BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

H
P

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ

Bước đầu xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 ở mẫu khối nến
người bệnh ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật Realtime PCR
tại Trường Đại học Y tế công cộng

U

H

Chủ nhiệm đề tài: TS. Dương Hồng Quân
Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Xét nghiệm
Mã số đề tài (nếu có): CS 21.22-04

Năm 2022


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

H
P

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ

Bước đầu xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 ở mẫu khối nến
người bệnh ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật Realtime PCR
tại Trường Đại học Y tế công cộng

U

H

Chủ nhiệm đề tài: TS. Dương Hồng Quân
Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Xét nghiệm
Cấp quản lý: Trường Đại học Y tế công cộng
Mã số đề tài (nếu có): CS 21.22-04
Thời gian thực hiện: từ tháng 12 năm 2021 đến tháng 08 năm 2022
Tổng kinh phí thực hiện đề tài
50
triệu đồng
Trong đó: kinh phí SNKH
50
triệu đồng
Nguồn khác:
0
triệu đồng

Năm 2022
1


Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp cơ sở
1. Tên đề tài: Bước đầu xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 ở mẫu khối nến người
bệnh ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật Realtime PCR tại Trường Đại học Y tế

công cộng
2. Chủ nhiệm đề tài: Dương Hồng Quân
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Xét nghiệm
4. Cơ quan quản lý đề tài: Trường Đại học Y tế công cộng
5. Thư ký đề tài: Trần Thị Thu Phương
6. Phó chủ nhiệm đề tài hoặc ban chủ nhiệm đề tài (nếu có):
7. Danh sách những người thực hiện chính:

H
P

- TS. Dương Hồng Quân
- TS. Nguyễn Thuận Lợi
- ThS. Đào Thị Nguyệt
- ThS. Đặng Thị Nga
- ThS. Nguyễn Phương Thoa

U

- CN. Ngô Thị Phương Oanh
- CN. Trần Thị Thu Phương

- CN. Nguyễn Thị Cẩm Thu

H

- CN. Phạm Thị Thu Phương

8. Các đề tài nhánh (đề mục) của đề tài: Không
9. Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 12 năm 2021 đến tháng 08 năm 2022


2


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
H.E

: Hematoxyline và Eosin

NCCN

: Mạng lưới ung thư toàn cầu (National Comprehensive Cancer
Network)

P.A.S

: Pediodic acid Schiff

TNM

: Khối u, hạch vùng, di căn (Tumor-Node-Metastasis)

UICC

: Hội chống ung thư Quốc tế (Union International Against Cancer)

UTĐTT

: Ung thư đại trực tràng


WHO

: Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

H
P

U

H

3


MỤC LỤC
PHẦN A: BÁO CÁO TÓM TẮT NGHIÊN CỨU ...................................................10
PHẦN B: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI ............................14
1.KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................ 14
2.ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN ĐỜI SỐNG XÃ HỘI ........................................................... 15
3.ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ
DUYỆT ........................................................................................................................ 15

4.CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT .............................................................................................. 16
PHẦN C: NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
CẤP CƠ SỞ ..............................................................................................................17
1.ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 17

H
P


2.MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU........................................................................................... 18
3.TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 18
3.1. Một số khái niệm, qui định, tiêu chí, phương pháp đánh giá ............................. 18
3.2. Ung thư đại trực tràng ........................................................................................ 18
3.2.1. Đại cương về ung thư đại trực tràng ............................................................... 19
3.2.2. Sự tiến triển của ung thư đại trực tràng ........................................................... 19
3.2.3. Phân loại ung thư đại trực tràng theo TMN .................................................... 20

U

3.2.4. Phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng ung thư đại trực tràng ........................ 20
3.3. Dấu ấu sinh học KIAA1199 ............................................................................... 21
3.3.1. Nghiên cứu ngoài nước ................................................................................... 21

H

3.3.2. Nghiên cứu trong nước.................................................................................... 22
3.4. Kỹ thuật Realtime PCR ...................................................................................... 23
3.4.1. Nguyên tắc kỹ thuật Realtime PCR ................................................................ 23
3.4.2. Kỹ thuật Realtime PCR dùng màu huỳnh quang chèn SYBR green I ............ 24
3.4.3. Ứng dụng của kỹ thuật Realtime PCR ............................................................ 25
3.5. Giới thiệu về địa bàn nghiên cứu ....................................................................... 25
3.6. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................................ 27
4.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 27
4.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 27
4.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bệnh phẩm khối nến .............................................. 27
4.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ mẫu bệnh phẩm khối nến ................................................. 28
4.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 28
4.3. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................................ 28
4



4.4. Phương pháp chọn mẫu ...................................................................................... 28
4.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 28
4.5.1. Phương pháp thiết kế mồi ............................................................................... 28
4.5.2. Phương pháp nhuộm H.E ................................................................................ 29
4.5.3. Phương pháp nhuộm P.A.S ............................................................................. 30
4.5.4. Phương pháp thu nhận mẫu khối nến .............................................................. 31
4.5.5. Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu khối nến .............................................. 31
4.5.6. Phương pháp đo nồng độ RNA tách chiết từ mẫu khối nến ........................... 33
4.5.7. Phương pháp tổng hợp cDNA ......................................................................... 34
4.5.8. Phương pháp Realtime PCR xác định sự biểu biện dấu ấn KIAA1199.......... 34
4.6. Phương pháp phân tích số liệu ........................................................................... 35
4.7. Trang thiết bị và hóa chất sinh phẩm nghiên cứu .............................................. 36
4.7.1. Trang thiết bị ................................................................................................... 36
4.7.2. Hóa chất sinh phẩm nghiên cứu ...................................................................... 36
4.8. Vấn đề đạo đức của nghiên cứu ......................................................................... 36
5.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................................ 36
5.1. Xác định cặp mồi đặc hiệu khuếch đại KIAA1199 và GAPDH ........................ 36

H
P

5.2. Đặc điểm người bệnh ung thư đại trực tràng ..................................................... 38

U

5.3. Xác định nồng độ và độ tinh sạch RNA tách từ người bệnh ung thư đại trực
tràng ........................................................................................................................... 40
5.4. Xác định tỷ lệ biểu hiện dấu ấn KIAA1199 ở mẫu khối nến của người bệnh ung


H

thư đại trực tràng bằng phản ứng Realtime PCR ...................................................... 42
6. BÀN LUẬN .............................................................................................................. 43
7.KẾT LUẬN ............................................................................................................... 46
8.KHUYẾN NGHỊ ......................................................................................................... 46
9.TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 46
10. PHỤ LỤC (NẾU CĨ) .........................................................................................50
PHẦN D: GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA: PHẦN NÀY ÁP DỤNG SAU KHI ĐỀ TÀI
ĐÃ ĐƯỢC THÔNG QUA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU KẾT QUẢ ......................73

5


DANH MỤC BẢNG
BẢNG 5.1. ĐẶC TÍNH VÀ THƠNG SỐ CỦA CẶP MỒI KIAA1199 VÀ GAPDH
...................................................................................................................................37
BẢNG 5.2. NGUỒN GỐC VÀ ĐỘ TƯƠNG ĐỒNG CỦA CẶP MỒI KIAA1199 VÀ
GAPDH .....................................................................................................................38
BẢNG 5.3. GIÁ TRỊ CT CỦA GEN KIAA1199 VÀ GAPDH ...............................38
BẢNG 5.4. ĐẶC ĐIỂM NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG (N=25)
...................................................................................................................................39
BẢNG 5.5. NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ TINH SẠCH RNA TÁCH TỪ VÙNG MÔ U VÀ

H
P

MÔ LÀNH CỦA NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .......................42


U

H

6


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ 5.1. TỶ LỆ BIỂU HIỆN DẤU ẤN KIAA1199 TẠI VÙNG MÔ U VÀ MÔ
LÀNH Ở MẪU KHỐI NẾN CỦA NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG.
...................................................................................................................................43

H
P

U

H

7


DANH MỤC HÌNH
HÌNH 3.1. TĨM LƯỢC CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG KHI SỬ DỤNG CHẤT HUỲNH
QUANG SYBR GREEN I TRONG REALTIME PCR............................................24
HÌNH 4.1: VÙNG MƠ U VÀ VÙNG MƠ LÀNH TRÊN MẪU MÔ ĐÚC NẾN CỦA
NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG. VÙNG MƠ U: KHU VỰC/VÙNG
ĐÁNH DẤU TRỊN; VÙNG MƠ LÀNH: KHU VỰC/VÙNG ĐÁNH DẤU
VNG. ...................................................................................................................31
HÌNH 5.1. KẾT QUẢ NHUỘM H.E VÙNG MÔ LÀNH VÀ MÔ U CỦA NGƯỜI

BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ..................................................................40

H
P

HÌNH 5.2. KẾT QUẢ NHUỘM P.A.S ĐÁNH GIÁ SỰ XÂM LẤM CỦA TẾ BÀO
U TẠI VÙNG MÔ U VỚI CÁC VÙNG MÔ LÂN CẬN KẾ BÊN CỦA NGƯỜI
BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ..................................................................41

U

H

8


DANH MỤC SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ 3.1. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ BIỂU HIỆN DẤU ẤN
KIAA1199 Ở MẪU KHỐI NẾN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 27

H
P

U

H

9



PHẦN A: BÁO CÁO TÓM TẮT NGHIÊN CỨU
BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH DẤU ẤN SINH HỌC KIAA1199 Ở MẪU KHỐI
NẾN NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT
REALTIME PCR TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
TS. Dương Hồng Quân1, CN. Trần Thị Thu Phương1, CN. Nguyễn Thị Cẩm Thu1,
ThS. Đào Thị Nguyệt2, CN. Phạm Thị Thu Phương3,
ThS. Nguyễn Phương Thoa1, ThS. Đặng Thị Nga1, TS. Nguyễn Thuận Lợi4
1

Trường Đại học Y tế công cộng; 2Bệnh viện Đa khoa Đức Giang; 3Viện Kiểm định
Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế; 4Bệnh viện Bạch Mai

H
P

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là nguyên nhân chính gây mắc mới và
tử vong trên thế giới. Đánh giá đặc điểm phân tử và xác định dấu ấn sinh học mới giúp
hỗ trợ chẩn đốn, tiên lượng tình trạng bệnh, và nâng cao hiệu quả điều trị UTĐTT.

U

KIAA1199, dấu ấn sinh học mới, có vai trị quan trọng trong quá trình phát triển và di
căn của nhiều loại khối u ác tính. Mục tiêu của nghiên cứu gồm 1) Xây dựng quy trình
kỹ thuật xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 ở người bệnh UTĐTT tại Trường Đại

H

học Y tế công cộng; và 2) Xác định tỷ lệ dấu ấn KIAA1199 ở mẫu bệnh phẩm khối

nến UTĐTT bằng kỹ thuật Realtime PCR.

Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang, mẫu mô đúc
khối nến của 25 người bệnh UTĐTT đã được nhuộm bằng kỹ thuật giải phẫu bệnh
(H.E và P.A.S) để xác định vùng mô u và mô lành, và đánh giá mức độ xâm lấn. Vùng
mô u và mô lành ở mẫu mô đúc khối nến của 25 người bệnh UTĐTT được tách chiết
RNA và xác định tỷ lệ biểu hiện dấu ấn KIAA1199 bằng Realtime PCR.
Kết quả: Xây dựng ba quy trình kỹ thuật gồm 1) Thiết kế mồi KIAA1199 cho phản
ứng Realtime PCR; 2) Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm khối nến của người bệnh
UTĐTT; và 3) Xác định dấu ấn KIAA1199 ở mẫu khối nến của người bệnh UTĐTT
bằng Realtime PCR. Hơn thế nữa, RNA tách chiết từ vùng mô u và mô lành ở 17/25
10


mẫu mơ đúc khối nến có đủ điều kiện về chất lượng và độ tinh sạch bằng NucleoSpin
Total RNA FFPE và xác định được mức độ biểu hiện mạnh của dấu ấn KIAA1199
tại vùng mô u so với vùng mô lành ở 14/17 mẫu mô đúc khối nến của người bệnh
UTĐTT bằng phản ứng Realtime PCR.
Kết luận: Nghiên cứu đã thiết lập ba quy trình kỹ thuật gồm 1) Thiết kế mồi
KIAA1199 cho phản ứng Realtime PCR; 2) Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm khối
nến của người bệnh UTĐTT; và 3) Xác định dấu ấn KIAA1199 ở mẫu khối nến của
người bệnh UTĐTT bằng Realtime PCR và đánh giá mức độ biểu hiện dấu ấn
KIAA1199 tại vùng mô u so với vùng mô lành ở 14/17 mẫu mô đúc khối nến của
người bệnh UTĐTT bằng phản ứng Realtime PCR.

H
P

Từ khóa: KIAA1199; Ung thư đại trực tràng; Vùng mô u; Vùng mô lành; Realtime
PCR


U

H

11


APPLICATION OF REALTIME PCR TO IDENTIFY OF KIAA1199 LEVEL
IN FORMALIN-FIXED, PARAFFIN-EMBEDDED (FFPE) COLORECTAL
CANCER PATIENTS IN HANOI UNIVERSITY OF PUBLIC HEALTH
Ph.D. Duong Hong Quan1, B.Sc. Tran Thi Thu Phuong1, B.Sc. Nguyen Thi Cam
Thu1, M.Sc. Dao Thi Nguyet2, B.Sc. Pham Thi Thu Phuong3,
M.Sc. Nguyen Phuong Thoa1, M.Sc. Dang Thi Nga1, Ph.D. Nguyen Thuan Loi4
1
3

Hanoi University of Public Health; 2Duc Giang General Hospital;

National Institute for Control of Vaccine and Biologicals; 4Bach Mai Hospital

ABSTRACT

H
P

Background: Colorectal cancer (CRC) is a major cause of morbidity and mortality
worldwide. Investigation of molecular characteristics and identification of new
biomarkers for early diagnosis and prognosis of CRC are very important for
contributing to enhance the effective treatment for CRC patients. KIAA1199, a new

biomarker, is associated with tumor progression and metastasis in numerous

U

malignancies. The aims of this study are 1) To establish a standard of protocol (SOP)
to identify KIAA1199 biomarker in CRC patient’s sample at the Hanoi University of
Public Health; and 2) To determine of KIAA1199 level in CRC patient’s FFPE

H

samples by Realtime PCR.

Materials and methods: Cross-sectional description study, tumor specimens from
25 CRC patients were stained with H.E and P.A.S to identify of a tumor and normal
tissue, and evaluate of tumor invasion. A tumor and normal tissue in 25 CRC patient’s
FFPE samples were extracted RNA and determined the KIAA1199 level by Realtime
PCR.
Results: Establish three SOP inclusive 1) Design KIAA1199 primers for Realtime
PCR; 2) RNA extraction of CRC patient’s FFPE samples; and 3) Determination of
KIAA1199 biomarker of CRC patient’s FFPE samples by Realtime PCR. Moreover,
RNAs extracted from tumor and normal tissues (17/25 CRC patient’s FFPE samples)
that are qualified for quality and purity by NucleoSpin Total RNA FFPE. Especially,
12


high expression level of KIAA1199 in tumor tissue of CRC patient’s FFPE samples
comparing to normal tissue in 14/17 CRC patient’s FFPE samples.
Conclusion: This study is established three SOP inclusive 1) Design KIAA1199
primers for Realtime PCR; 2) RNA extraction of CRC patient’s FFPE samples; and
3) Determination of KIAA1199 biomarker of CRC patient’s FFPE samples by

Realtime PCR and identified high expression level of KIAA1199 in tumor tissue
comparing to normal tissue in 14/17 CRC patient’s FFPE samples.

H
P

U

H

13


PHẦN B: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1. Kết quả nổi bật của đề tài
(a) Đóng góp mới của đề tài.
Số người mắc mới và tử vong do ung thư đại trực tràng (UTĐTT) ngày càng
tăng cao trên thế giới và ở Việt Nam nên nghiên cứu xác định tỷ lệ biểu hiện dấu ấn
KIAA1199 ở mẫu bệnh phẩm khối nến của người bệnh UTĐTT bằng kỹ thuật
Realtime PCR có thể sẽ cung cấp thơng tin hữu ích nhằm hỗ trợ chẩn đốn sớm
UTĐTT để từ đó góp phần đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả người bệnh UTĐTT ngay
từ giai đoạn sớm.

H
P

(b) Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể).

Thiết lập ba quy trình kỹ thuật gơm 1) Thiết kế cặp mồi KIAA1199 cho phản
ứng Realtime PCR; 2) Tách chiết RNA tổng số từ mẫu khối nến của người bệnh

UTĐTT; và 3) Xác định tỷ lệ dấu ấn KIAA1199 ở mẫu bệnh phẩm khối nến UTĐTT
bằng Realtime PCR.

U

- RNA tách chiết từ vùng mô u và mô lành ở 17/25 mẫu mô đúc khối nến có đủ
điều kiện về chất lượng và độ tinh sạch và xác định mức độ biểu hiện mạnh của dấu

H

ấn KIAA1199 tại vùng mô u so với vùng mô lành ở 14/17 mẫu mô đúc khối nến của
người bệnh UTĐTT bằng phản ứng Realtime PCR.
(c)

Hiệu quả về đào tạo.

- Đào tạo kỹ thuật mới cho cán bộ của phòng xét nghiệm: Kỹ thuật thiết kề mồi
cho phản ứng Realtime PCR, kỹ thuật tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm khối nến,
kỹ thuật xác định tỷ lệ biểu hiện của các dấu ấn phân tử ứng dụng trong chẩn đoán và
tiên lượng bệnh bằng Realtime PCR.
- Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng cho các bài giảng môn môn Y sinh
học phân tử, Miễn dịch-Sinh học phân tử, Miễn dịch-Sinh học phân tử nâng cao, Xét
nghiệm mô bệnh học nâng cao.

14


- Kết quả nghiên cứu có thể được trình bày tại các hội nghị khoa học trong và
ngoài nước về lĩnh vực nghiên cứu y học, ung thư học, cơ chế bệnh học phân tử và
công nghệ sinh học.

(d) Hiệu quả về xã hội.
- Nghiên cứu bước đầu đưa ra được quy trình xác định tỷ lệ biểu hiện KIAA1199
ở mẫu bệnh phẩm khối nến của người bệnh UTĐTT từ đó có thể hỗ trợ chẩn đốn
UTĐTT ngay từ giai đoạn sớm.
(e) Các hiệu quả khác.
- Đưa ra cách nhìn nhận và hướng nghiên cứu mới về vai trò quan trọng của dấu

H
P

ấn phân tử ứng dụng trong chẩn đoán bệnh ung thư ngay từ giai đoạn sớm ở Việt Nam
trong đó có UTĐTT.

2. Áp dụng vào thực tiễn đời sống xã hội

Nghiên cứu là bước đầu tạo tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng vai trò của dấu ấn
KIAA1199 ứng dụng trong chẩn đoán bệnh UTĐTT ở giai đoạn sớm trong thời gian

U

tới.

3. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được
phê duyệt
(a) Tiến độ.

H

- Đúng tiến độ.


(b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu.
- Đã hoàn thành đủ 2 mục tiêu nghiên cứu.
(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương.
- Đã hoàn thành các sản phẩm dự kiến.
(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí.
- Kinh phí được sử dụng đúng, hợp lý và không vượt dự toán.
15


4. Các ý kiến đề xuất
Tiếp tục nghiên cứu xác định tỷ lệ biểu hiện dấu ấn KIAA1199 ở mẫu bệnh
phẩm UTĐTT tại các giai đoạn tiến triển bệnh khác nhau (Giai đoạn I, II, III và IV)
và xác định mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của dấu ấn KIAA1199 với các mức
giai đoạn tiến triển lâm sàng của bệnh UTĐTT.

H
P

U

H

16


PHẦN C: NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ
1. Đặt vấn đề
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là nguyên nhân chính gây mắc mới và tử vong
trên thế giới. UTĐTT là loại ung thư phổ biến đứng hàng thứ 3 và là nguyên nhân gây

tử vong đứng hàng thứ 4 với ước tính khoảng 1,800,000 trường hợp mắc mới và hơn
881,000 ca tử vong xảy ra trong năm 2018 (4). Tỉ lệ mắc mới và tử vong do UTĐTT ở
nam giới cao hơn nữ giới ở hầu hết các khu vực trên thế giới (4). Tỉ lệ mắc UTĐTT
cao nhất thuộc về Châu Âu, Úc, New Zealand và một số quốc gia thuộc khu vực Đông
Á như Nhật Bản, Hàn Quốc (4). Theo cơng bố của tổ chức ung thư tồn cầu

H
P

(GLOBOCAN) về tình hình ung thư tại Việt Nam trong năm 2020, UTĐTT là nguyên
nhân đứng thứ tư gây tử vong trong số các loại ung thư với hơn 16,426 trường hợp
mắc mới và hơn 8,203 ca tử vong (37). Những khác biệt về vị trí địa lý dẫn đến những
khác biệt về chế độ ăn uống và điều kiện môi trường sống, cùng với nền tảng di truyền
đã quyết định nguyên nhân gây và hiệu quả trong điều trị UTĐTT. Hơn thế nữa,

U

khoảng 75% bệnh nhận UTĐTT là ung thư mắc phải và khơng có tiền sử gia đình khuynh hướng di truyền, và 25% bệnh nhân UTĐTT còn lại liên quan tới yếu tố lịch
sử gia đình. Chính vì vậy, UTĐTT hiện đang là mối quan tâm của toàn xã hội từ đó

H

tập trung nghiên cứu và đưa ra chiến lược chẩn đoán sớm và phác đồ điều trị mới
hiệu quả trong điều trị UTĐTT.

Chẩn đoán sớm, tiên lượng bệnh chính xác và đưa ra phác đồ điều trị phù hợp
sẽ quyết định sự thành công trong điều trị UTĐTT. Tuy nhiên, một số lớn người bệnh
UTĐTT đặc biệt là UTĐTT giai đoạn muộn/di căn đã mẫn cảm với liệu pháp hóa trị,
liệu pháp xạ trị và liệu pháp điều trị trúng đích ảnh hưởng đến sự thành cơng trong
điều trị ca bệnh. Do đó, cùng với nghiên cứu đánh giá cơ chế phân tử kháng thuốc và

nghiên cứu phát hiện các thuốc điều trị trúng đích mới, nghiên cứu phát hiện các dấu
ấn sinh học mới giúp chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh có ý nghĩa lâm sàng để từ đó
góp phần nâng cao hiệu quả điều trị người bệnh UTĐTT. Chính vì vậy, chẩn đốn
sớm và tiên lượng UTĐTT bằng các dấu ấn sinh học mới như KIAA1199 ở mẫu bệnh
17


phẩm khối nến của người bệnh UTĐTT sẽ góp phần chẩn đoán bệnh UTĐTT ngay
từ giai đoạn sớm ở Việt Nam trong thời gian tới. Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn
nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Bước đầu xác định dấu ấn sinh học
KIAA1199 ở mẫu khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật
Realtime PCR tại Trường Đại học Y tế công cộng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu 1. Xây dựng quy trình kỹ thuật xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 ở người
bệnh ung thư đại trực tràng tại Trường Đại học Y tế công cộng.
Mục tiêu 2. Xác định tỷ lệ dấu ấn KIAA1199 ở mẫu bệnh phẩm khối nến ung thư đại

H
P

trực tràng bằng kỹ thuật Realtime PCR.
3. Tổng quan tài liệu

3.1. Một số khái niệm, qui định, tiêu chí, phương pháp đánh giá
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT): Loại ung thư có nguồn gốc từ đại tràng hoặc
trực tràng. Đặc biệt, UTĐTT là nguyên nhân chính gây mắc mới và tử vong trên thế
giới.

U


Mô u: Mô mới, bất thường cả về số lượng và chất lượng tế bào dẫn tới sinh sản
quá mức không theo sự kiểm sốt của cơ thể.

H

Mơ lành: Mơ được sinh ra và giống bố mẹ ln bình thường cả về số lượng và
chất lượng tế bào nên quá trình sinh trưởng và biệt hóa ln tn theo sự kiểm sốt
của cơ thể.

KIAA1199: Dấu ấn sinh học chỉ ra sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào ung thư
và sự xâm lấn và di căn của khối u.
Realtime PCR: Kỹ thuật nhân bản DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt, tín hiệu khuếch
đại sẽ được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt, Mồi trong phản ứng Realtime-PCR thường
có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55 - 60oC để đảm bảo sự thành cơng của phản ứng.
Qua 3 bước (biến tính, bắt cặp, kéo dài), một DNA đích sẽ được nhân lên thành hai
bản sao và chu kỳ được lặp đi lặp lại liên tục tới 45 chu kỳ. Lúc này, từ một DNA
đích sẽ nhân lên thành 245 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao.
3.2. Ung thư đại trực tràng
18


3.2.1. Đại cương về ung thư đại trực tràng
UTĐTT là loại ung thư phổ biến đứng hàng thứ 3 và là nguyên nhân gây tử
vong đứng hàng thứ 4 với ước tính khoảng 1,800,000 trường hợp mắc mới và hơn
881,000 ca tử vong xảy ra trong năm 2018 (4). Tỉ lệ mắc mới và tử vong do UTĐTT
ở nam giới cao hơn nữ giới ở hầu hết các khu vực trên thế giới (4). Tỉ lệ mắc UTĐTT
cao nhất thuộc về Châu Âu, Úc, New Zealand và một số quốc gia thuộc khu vực Đông
Á như Nhật Bản, Hàn Quốc (4).
Theo cơng bố của tổ chức ung thư tồn cầu (GLOBOCAN) về tình hình ung thư
tại Việt Nam trong năm 2020, UTĐTT là nguyên nhân đứng thứ tư gây tử vong trong

số các loại ung thư với hơn 16.426 trường hợp mắc mới và hơn 8.203 ca tử vong (37).

H
P

Theo thống kê của Bệnh Viện Ung bướu Hà Nội, tỉ lệ mắc UTĐTT vào khoảng 9%
tổng số người mắc bệnh ung thư. Dự báo trong vài năm tới, số người mắc UTĐTT sẽ
tăng nhanh do thói quen ăn uống ít chất xơ, giàu thịt và thức ăn chế biến sẵn ngày
một phổ biến.

3.2.2. Sự tiến triển của ung thư đại trực tràng

U

3.2.2.1. Sự phát triển trong thành đại tràng

UTĐTT xuất phát từ lớp niêm mạc đại tràng, phát triển tại chỗ vào các lớp

H

khác nhau của đại tràng, đặc biệt là phát triển vào trong lòng đại tràng gây biến chứng
tắc ruột, các hướng phát triển của UTĐTT bao gồm 1) Theo chiều ngược hướng tâm
tức là đi dần từ lớp niêm mạc qua lớp dưới niêm mạc rồi đến lớp cơ, tiếp tục lớp thanh
mạc, sau đó tế bào ung thư phá hủy lớp thanh mạc để xâm lấn vào lớp mỡ cạnh đại
tràng hay các mô, các tạng lân cận; 2) Theo chiều dọc tức là lên trên sau đó xuống
dưới, hiện tượng phát triển này chủ yếu xảy ra ở lớp dưới niêm mạc, nhưng ít khi
vượt quá 2 cm cách rìa khối u và 3) Theo hình vịng cung tức là dần dần ơm hết chu
vi lịng đại tràng (21).
3.2.2.2. Sự phát triển ngồi thành đại tràng
Nếu khơng được chẩn đốn và điều trị kịp thời, UTĐTT sẽ tiếp tục phát triển ra

ngoài thành của đại tràng, vùng xung quanh khối u, xâm nhập vào đường máu, hệ
thống bạch huyết và di căn xa tới các cơ quan nội tạng khác bằng những con đường
19


gồm xâm nhập trực tiếp do tiếp xúc: Sau khi khối u đã thâm nhiễm tới lớp thanh mạc
thành đại tràng, sẽ tiếp tục xâm lấn tới các tạng lân cận. Do đó, khi UTĐTT dính vào
các tạng khác cịn cắt bỏ được thì nên cố gắng cắt bỏ tối đa (32,34).
3.2.3. Phân loại ung thư đại trực tràng theo TMN
Theo NCCN và UICC, UTĐTT được phân loại theo TMN gồm T: u nguyên
phát; Tx: chưa đánh giá được khối u nguyên phát; To: chưa có u nguyên phát; Tis:
ung thư tại chỗ; T1: u xâm lấn lớp dưới niêm; T2: u xâm lấn lớp cơ; T3: u xâm lấn
đến thanh mạc; T4: u xâm lấn đến cơ quan lân cận (T4a: Xuyên thủng phúc mạc tạng
và T4b: Xâm lấn trực tiếp cơ quan hoặc cấu trúc khác). N: hạch vùng gồm Nx: chưa
đánh giá được hạch vùng; No: chưa có di căn hạch vùng; N1: di căn 1-3 hạch vùng

H
P

(N1a: 1 hạch, N1b: 2-3 hạch N1c: hạch vệ tinh dưới thanh mạc, hạch mạc treo, khơng
có hạch vùng); N2: di căn ≥ 4 hạch (N2a: 4-6 hạch, N2b: từ 7 hạch trở lên). M: di căn
xa; Mo: chưa có di căn xa; M1: có di căn xa, bao gồm (M1a: di căn đến 1 cơ quan
hoặc 1 vị trí khác, M1b: di căn trên 1 cơ quan khơng có di căn phúc mạc và M1c: di
căn phúc mạc.

U

3.2.4. Phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng ung thư đại trực tràng
3.2.4.1. Kỹ thuật chụp X-Quang


Chụp khung đại tràng có Barit: Phương tiện chẩn đốn quan trọng đã có từ lâu,

H

giúp cho việc chẩn đốn xác định vị trí tổn thương trên khung đại tràng; Chụp CT
Scanner: Các người bệnh khi được chẩn đoán UTĐTT, phải được đánh giá trước mổ
bằng chụp cắt lớp vi tính bụng và tiểu khung. Đây là phương pháp hiện đại, cho phép có
thể xác định khối u, mức xâm lấn của u, tình trạng di căn hạch vùng, di căn xa, các tạng
ở trong ổ bụng (23); Chụp cộng hưởng từ (MRI): Phương pháp cho kết quả chính xác
song giá thành cao hơn một số kỹ thuật chụp khác; Chụp nhấp nháy miễn dịch phóng
xạ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu đang được nghiên cứu để chẩn đoán UTĐTT di
căn và tái phát bước đầu đã cho kết quả tốt; Nội soi đại tràng bằng ống soi mềm: Cho
phép quan sát trực tiếp từ hậu môn tới manh tràng và nội soi kết hợp được với sinh
thiết đã xác định chính xác bản chất của bệnh.
3.2.4.2. Kỹ thuật xét nghiệm
20


Kháng nguyên sinh ung thư bào thai: CEA (Carcino Embryonic Antigen) là một
glycoprotein có p = 200KDa. Được tìm thấy trong màng tế bào của nhiều mơ, nó
khơng đặc hiệu trong ung thư đại tràng. CEA tăng cao bất thường trong ung thư đại
tràng và các nơi khác thuộc ống tiêu hoá. Một số ung thư thuộc ống tiêu hoá mức
CEA cũng tăng cao, CEA được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch phóng xạ của
huyết thanh.
CA 19-9 (Carbohydrat Antigen) là một kháng nguyên được nhận biết bởi kháng
thể đơn dịng. Bình thường nồng độ CA 19 - 9 < 37u/ml. Nồng độ CA 19-9 tăng cao
ở người bệnh có u ác tính. Hiện nay người ta cho rằng CA 19-9 là một dấu hiệu sinh
học khối u ưu tiên hàng đầu cho ung thư tuỵ và đường mật, ung thư đại tràng và ung

H

P

thư dạ dày (31,35).
3.2.4.3. Kỹ thuật sinh thiết

Hiện nay có rất nhiều phương pháp sinh thiết nói chung nhưng đối với UTĐTT
nói riêng chúng ta có thể áp dụng một trong hai phương pháp gồm phương pháp 1:
Sinh thiết qua nội soi có giá trị chẩn đốn chắc chắn UTĐTT, loại ung thư nhưng

U

khơng có giá trị nhiều trong chẩn đoán giai đoạn và phương pháp 2: Sinh thiết tức thì
trong khi phẫu thuật: có thể chẩn đoán được giai đoạn của ung thư và xem 2 đầu cắt
cịn tế bào ung thư hay khơng (27,33).

H

3.3. Dấu ấu sinh học KIAA1199
3.3.1. Nghiên cứu ngoài nước

Về cơ chế phân tử, khoảng 85% người bệnh UTĐTT có tăng biểu hiện của
EGFR trên bề mặt các tế bào ung thư. Đặc biệt có khoảng 40-45% người bệnh
UTĐTT mang đột biến gene KRAS. Chính vì vậy, các nghiên cứu đã chứng minh
được vai trò của các kháng thể đơn dòng ức chế EGFR như cetuximab, panitumumab
có tác dụng kéo dài thời gian sống (overall survival) và thời gian sống không bệnh
(disease free survival) chỉ ở những có bệnh nhân đột biến gene KRAS, NRAS âm
tính. Do vậy, NCCN đã khuyến cáo xét nghiệm phát hiện đột biến gen KRAS, NRAS
ở những người bệnh UTĐTT tiến triển để cân nhắc sử dụng kháng thể đơn dòng
kháng EGFR ở những người bệnh này (18). Trong UTĐTT, mặc dù có cùng giai đoạn
bệnh, nhưng có sự khác biệt đáng kể về lâm sàng liên quan đến sự không đồng nhất

21


về phân tử ở khối u. Phần lớn UTĐTT phát triển thông qua con đường mất ổn định
về nhiễm sắc thể (Chromosome Instability: CIN) và con đường mất ổn định vi vệ tinh
(Micro Satellite Instability: MSI). Trong các nghiên cứu dựa trên dân số, tỷ lệ mất ổn
định vi vệ tinh mức độ cao (Microsatellite Instability-High: MSI-H) trong UTĐTT là
15% (17). Việc xác định MSI có ý nghĩa rất quan trọng trong việc điều trị bệnh. Các
nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy các tế bào UTĐTT có MSI-H nhạy cảm với thuốc
điều trị miễn dịch hơn so với các tế bào có ổn định vi vệ tinh (Microsatellite Stable:
MSS) (14,22).
Cho đến nay, dấu ấn sinh học CEA và CA19-9 được sử dụng chủ yếu trong sàng
lọc UTĐTT. Trong đó, giá trị CEA có vai trị quan trọng trong tiên lượng người bệnh

H
P

UTĐTT trước mổ và tái phát sau mổ phẫu thuật; và giá trị CA19-9 là dấu ấn sinh học
khối u ưu tiên hàng đầu trong sàng lọc ung thư tụy và đường mật, UTĐTT và ung thư
dạ dày. Tuy nhiên, một số bệnh lý khác không phải UTĐTT cũng biểu hiện các dấn
ấn sinh học này. Chính vì vậy, tìm kiếm phát hiện dấu ấn sinh học mới có ý nghĩa
lâm sàng là ưu tiên hàng đầu trong chẩn đoán và tiên lượng UTĐTT.

U

KIAA1199 là dấu ấn sinh học mới chỉ ra sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào
ung thư và sự xâm lấn và di căn của khối u (2). Sự tăng biểu hiện KIAA1199 có ý
nghĩa lâm sàng trong chẩn đốn sớm và tiên lượng nhiều loại ung thư, đặc biệt liên

H


quan tới xác định 4 giai đoạn bệnh ung thư và quyết định tỷ lệ sống của người bệnh
ung thư trên 5 năm. Cho đến nay, sự tăng biểu hiện KIAA1199 đã được nghiên cứu
và xác định ở khối u dạ dày (13), khối u vú (6), khối u trực tràng (20), khối u gan (7),
khối u tuyến tiền liệt (14) và khối u biểu mô tế bào vảy ở miệng (5) để từ đó khẳng
định vai trị lâm sàng quan trọng của KIAA1199 trong chẩn đoán sớm, tiên lượng và
hỗ trợ điều trị ung thư. Hơn thế nữa, KIAA1199 còn được biết đến như là dấu ấn sinh
học để kiểm soát tiến trình phản triển của khối u và quá trình xâm lấn và di căn ở một
số loại ung thư trong đó có ung thư dạ dày, ung thư tuyến giáp thể nhú và ung thư
phổi không tế bào nhỏ (8,16,19). Cho đến nay, kỹ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch và
Realtime PCR đang được ứng dụng trong chẩn đoán phát hiện, đánh giá sự biểu hiện
của KIAA1199 ở đa số bệnh ung thư.
3.3.2. Nghiên cứu trong nước
22


Theo thống kê của Bệnh viện Ung bướu Hà Nội, tỉ lệ mắc UTĐTT vào khoảng
9% tổng số người bệnh ung thư. Dự báo trong vài năm tới, số người mắc UTĐTT sẽ
tăng nhanh do thói quen ăn uống ít chất xơ, giàu thịt và thức ăn chế biến sẵn ngày
một phổ biến. Mặc dù vậy, các nghiên cứu về UTĐTT ở trong nước còn rất hạn chế.
Phần lớn các nghiên cứu tập trung vào đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh
học hay phát triển các phương pháp điều trị lâm sàng (24,30). Hơn thế nữa, trong thời
gian gần đây đã có một số nghiên cứu về ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện
đại như microarray để nghiên cứu đánh giá sự thay đổi biểu hiện gen trong UTĐTT
(25), hay sàng lọc các đột biến gen APC (28). Hiện nay, xét nghiệm đột biến gen
KRAS, NRAS là những xét nghiệm thường được thực hiện trong các phòng xét

H
P


nghiệm sinh học phân tử tại nhiều bệnh viện trong cả nước. Một số cơng trình nghiên
cứu gần dây đã đưa ra các kết quả về đột biến hai gen này. Nghiên cứu của Lê Văn
Thiệu đột biến KRAS trên 79 người bệnh UTĐTT được phẫu thuật tại Bệnh viện Việt
Tiệp Hải Phòng (26) và Nguyễn Kiến Dụ và cộng sự nghiên cứu 145 người bệnh
UTĐTT xét nghiệm gen KRAS bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp tỷ lệ đột biến

U

gen KRAS là 33,7% (29). Mặc dù vậy, nghiên cứu đánh giá đặc điểm sinh học phân
tử UTĐTT sâu rộng như xác định các dấu ấn sinh học mới như KIAA1199 từ đó ứng
dụng trong chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh UTĐTT hầu như chưa được đề cập đến
tại Việt Nam.

H

3.4. Kỹ thuật Realtime PCR

3.4.1. Nguyên tắc kỹ thuật Realtime PCR
Kỹ thuật Realtime PCR dựa trên nền tảng của kỹ thuật PCR nhưng kết quả
khuếch đại DNA đích hiển thi được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng (36).
Chất huỳnh quang được thêm vào hỗn hợp của phản ứng PCR (Mix PCR), chất huỳnh
quang này sẽ được chèn vào sợi đôi của DNA hoặc bắt cặp bổ sung với một trình tự
đặc hiệu trên DNA đích, nếu trong ống phản ứng này có sự hiện diện sản phẩm khuếch
đại của PCR từ DNA đích được nhân bản đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phát
huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích và sẽ khơng thể phát được huỳnh
quang nếu khơng có sản phẩm khuếch đại trong ống. Nếu trong ống phản ứng số
lượng DNA đích nhiều thì sẽ cần ít chu kỳ nhiệt hơn để đạt đến số lượng bản sao đủ
23



để ống phản ứng cho được tín hiệu huỳnh quang mà máy sẽ ghi nhận được, còn nếu
số lượng DNA đích ít hơn thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn. Tính tốn số copy của DNA
đích ban đầu có trong ống phản ứng phải dựa vào đường biểu diễn chuẩn (được tạo
nên bởi các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ), xác định mối quan hệ giữa chu kỳ
ngưỡng với số lượng copy DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng (1,36).
3.4.2. Kỹ thuật Realtime PCR dùng màu huỳnh quang chèn SYBR green I
3.4.2.1. Nguyên lý
SYBR green I thường được sử dụng vì màu huỳnh quang nền rất thấp, khả năng
chèn vào sợi đôi DNA cao nhưng không làm cho sợi đôi DNA gắn chặt vào nhau khi
bị biến tính. Cơ chế hoạt động khi sử dụng chất huỳnh quang SYBR green I trong kỹ

H
P

thuật Realtime PCR được thể hiện tại Hình 3.1.

U

Hình 3.1. Tóm lược cơ chế hoạt động khi sử dụng chất huỳnh quang SYBR
3.4.2.2. Ưu điểm

H

green I trong Realtime PCR

Màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA có ái lực rất cao khi có sự mặt của sợi
đôi DNA và ái lực này là do khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA làm cho
sợi đôi DNA này phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích
thích.


24