttuynia)
Loài Diếp c4 (Houttuynia cordata Thunb)
1.3. Thành phần hóa học
1.3.1. Tỉnh đầu
Có rất nhiều tỉnh dầu được trích từ tồn thân của cây Diếp cá, chủ yếu cấu
tạo từ terpenoids
(27,0%), hydrocarbons
(16,8%), esters (11,9%), rượu (11,6%),
ketones (7,2%), andehydes (4,9%), acids (3,8%), phenols (1,7 %), ethers (0,9%) va
các hợp chất hén hop (14,2%) (Fu, et al., 2013). Các tỉnh dầu được tìm thấy trong
tồn bộ cây Diếp cá đã được Kumar, e/ ai. (2014) báo cáo lại từ kết quả nghiên cứu
của Tutupalli và Chaubal (1975)
1.3.2. Flavonoid
Một số flavonoid đã được phan lap va xdc dinh tir H. cordata. Quercitrin là
flavonoid dau tiên được chiết xuất từ lá và thân của 7
cordata (Nakamura, et al.,
1936). Diếp cá có chứa thành phần flavonoid hết sức phong phú. Các flavonoid
đáng chú ý trong Diếp cá có thể kể đến như quercetin, quercitrin, isoquercitrin
(Chang, et al., 2001, Kim, et al., 2001). Ngồi ra, cịn có một số flavonoid khác
cũng không kém phần quan trọng:
Quercetin-3-O-B-D-galactosid-7-O-B-D-glucosid.
Quercetin-3-O-a-L-rhamnopyranosyl-7-O-B-D-glucopyranosid
Kaempferol-3-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-B-D-glucopyranosid.
Phloretin-2’-O-B-D-glucopyranosid (phloridzin).
Quercetin-3-O-œ-L-arabinofuranosid (avicularin).
Quercetin-3-O- B-D-galactopyranosid (hyperin).
1.3.3. Alkaloid
Trong thời gian qua, nhiều loại alkaloid được phan tach tir H. cordata, bao
gồm aporphine, pyridine và các loại khac (Fu, et al, 2013). Sáu alkaloid đã được
(Kim, et al. 2001) tìm thấy trong cây Diép cá là aristolactam B, Piperolactam A,
aristolactam A, norcepharadione B, cepharadione B va splendidine. Probstle va cdc
cộng
sự
đã phân
tách
aristolactam
A,
aristolactam
B, pi-perolactam
A
và
norcepharacdione B tir H. cordata. Jong va Jean 1993) đã phân tách 7-chloro-6-
demethyl-cepharadione, alkaloid chuỗi đài được thay thế 3,5-didecanoyl-pyridine,
2-nonyl-5-decanoylpyridine rất hiếm trong tự nhiên và N-methyl-5-methoxy-pyrrolidin-2-one tir loai cay nay (Jong va Jean, 1993, Wang, ef al., 2007). Prébstle, et
al. (1994) da tim và xác định cấu trúc cụ thể sáu alkaloid, trong đó có ba alkaloid va
một triacylbenzyne mới từ cây Diếp cá là:
Ba alkaloid mới là:
3,5-đdidecanoyl-4-nonyl-1,4-dihydropyridine;
3-decanoyl-4-nony]-5-odecanoyl-1,4-dihydropyridine;
3,5-didodecanoyl-4-nonyl-1,4-dihydropyridine
Một triacylbenzene mới là:
1,3,5-tridecanoylbenzene.
1.3.4. Acid hữu cơ và acid béo
Acid palmitic, acid stearic, acid heptanoic, acid nonanoic, acid undecanoic,
acid octanoic,
acid hexanoic,
tetradecanoic,
acid
acid lauric, acid capric, acid heptadecanoic,
tridecanoic,
acid
pentadecanoic,
acid
octadecenoic,
acid
acid
hexadecenoic, acid octadecadienoic, acid aspartic, acid glutamic, acid capric, acid
lauric va acid palmitic trong cây Diếp cá đã được (Choe, e¿ a7. 1989) xác định bằng
sắc ký khí.
Ngồi ra, acid chlorogenic,
acid crypto-chlorogenic,
acid neochlorogenic,
acid quinic và acid caffeic được xác định bằng khối phổ và các mẫu phân mảnh
(Nuengchamnong, e ai., 2009). Chiết xuất acid chlorogenic, phát hiện acid palmitic,
acid linoleic, acid oleic va acid stearic trong phân đoạn benzen (Takagi,
et al.,
1978) . Acid linolenic, linoleic, oleic, palmitic va acid stearic bằng cách kiểm tra
hóa hoc thie vat do (Bauer, et a/., 1996) tim ra.
1.3.5. Sterol
Một số lugng sterol da dugc phan tach ti: H. cordata. Stigmast-4-en-3-one,
3B-hydroxystigmast-5-en- 7-one, 5ơ-stigmastane-3,6-dione và stigmast-4-ene-3,6dione
đã
được
tách
từ
cây
này
(Jong
và
Jean,
1993).
Stigmast-3,6-
dione,
sitoïndoside I và daucosterol đã được phân lập và tỉnh chế từ thân rễ khô của 77
cordata bằng cách chiết xuất dung môi, silicagel và cột sắc ký Sephadex LH-20
(Wang,
et al., 2007).
B-Sitosterol (Jong va Jean, 1993, Takagi,
et al., 1978), B-
sitosterol glucoside (Jong va Jean, 1993), brassicasterol, stigmasterol, spinasterol
(Fu, et al., 2013), and stigmast-4-ene-3,6-dione (Bauer, et al., 1996) cling dugc tim
thấy ở loại cây này.
1.3.6. Cac acid amin va nguyén t6 vi lượng
HH. cordafa chứa hơn 20 acid amin, trong đó có alạnin, valin, acid glutamic,
acid aspartic, isoleucine, proline, leucine, glycine, serine, lysine, cystine, tyrosine,
methionine,
phenylalanine,
histidine,
threonine,
Tryptophane,
arginine,
hydroxyproline va citrulline (Choe, et al., 1989, Mori, et al., 1995). Cac thanh phan
chinh 1a alanin, valin, acid glutamic, acid aspartic, isoleucine, leucine proline (Choe,
et al., 1989). Trong số tẤt cả các acid amin, hàm lượng acid glutamic là cao nhất,
tiếp theo leucine va acid aspartic (Mori, et al., 1995). Nhiéu vi chat bao gdm sit,
magié, mangan, kali, đồng, kẽm và canxi... ở trong H. cordata (Gong va Cheng,
2004, Mori, ef al., 1995).
1.3.7. Các thành phần khác
Nước: 91,5%, protid: 2,9%, glucid: 2,7%, lipid: 0,5%, cellulose:1,8%, Calci:
0,3mg, Kali: 0,1 mg, tiền vitamin A: 1,26 mg, vitamin C: 68 mg (trong 100 g rau
Diếp cá tuoi) (DS Tat Loi, 1999).
N-phenethyl-benzamide, glyceryl linoleate va n-butyl- o-D-fructopyranoside
được tách và tỉnh sạch từ thân rễ khé cha H. cordata bằng cách chiết xuất dung môi,
silica gel và cột sắc ký Sephadex LH-20 (Wang, e ai., 2007). Vomifoliol, sesamin
và 1,3,5-tridecanoylbenzene được tách từ các bộ phan 6 trén cha H. cordata. 1,3,5tride- canoylbenzene cũng đã được tách chiét (Jong va Jean, 1993).
Chou
mô
tá đặc
điểm
hydroxyphenylthyl
methoxybenzamide;
của N-1-hydroxymethyl-2-phenylethyl
benzamide;
benzamide;
4-hydroxybenzamide;
6,7-dimethyl-1-ribitol-1-yl-1;
N-4-
4-hydroxy-3-
4-dihydroquinoxaline-2,3-dione;
(1H)-quinolinone; acid indole-3-carboxylic; dihydrovomifoliol,; reseoside; benzylB-D-glucopyranoside và cycloari-25-ene-3,24-diol từ #. cordafa sử dung NMR 1D
và 2D và phổ khối lượng (Fu, ef a, 2013). Các carotenoid được quan sát ở H.
cordata. Lượng -carotene và violaxathin tương đối cao trong giai đoạn có lá mầm
và giảm trong giai đoạn đậu quả, trong khi lượng lutein thấp trong giai đoạn có lá
mam va dan dan tang lên cùng với sự phat trién (Mori, ef al., 1995).
1.4. Công dụng
1.4.1. Tác dụng kháng khuẩn
(Lu, eí a/. 2006) đã khảo sát tính kháng khuẩn của tỉnh dầu cây Diếp cá trên
hai ching vi khudn Stapphylococcus areus va Sarcina ureae va két luận tỉnh dầu
cây Diếp cá cho thấy khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn trên. (Shan, et al. 2007)
đã khảo sát tính kháng khuẩn của dịch trích các loại thảo được trên năm loại vi
khuẩn
gây
ngộ
Staphylococcus
Houttuynia
độc
aureus,
thực
phẩm
Escherichia
(Pacllus
coli,
va
cereus,
Listeria
Salmonella
monocytogenes,
anatum),
dich
trich
cordata cho thay tính kháng khuẩn trên các vi khuẩn B. cereus, S.
aureus.
Dich trich ctia H.cordata cho thay kha ning khang khudn chéng lai ching
Sabnonelia lây lan do chuột. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch trích Ư. cordata cũng
được khao sat trén Salmonella enterica serovar (Salmonella typhimurium) (Kumar,
et al., 2014). Houttuynin (decanoyl acetaldehyde), mét hop chat B-dicarbonyl, duoc
báo cáo là thành phần chính trong tinh dau cia H. cordata có tác dụng kháng khuẩn
(Duan, ef a/., 2008). Houttuynin sodium bisulphate (HSB), o-hydroxyl-capryl-ethylsodium-sulphonafe, là một sản phẩm
được tạo thành bởi phản ứng giữa sodium
bisulphate với houttuynin, được thu từ cây Diếp cá Jowfuymia cordata Thunb. có
khả năng ức chế hoạt động của các vi khuẩn như Escherichia coli, Staphylococcus
aureus (Kokoska va Rada, 2000).
