BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

NGUYỄN THỊ MINH HIẾU

XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH
VI KHUẨN VÀ KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ TỰ ĐỘNG TRÊN

H
P

THIẾT BỊ BD PHOENIXTM M50 TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA
TRUNG TÂM AN GIANG

U

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC
MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601

H

HÀ NỘI – 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

NGUYỄN THỊ MINH HIẾU

XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH
VI KHUẨN VÀ KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ TỰ ĐỘNG TRÊN

H
P

THIẾT BỊ BD PHOENIXTM M50 TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA
TRUNG TÂM AN GIANG

U

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC
MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601

H

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN MINH CHÂU

HÀ NỘI – 2022


i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt q trình học tập và hồn thành luận văn này, bên cạnh nỗ
lực của bản thân, tôi đã nhận được sự quan tâm, hỗ trợ và sự động viên từ các
quý thầy/cô, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Lời đầu tiên, tơi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Y
tế Công cộng, phòng Quản lý đào tạo sau đại học đã tạo điều kiện và giúp đỡ
tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.

Xin cảm ơn quý thầy/cô đã tận tình hướng dẫn tơi trong suốt q trình
học tập, nghiên cứu. Đặc biệt, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và trân trọng đến

H
P

TS. Trần Minh Châu và ThS. Nguyễn Thị Thanh Nhiệm là những người đồng
hành với tất cả lịng nhiệt huyết đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp cho tôi
hiểu được rất nhiều kiến thức, kỹ năng để tơi có thể hồn thành luận văn này.
Sau cùng, tơi xin cảm ơn đến gia đình đã ln dành cho tôi tất cả sự tin
tưởng, yêu thương, động viên, khích lệ và chia sẻ khó khăn trong suốt thời

U

gian qua.

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!

H


ii

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .....................................................................................3
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................4
1.1

Định danh vi khuẩn ...........................................................................................4


1.1.1 Khái niệm ..........................................................................................................4
1.1.2 Định danh sơ bộ bằng hình thái vi khuẩn, khuẩn lạc ........................................4
1.1.3 Định danh vi khuẩn bằng tinh chất sinh vật hóa học ........................................4
1.1.4 Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật miễn dịch ....................................................9
1.1.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử .................................9

H
P

1.1.6 Định danh bằng phương pháp khối phổ ..........................................................10
1.2

Kháng sinh đồ ..................................................................................................11

1.2.1 Khái niệm ........................................................................................................11
1.2.2 Các phương pháp thực hiện kháng sinh đồ .....................................................12
1.3

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp .....................................................18

U

1.3.1 Định nghĩa xác nhận giá trị sử dụng phương pháp..........................................18
1.3.2 Mục đích của xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp ...............................19
1.3.3 Các thông số xác nhận giá trị sử dụng trong nghiên cứu ................................19

H

1.4


Các nghiên cứu tương tự: ................................................................................20

1.5

Sơ lược về Bệnh viện Đa Khoa Trung Tâm An Giang ...................................21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................23
2.1

Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................23

2.2

Thời gian thu thập số liệu và địa điểm nghiên cứu: ........................................24

2.3

Thiết kế nghiên cứu .........................................................................................24

2.4

Cỡ mẫu ............................................................................................................24

2.4.1 Mục tiêu 1 ........................................................................................................24
2.4.2 Mục tiêu 2 ........................................................................................................24
2.5

Phương pháp thu thập ......................................................................................25


2.6

Xử lý số liệu ....................................................................................................25

2.7

Các khái niệm, quy trình kỹ thuật thực hiện: ..................................................25


iii

2.7.1 Mẫu ..................................................................................................................25
2.7.2 Vật liệu và thiết bị nghiện cứu ........................................................................26
2.8

Kiểm tra chất lượng .........................................................................................27

2.8.1 Mục tiêu 1 ........................................................................................................28
2.8.2 Mục tiêu 2 ........................................................................................................28
2.9

Tiêu chuẩn chấp nhận hệ thống AST mới .......................................................28

2.9.1 Định danh ........................................................................................................28
2.9.2 Kháng sinh đồ ..................................................................................................28
2.10 Đạo đức nghiên cứu.........................................................................................30
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................................31
3.1

H

P

Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định danh trên thống tự

động BD PhoenixTM M50 tại phòng xét nghiệm .......................................................31
3.1.1 Kết quả QC định danh .....................................................................................31
3.1.2 Độ chính xác của phương pháp định danh vi khuẩn .......................................32
3.1.3 Độ tái lặp của phương pháp định danh vi khuẩn .............................................34

U

3.1.4 Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định danh vi
khuẩn .........................................................................................................................36
3.2

Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp kháng sinh đồ trên hệ

H

thống tự động BD PhoenixTM M50 tại phòng xét nghiệm.........................................37
3.2.1 Kết quả QC của kháng sinh đồ ........................................................................37
3.2.2 Độ chính xác của kháng sinh đồ ......................................................................40
3.2.3 Độ tái lặp của kháng sinh đồ ...........................................................................44
Chương 4 BÀN LUẬN ............................................................................................48
4.1

Định danh vi khuẩn .........................................................................................48

4.2


Kỹ thuật kháng sinh đồ ....................................................................................49

Chương 5 KẾT LUẬN ............................................................................................53
Chương 6 KHUYẾN NGHỊ ...................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55
PHỤ LỤC .................................................................................................................57


iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATCC :

American Type Culture Collection (Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mỹ)

AST

Antimicrobial Susceptibility Testing (Thử nghiệm xác định mức độ

:

nhạy cảm kháng sinh)
API

:

Analytical profile index

BYT


:

Bộ Y tế

CA

:

Categorical Agreement (Đồng thuận loại)

CLSI

:

Clinical & Laboratory Standard Institute (Viện chuẩn thức về lâm
sàng và xét nghiệm Hoa Kỳ)

ĐKTT :

Đa khoa trung tâm

EA

:

Essential Agreement (Đồng thuận về giá trị)

EQA

:


External Quality Assessment (Ngoại kiểm tra chất lượng)

FDA

:

Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm

H
P

Hoa Kỳ)
I

:

Intermediate (Trung gian)

ID

:

Identification (Định danh)

IQC

:

Internal Quality Control (Nội kiểm tra chất lượng)


KSĐ

:

Kháng sinh đồ

ME

:

Major error (Sai sót lớn)

mE

:

Mini error (Sai sót nhỏ)

MIC

:

Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

NID

:

Negative Identification (Định danh gram âm)


NMIC :

U

H

Negative Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối
thiểu gram âm)

PCA

:

Precision Categorical Agreement (Tỷ lệ trùng khớp về kết quả định
danh)

PEA

:

Precision essential agreement (Tỷ lệ trùng khớp về giá trị MIC)

PID

:

Positive Identification (Định danh gram dương)

PMIC


:

Positive Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu


v

gram dương)
PPSS

:

Phương pháp so sánh

QA

:

Quality Assessment (Đảm bảo chất lượng)

QC

:

Quality control (Kiểm soát chất lượng)

QĐ

:


Quyết định

R

:

Resistan (Đề kháng)

S

:

Sensitivity (Nhạy cảm)

SIR

:

Sensitivity- Intermediate-Resistan (Nhạy-Trung gian-Kháng)

VME

:

Very major errors (Sai sót rất lớn)

VSV

:


Vi sinh vật

H

U

H
P


vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Chủng vi sinh vật thực hiện QC cho từng loại bảng ................................23
Bảng 2.2: Mẫu thực hiện nghiên cứu ........................................................................26
Bảng 3.1: Kết quả QC định danh vi khuẩn ...............................................................31
Bảng 3.2: Độ chính xác của phương pháp định danh vi khuẩn gram âm .................32
Bảng 3.3: Độ chính xác của phương pháp định danh vi khuẩn gram dương ............33
Bảng 3.4: Độ tái lặp của phương pháp định danh vi khuẩn gram âm .......................34
Bảng 3.5: Độ tái lặp của phương pháp định danh vi khuẩn gram dương .................35
Bảng 3.6: Kết quả xác nhận phương pháp định danh vi khuẩn ................................36

H
P

Bảng 3.7: Kết quả QC của kháng sinh đồ gram âm ..................................................37
Bảng 3.8: Kết quả QC của kháng sinh đồ gram dương ............................................38
Bảng 3.9: Độ chính xác của kháng sinh Amikacin trên vi khuẩn gram âm ..............40
Bảng 3.10: Bảng tóm tắt kết quả độ chính xác của kháng sinh đồ gram âm ............41

Bảng 3.11: Kết quả xác định độ chính xác cho thử nghiệm kháng sinh

U

Cefoxitin trên vi khuẩn gram dương .........................................................................42
Bảng 3.12: Bảng tóm tắt kết quả độ chính xác của kháng sinh đồ gram dương .......43
Bảng 3.13: Độ tái lặp của kháng sinh Amikacin trên vi khuẩn gram âm .................44

H

Bảng 3.14: Bảng tóm tắt kết quả độ tái lặp của kháng sinh đồ gram âm ..................45
Bảng 3.15: Kết quả độ tái lặp của thử nghiệm kháng sinh Cefoxitin trên vi
khuẩn gram dương.....................................................................................................46
Bảng 3.16: Tóm tắt kết quả độ tái lặp của kháng sinh đồ gram dương ....................47


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Phản ứng lên men ........................................................................................5
Hình 1.2: Phản ứng Catalase .......................................................................................5
Hình 1.3: Phản ứng Oxidase .......................................................................................6
Hình 1.4: Phản ứng Coagulase ....................................................................................6
Hình 1.5: Phản ứng CAMP .........................................................................................7
Hình 1.6: Định danh bằng phương pháp API 20, A-API 20 E và B-API 20 NE ........8
Hình 1.7: Máy định danh vi khuẩn MALDI-TOF MS ..............................................11
Hình 1.8: Kết quả kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán .......................................13
Hình 1.9: Kết quả kháng sinh đồ phương pháp ETest ..............................................14

H

P

Hình 1.10: Pha lỗng kháng sinh đồ khuếch tán .......................................................14
Hình 1.11: Hệ thống Vitek® 2 Compact (bioMérieux, USA) ..................................15
Hình 1.12: Thẻ kháng sinh đồ dùng trong Vitek.......................................................16
Hình 1.13: Minh họa cách đưa ra kết quả MIC của Vitek ........................................16
Hình 1.14: Máy định danh và kháng sinh đồ vi khuẩn BD PhoenixTM M50 ............17

U

Hình 1.15: Thẻ và hóa chất sử dụng trong hệ thống BD Phoenix™ M50 ................18

H


viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ........................................................................27

H
P

H

U


ix


TĨM TẮT
Hiện nay tại Việt Nam, hệ thống phịng xét nghiệm y tế phải đáp ứng yêu cầu
về 12 thành tố trong quản lý chất lượng xét nghiệm theo quyết định 2429/QĐ-BYT
ngày 12/6/2017 ban hành “Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y
học”. Đảm bảo chất lượng xét nghiệm là một trong những thành tố quản lý chất
lượng, là các biện pháp được thực hiện nhằm phát hiện, đánh giá và ngăn ngừa các
sai sót có thể xảy ra trong tồn bộ q trình xét nghiệm gồm ba giai đoạn trước xét
nghiệm, xét nghiệm và sau xét nghiệm. Xác nhận giá trị sử dụng là một phần của
đảm bảo chất lượng, là quá trình kiểm tra xác nhận để đảm bảo việc thực hiện khi
hệ thống mới đưa vào sử dụng tại phòng xét nghiệm.

H
P

Hệ thống BD PhoenixTM M50 là thiết bị tự động được FDA công nhận và sử
dụng tại Hoa Kỳ và cũng được sử dụng rộng rãi ở Châu Âu. Hệ thống này xác định
được nhiều loại vi khuẩn gram âm và gram dương. Hệ thống có các cơng cụ, phần
mềm, bảng điều khiển dùng một lần để định danh vi khuẩn và xác định tính nhạy
cảm của vi khuẩn với kháng sinh. Hệ thống này như một giải pháp hiệu quả để góp

U

phần cung cấp kết quả định danh và kháng sinh đồ chính xác kịp thời cho các bác sĩ
lâm sàng điều trị bệnh nhân, giảm thiểu tình trạng sử dụng kháng sinh không phù
hợp trên lâm sàng cũng như hạn chế sự gia tăng tình trạng đề kháng kháng sinh

H

trong quần thể vi khuẩn. Các nghiên cứu và hiệu suất của thiết bị đã được đanh giá
và xác định, tuy nhiên sự quan tâm của người sử dụng là khả năng áp dụng của hệ

thống tại các địa điểm khác nhau có đảm bảo chất lượng giống nhay hay khơng ?
Chính vì những lý do này khi bệnh viện nhận được hệ thống BD PhoenixTM
M50 chúng tôi tiến hành đánh giá sự phù hợp của thiết bị trước khi đưa vào sử dụng
với mục tiêu thứ nhất là “Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định danh vi
khuẩn trên hệ thống tự động BD PhoenixTM M50” và mục tiêu thứ hai là “Xác nhận
giá trị sử dụng của kỹ thuật kháng sinh đồ trên hệ thống tự động BD PhoenixTM
M50”.
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phù hợp về kết quả định danh vi khuẩn giữa
thiết bị BD Phoenix M50 so với phương pháp tham chiếu Malditof có sự đồng


x

thuận về cấp độ chi và loài CA 100%. Trong khi đó, sự phù hợp về kỹ thuật kháng
sinh đồ giữa thiết bị BD PhoenixTM M50 so với phương pháp tham chiếu khoanh
giấy khuếch tán có tỷ lệ đồng thuận về giá trị PEA và đồng thuận về loài PCA cũng
đạt 100%; bên cạnh đó khơng có lỗi nặng VME nào xuất hiện, các lỗi vừa ME và
lỗi nhẹ mE với tỷ lệ 0.47 % và 3.53% ở vi khuẩn gram âm, trong khi ở vi khuẩn
gram dương là 1.15% và 2.08%.
Hệ thống BD PhoenixTM M50 đã cho thấy hiệu suất đáng tin cậy đối với
phương pháp định danh vi khuẩn và kỹ thuật kháng sinh đồ tự động trong phòng xét
nghiệm vi sinh lâm sàng tại Bệnh viện đa khoa trung tâm An Giang để định danh vi
khuẩn và phát hiện tính nhạy cảm của các chủng vi khuẩn gram âm và gram dương

H
P

với với các loại kháng sinh đang được sử dụng tại đơn vị.

H


U


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Định danh vi khuẩn là dùng các phương pháp khác nhau để xác định chính xác
tên lồi vi khuẩn (1), và kháng sinh đồ là phương pháp để xác định mức độ nhạy cảm
của một loại vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh (1, 2). Chính vì thế việc định danh
chính xác lồi vi khuẩn và xác định tinh nhạy cảm của chúng đối với kháng sinh đóng
vai trò quan trọng trong lựa chọn phác đồ kháng sinh để điều trị và giám sát sự đề
kháng kháng sinh của vi khuẩn cũng như giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp và
đưa ra phương pháp điều trị tốt nhất cho bệnh nhân.
Ngày nay, việc xây dựng và phát triển các phòng xét nghiệm đảm bảo chất lượng
trong lĩnh vực chẩn đốn là cần thiết trong q trình điều trị cho người bệnh trong các

H
P

cơ sở khám chữa bệnh theo tiêu chuẩn ISO 15189 (3) và quyết định 2429/QĐ-BYT
ngày 12/6/2017 ban hành Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học
(4). Hệ thống phòng xét nghiệm y tế phải đáp ứng yêu cầu về 12 thành tố trong quản lý
chất lượng xét nghiệm. Đảm bảo chất lượng xét nghiệm là một trong những thành tố
quản lý chất lượng, là các biện pháp được thực hiện nhằm phát hiện, đánh giá và ngăn

U

ngừa các sai sót có thể xảy ra trong tồn bộ q trình xét nghiệm gồm ba giai đoạn
trước xét nghiệm, xét nghiệm và sau xét nghiệm (3, 4). Xác nhận giá trị sử dụng

phương pháp là một phần của đản bảo chất lượng xét nghiệm, là việc kiểm tra xác

H

nhận để đảm bảo việc thực hiện khi hệ thống mới đưa vào sử dụng tại phòng xét
nghiệm.

Hệ thống BD PhoenixTM M50 là thiết bị tự động được FDA công nhận và sử
dụng tại Hoa Kỳ và cũng được sử dụng rộng rãi ở Châu Âu. Hệ thống này xác định
được nhiều loại vi khuẩn gram âm và gram dương. Hệ thống có các công cụ, phần
mềm, bảng diều khiển dung một lần để định danh vi khuẩn và xác định tính nhạy cảm
của vi khuẩn với kháng sinh. Phương pháp đinh danh vi khuẩn bằng cách sử dụng chất
nền, chất tạo fluoro và chất tạo màu. Thiết bị có thể phân tích đồng thời 100 thẻ kết
hợp ID và AST trên các tấm thử dung một lần chứa 136 giếng pha loãng vi mơ có sẳn
xác định ID, ID/AST và AST; các thẻ này được đọc 20 phút 1 lần (5). Hệ thống này
như một giải pháp hiệu quả để góp phần cung cấp kết quả định danh và kháng sinh đồ
chính xác kịp thời cho các bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh nhân, giảm thiểu tình trạng sử


2

dụng kháng sinh không phù hợp trên lâm sàng cũng như hạn chế sự gia tăng tinh trạng
đề kháng kháng sinh trong quần thể vi khuẩn. Tuy nhiên, sự quan tâm của người sử
dụng là hệ thống này có đảm bảo chất lượng như nhà sản xuất cung bố hay khơng khi
được sử dụng tại các phịng xét nghiệm khác nhau? Do đó, khi bệnh viện nhận được hệ
thống BD PhoenixTM M50, chúng tôi tiến hành đánh giá sự phù hợp của thiết bị và
phòng xét nghiệm, việc này được gọi là xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp.
Trên cơ sở này, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiện cứu “Xác nhận giá trị sử dụng
của phương pháp định danh vi khuẩn và kỹ thuật kháng sinh đồ tự động trên
thiết bị BD PhoenixTM M50 tại Bệnh viện Đa khoa trung tâm An Giang”.


H
P

H

U


3

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định danh vi khuẩn trên hệ thống tự
động BD PhoenixTM M50.
2. Xác nhận giá trị sử dụng của kỹ thuật kháng sinh đồ trên hệ thống tự động BD
PhoenixTM M50.

H
P

H

U


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Định danh vi khuẩn

1.1.1 Khái niệm
Định danh vi khuẩn là là dùng các phương pháp khác nhau dế xác định chính xác
tên lồi vi khuẩn.
Các phương pháp định danh vi khuẩn:
1.1.2 Định danh sơ bộ bằng hình thái vi khuẩn, khuẩn lạc
Nguyên lý: dựa vào hình thái cơ bản của vi khuẩn như hình dáng, kích thước,
màu sắc để xác định vi khuẩn (1, 6, 7).

H
P

Ý nghĩa lâm sàng: dựa vào hình thái định hướng cho việc định danh vi khuẩn.
Ưu điểm: dễ thực hiện.

Nhược điểm: chỉ xác định được hình thái của vi khuẩn.

1.1.3 Định danh vi khuẩn bằng tinh chất sinh vật hóa học

Ngun lý: dựa vào tính chất sinh vật hóa học của vi sinh vật (1, 6, 7).

U

Thử nghiệm khả năng lên men: thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn Cacbon,
hydro của các VSV, dựa trên nguyên tắc các VSV sử dụng C,H tạo acid giảm pH môi
trường. Các loại carbonhydrate được sử dụng như monocarbonhydrate (glucose,

H

xylose, rhamnose…), dicarbonhydrate (sucrose, lactose…), polycarbonhydrate (tinh
bột, cellulose), các loại đường khử như đường mono chứa chức –CHO, các loại đường

rượu như chứa chức -OH. VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm
giảm pH dẫn đến thay đổi màu chất chỉ thị phenolred. Phản ứng (+): môi trường
chuyển vàng và phản ứng (-): mơi trường có màu đỏ (1, 6-8).


5

Hình 1.1: Phản ứng lên men
Thử nghiệm Catalase: nhằm phân biệt tụ cầu và liên cầu. Dựa trên nguyên tắc

H
P

Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí khơng bắt buộc. Sau khi H2O2 tiếp
xúc với khóm vi khuẩn, nếu có hiện tượng sủi bọt xảy ra lặp tức: catalase (+), nếu
khơng có hiện tượng sủi bọt xảy ra: catalase (-) (1, 6-8).

U

H

Hình 1.2: Phản ứng Catalase

Thử nghiệm Oxidase: nhằm phát hiện khả năng sinh enzyme oxidase (hệ enzyme
cytochrome C) của vi khuẩn. Enzyme này đặc trưng cho loài Neisseria và hầu hết các
loài Pseudomonas. Cho phép phân biệt các trực khuẩn gram (-). Thực hiện thử nghiệm
bằng cách làm ướt thanh giấy lọc đã được sấy vô khuẩn từ trước bởi dung dịch oxidase
(tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochlorride), lấy ăng cấy nhựa gặt một khuẩn lạc
(khóm) nghi ngờ và quệt lên thanh giấy đã tẩm dung dịch oxidase, nếu vùng giấy được
quệt vi khuẩn chuyển màu tía (đỏ tím) được đọc là dương tính (vi khuẩn có

cytochrome oxidase - là một thành phần trong chuỗi hô hấp của vi khuẩn); nếu vùng
giấy được quệt vi khuẩn có màu vàng được đọc là âm tính (1, 6-8).


6

Hình 1.3: Phản ứng Oxidase
Thử nghiệm Coagulase: nhằm phân biệt tụ cầu vàng và các tụ cầu khác, là bước
cuối cùng trong định danh các giống Staphylococcus. Thực hiện thử nghiệm bằng cách
lấy 1mL huyền dịch vi khuẩn cho vào ống huyết tương thỏ đông khô, trộn đều bằng
cách xoay nhẹ cho tan hồn tồn, khơng được lắc mạnh; ủ ở 35-370C trong 4 giờ quan

H
P

sát có xuất hiện khối đông hay không bằng cách nghiêng nhẹ ống nghiệm để xem có
sự hình thành khối đơng hay khơng. Nếu sau 4 giờ khơng có hình thành khối đơng thì
tiếp tục ủ 35-370C và quan sát sự hình thành khối đơng sau 8, 12, 24 giờ (1, 6, 7).

U

H

Hình 1.4: Phản ứng Coagulase

Thử nghiệm CAMP: nhằm xác định khả năng cộng hưởng tan huyết giữa các
VSV và phân biệt Streptococcus nhóm B với Streptococcus nhóm khác; dựa trên cơ sở
S. aureus tiết β-lysin gây tan hồng cầu. Khi có S. aureus gây tán huyết, phản ứng
CAMP dương tính, cịn các loại vi sinh vật khác CAMP âm tính (1, 6-8).



7

Hình 1.5: Phản ứng CAMP
Thử nghiệm API: thanh Api 20 gồm có 20 giếng nhỏ có chất nền, khi cho canh
khuẩn vào và ủ ở 370 C trong 18 – 24 giờ, sự trao đổi chất trong quá trình ủ sẽ trực tiếp

H
P

làm đổi màu môi trường hoặc sau khi đã cho thêm hóa chất thích hợp. Ý nghĩa lâm
sàng: API 20 là một hệ thống chuẩn để định danh những trực khuẩn ngoài đường ruột,
và các gram âm dễ nuôi cấy (Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium,
Moraxella, Vibrio…) kết hợp giữa 8 test thường quy, 12 test đồng hóa. Các thử
nghiệm này nhằm xác định các tính chất lên men và xác định các enzyme có mặt trong

U

vi khuẩn. Dựa vào kết quả của các thử nghiệm và cơ sở dữ liệu của hệ thống API, ta
xác định được căn nguyên cần tìm. Phương pháp định danh API giúp nâng cao độ
chính xác của kết quả xét nghiệm và rút ngắn thời gian định danh (1, 6, 7).

H


8

H
P


Hình 1.6: Định danh bằng phương pháp API 20, A-API 20 E và B-API 20 NE
Phương pháp tự động: dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh
vật, hóa học của vi sinh vật thơng qua sự thay đổi màu sắc của các giếng mơi trường

U

có sẵn trong thẻ định danh. Kỹ thuật thực hiện: Vi khuẩn sau khi nuôi cấy ở 37°C
trong 18 – 24 giờ (hoặc lâu hơn tùy theo từng loại vi khuẩn) được hòa trong 3ml nước
muối 0.45% để tạo huyền dịch đồng nhất có độ đục theo yêu cầu đối với từng loại vi

H

khuẩn, sau đó được máy hút vào thẻ xét nghiệm chứa các tính chất sinh vật hóa học.
Máy sẽ giám sát sự phát triển và hoạt tính của vi sinh vật bên trong các giếng của thẻ
xét nghiệm. Bộ phận quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để đánh giá trực tiếp sự
phát triển của vi sinh vật. Bộ phận quang học này dựa trên đọc ánh sáng ban đầu của
mỗi giếng trước khi bắt đầu có sự phát triển. Máy đọc 15 phút/ lần để đo sự phát triển
của vi khuẩn trong mỗi giếng. Phần mềm so sánh kết quả thu được với cơ sở dữ liệu để
đưa ra kết quả . Ý nghĩa lâm sàng: giúp nâng cao độ chính xác của kết quả xét nghiệm
và rút ngắn thời gian định danh. Phương pháp định danh tự động cho kết quả sớm hơn
và có thể lưu trữ, phân tích và kết nối dữ liệu hệ thống; tuy nhiên hạn chế số lượng vi
sinh vật và chi phí cao, chỉ được áp dụng tại các phịng xét nghiệm hiện đại (1, 6, 7).


9

1.1.4 Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật miễn dịch
Kỹ thuật ngưng kết hạt dựa trên nguyên lý một loại hạt (hạt nhựa, các hạt gelatin,
vi khuẩn) được kết hợp với một thuốc thử kháng nguyên hoặc kháng thể, nếu kháng
thể hoặc kháng nguyên mục tiêu có mặt trong bệnh phẩm, nó sẽ liên kết chéo các hạt,

tạo ra sự kết hợp có thể đo lường được. các kỹ thuật: ngưng kết latex, ngưng kết kết
hợp. Kỹ thuật này cho kết quả nhanh tuy nhiên lại ít nhạy (1, 6, 7).
Kỹ thuật kết tủa thực hiện theo nguyên lý đo kháng nguyên hoặc kháng thể trong
dịch cơ thể theo mức độ kết tủa của các phức hợp kháng nguyên kháng thể trong gel
(agarose) hoặc trong dung dịch. Các kỹ thuật thực hiện gồm tán xạ kép Ouchterlony,
counterimmunoelectrophoresis, … Kỹ thuật này cho kết quả nhanh, tuy nhiên độ nhạy

H
P

thấp, ứng dụng của chúng có giới hạn (1, 6, 7).

Kỹ thuật miễn dịch enzym dựa trên nguyên lý kháng nguyên và kháng thể. Các
kỹ thuật thực hiện như miễn dịch men (EIA) và xét nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết
enzyme (ELISA). Kỹ thuật này có độ nhạy cao nhưng có thể bị thay đổi (1, 6, 7).
Kỹ thuật kết hợp bổ thể dựa trên nguyên lý kháng nguyên và kháng thể. Kỹ thuật

U

này độ chính xác cao, sử dụng để chẩn đoán một số nhiễm trùng do virus và nấm, đặc
biệt là nấm coccidioidomycosis; tuy nhiên ứng dụng hạn chế vì địi hỏi nhiều cơng lao
và kiểm sốt (1, 6, 7).

H

Kỹ thuật Western Blotting dựa theo nguyên lý các kháng thể kháng vi khuẩn
trong mẫu bệnh phẩm của người bệnh (ví dụ như huyết thanh, dịch cơ thể khác) bằng
phản ứng của chúng với các kháng nguyên đích (ví dụ các thành phần virus) đã bị vơ
hiệu hóa trên màng bằng cách thấm máu. Các kỹ thuật thực hiện miễn dịch dải (LIA),
tái tổ hợp (RIBA). Kỹ thuật này có độ đặc hiệu cao, nhưng độ nhạy lại thấp (1, 6, 7).

1.1.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử
Kỹ thuật lai acid nucleic dựa trên nguyên lý lai axit nucleic (nucleic acid
hybridization) là phương pháp tạo ra một chuỗi kép gồm hai mạch polynucleotid ổn
định, từ hai chuỗi đơn tự do và khác nhau, dựa vào các liên kết hydro giữa các cặp
base hình thành giữa hai chuỗi đơn ban đầu theo nguyên tắc bổ sung. Phương pháp
này thực chất là kỹ thuật gắn kết hai chuỗi polynucleotid khác nhau để tạo ra phân
tử axit nucleic lai có hai mạch. Kỹ thuật lai có thể được thực hiện giữa hai chuỗi đơn


10

cùng loại hoặc khác loại, tuỳ theo mục đích mong muốn, gồm ba kiểu: lai DNA với
DNA, lai DNA với RNA, lai RNA với RNA. Kỹ thuật thực hiện là In-solution
hybridization. Phương pháp này xác định chính xác vi sinh vật nhờ vào probe, tuy
nhiên chỉ được thực hiện tại các phòng xét nghiệm hiện đạị (1, 6, 7).
Kỹ thuật khuếch đại dựa theo nguyên lý nhân lên gấp hàng triệu lần một đoạn
ADN chọn lọc trong thời gian ngắn trong mơi trường in vitro giống như q trình phân
bào. Các phương pháp thực hiện: PCR, RT-PCR, Multiplex PCR, Nested PCR. Kỹ
thuật này xác định chính xác vi sinh vật nhờ vào các bộ mồi, nhưng chi phí cao, chỉ
được thực hiện tại các phòng xét nghiệm hiện đạị (1, 6, 7).
Kỹ thuật giải trình tự: dựa trên nguyên lý xác định sự thay đổi trình tự các

H
P

nucleotide để tìm kiếm các đột biến đặc hiệu trong cấu trúc di truyền của men sao chép
ngược/ AND polymerase và men protease. Các phương pháp thực hiện: phương pháp
Sanger, phương pháp Next-generation sequencing. Kỹ thuật này xác định được vi sinh
vật nhờ vào trình tự bộ gen của từng lồi, tuy nhiên chi phí cao, chỉ được thực hiện tại
các phịng xét nghiệm hiện đạị (1, 6, 7).


U

1.1.6 Định danh bằng phương pháp khối phổ

Ngun lý: mỗi lồi sinh vật đều có thành phần các protein trong ribosom rất đặc
trưng cho riêng lồi đó, gọi là dấu ấn phân tử (molecular fingerprint) của lồi. Máy

H

MALDI Biotyper sử dụng cơng nghệ MALDI-TOF MS để gây ion hóa và thu nhận
các protein/ peptide từ mẫu cần định danh, sau đó biểu diễn chúng ở dạng một phổ
khối lượng (hay còn gọi là khối phổ). Bằng cách so sánh khối phổ thu được với các
phổ tham chiếu có sẵn trong thư viện dữ liệu, máy MALDI Biotyper sẽ cho kết quả
định danh chính xác lồi vi sinh vật. Phương pháp định danh MALDI TOF MALDI
Biotyper giúp nâng cao độ chính xác của kết quả xét nghiệm và rút ngắn thời gian định
danh từ 8-24 giờ xuống còn hơn vài chục giây (9, 10).
Phương pháp MaldiTof thực hiện bằng cách so sánh khối phổ thu được với các
phổ tham chiếu có sẵn trong thư viện dữ liệu, máy sẽ cho kết quả định danh chính xác
lồi vi sinh vật. kỹ thuật định danh này giúp nâng cao độ chính xác của kết quả xét
nghiệm và rút ngắn thời gian định danh. tuy nhiên hạn chế số lượng vi sinh vật và chỉ
áp dụng được ở các phòng xét nghiệm hiện đại (9, 10).


11

Hình 1.7: Máy định danh vi khuẩn MALDI-TOF MS

H
P


1.2 Kháng sinh đồ
1.2.1 Khái niệm

Là phương pháp nhằm xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh.
Nhạy cảm - S (Susceptibility): Một vi khuẩn được coi là nhạy cảm với một kháng
sinh nào đó có nghĩa là khi nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra sẽ đáp ứng với điều trị

U

bằng kháng sinh thử nghiệm với liều lượng được khuyến cáo (2).

Nhạy cảm phụ thuộc liều - SDD (Susceptible-dose dependent): Độ nhạy cảm của
chủng vi khuẩn phụ thuộc vào chế độ liều được sử dụng cho bệnh nhân. Để đạt được

H

nồng độ thuốc có hiệu quả trên lâm sàng ở các chủng có kết quả thử nghiệm là SDD,
cần phải sử dụng một chế độ liều sao cho vi khuẩn tại ổ nhiễm trùng sẽ phải tiếp xúc
với kháng sinh có nồng độ cao hơn liều kháng sinh được sử dụng để xây dựng nên giá
trị điểm gãy nhạy cảm. Thường thì nên sử dụng chế độ liều cao nhất được chấp nhận
vì nồng độ kháng sinh càng cao thì khả năng tiêu diệt các chủng SDD càng lớn (2).
Trung gian - I (Intermediate): Khái niệm trung gian có thể được hiểu ở hai tình
huống sau (2).
− Khi áp dụng cho một chủng vi khuẩn coi là nhạy cảm trung bình với một kháng
sinh nào đó có nghĩa là kháng sinh này có thể sử dụng cho điều trị nhưng với
liều lượng cao hơn để kháng sinh có thể tập trung nhiều hơn đến ổ nhiễm trùng
hoặc do độc tính thấp của kháng sinh nên tương đối an toàn khi sử dụng liều
cao.



12

− Khi áp dụng cho chủng vi khuẩn có độ nhạy cảm trung bình với một kháng sinh
có độc tính cao có nghĩa là khơng thể sử dụng kháng sinh này ở liều cao hơn
cho điều trị. Trong trượng hợp này, phân loại trung gian được hiểu là ranh giới
của nhạy cảm và đề kháng.
Đề kháng - R (Resistant): Vi khuẩn không đáp ứng với kháng sinh này khi điều
trị cho dù liều lượng như thế nào hay vị trí ổ nhiễm trùng ở đâu (2).
Không nhạy cảm - NS (Nonsusceptible): Phân loại này được sử dụng cho các
loài vi khuẩn chỉ có duy nhất phân loại nhạy cảm được thiết lặp vì khơng thấy có hoặc
rất hiếm các chủng vi khuẩn đề kháng. Với các chủng vi khuẩn có giá trị MIC cao hơn
điểm gãy nhạy cảm sẽ được phân loại là NS. Một chủng vi khuẩn khi được phân loại

H
P

là NS không hẳn là chúng sở hữu một cơ chế đề kháng thuốc mà có thể là vẫn thuộc về
quần thể vi khuẩn hoang dại khơng có cơ chế nào đề kháng thuốc nhưng tại thời điểm
thiết lặp điểm gãy nhạy cảm khơng có các chủng như vậy trong quần thể chủng nghiên
cứu. Trong thực hành lâm sàng, khi có chủng NS, cần kiểm tra lại tính chính xác của
kếtquả định danh vi khuẩn và kết quả kháng sinh đồ (2).

U

1.2.2 Các phương pháp thực hiện kháng sinh đồ
1.2.2.1 Khoanh giấy khuếch tán

Khoanh giấy khuếch tán dựa trên nguyên l: khoanh giấy tẩm kháng sinh được bỏ


H

vào đĩa thạch đã láng một loại vi khuẩn. Kháng sinh khuếch tán từ các khoanh giấy,
quá trình xác lặp một gradient có nồng độ thấp dần nếu càng xa khoang giấy tẩm
kháng sinh. Sự tăng trưởng của vi khuẩn sẽ bị ức chế trên diện tích xung quanh các
khoanh giấy tẩm kháng sinh. Đo đường kính trên có thể sử dụng để xác định được xem
các chủng vi khuẩn nhạy cảm hay đề kháng với một thuốc kháng sinh. Kết quả kháng
sinh đồ phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch từ đĩa giấy tẩm kháng sinh là
kết quả định tính cho biết vi khuẩn là kháng (R-Resistan, các chủng vi khuẩn không bị
ức chế bởi bất cứ nồng độ nào của thuốc mà cơ thể có thể chấp nhận được ), nhạy (SSensitivity, vi khuẩn gây nhiễm khuẩn có thể điều trị được với liều thông thường đã
được khuyến cáo ), hay trung gian (I -Intermediate, là kiểu kháng trong đó với những
nồng độ ức chế tối thiểu của một kháng sinh thường đạt được trong máu và tổ chức
cho đáp ứng thấp hơn so với kiểu nhạy cảm ) đối với kháng sinh thử nghiệm. Phương


13

pháp này linh hoạt trong việc chọn lựa kháng sinh đắt và rẻ , dễ sử dụng; tuy nhiên chỉ
cho kết quả định tính và là kết quả từ thí nghiệm, khơng có mối liên quan trực tiếp đến
kháng sinh được sử dụng trên bệnh nhân, khơng thể nói được liều dung và cách dung
kháng sinh lên người bệnh có hiệu quả hay khơng (2).

H
P

Hình 1.8: Kết quả kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán
Kỹ thuật Etest dựa vào nguyên lí kết hợp của cả hai kĩ thuật khoanh giấy khuếch
tán và kháng sinh pha lỗng trong thạch. Qui trình giống với phương pháp thử nghiệm

U


khoanh giấy khuếch tán nhưng kĩ thuật kháng sinh đồ dải giấy khuếch tán E-test sử
dụng 1 bậc thang nồng độ kháng sinh được định trước. Khi một dải E-test được đặt
trên bề mặt đĩa thạch đã được cấy chủng vi khuẩn, sẽ có một sự vận chuyển trực tiếp

H

và hiệu quả các bậc kháng sinh của thanh xuống hỗn hợp thạch. Các bậc nồng độ
kháng sinh theo hàm mũ, liên tục và ổn định được hình thành một cách trực tiếp dưới
thanh. Kỹ thuậy này dễ sử dụng, dải pha loãng rộng nhưng giá thành cao (2).