BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

NGUYỄN ĐỨC TRƢỞNG

H
P

XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG QUY TRÌNH LAMP
PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN
Clostridium botulinum TYPE A, B

U

H

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC
MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601

HÀ NỘI, 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

NGUYỄN ĐỨC TRƢỞNG

H
P

XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG QUY TRÌNH LAMP

PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN
Clostridium botulinum TYPE A, B

U

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC
MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601

H

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. ĐẶNG THỊ THÙY DƢƠNG
2. TS. DƢƠNG HỒNG QUÂN

HÀ NỘI, 2022


i

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành đề tài này, tôi đã được TS. Đặng Thị Thùy Dương và
TS. Dương Hồng Quân nhiệt tình hướng dẫn, chỉnh sửa và giúp đỡ trong suốt thời
gian qua. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến hai quý thầy cô hướng dẫn của
mình.
Tơi xin trân trọng cảm ơn TS. Lê Huy Hoàng và ThS. Tăng Thị Nga, Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và TS. Phạm Bảo Yên cùng toàn thể thành viên nhóm
nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sản xuất quy trình LAMP phát hiện nhanh gen độc
tố của Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt” mã số 02/2021/ĐX đã cho
phép tôi tham gia đề tài, sử dụng một phần số liệu và tạo điều kiện thuận lợi để tôi


H
P

thực hiện và hồn thành luận văn này.

Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, quý Thầy Cô Trung tâm Xét
nghiệm, quý Thầy Cô Trường Đại học Y tế công cộng ln tận tình hướng dẫn giúp
đỡ, tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, tập thể khoa Vi sinh bệnh viện Đa

U

khoa tỉnh Hải Dương đã giúp đỡ, hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tơi để tơi hồn
thành khóa học. Tơi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình, vợ và con tôi luôn đồng
hành cùng tôi trong thời gian vừa qua.

H

Ngồi ra tơi cũng xin gửi lời cám ơn đến các Thầy Cô trong hội đồng đánh
giá kết quả nghiên cứu đề tài của tôi. Các Thầy Cô đã có rất nhiều đóng góp q
báu, chỉ dẫn giúp tơi hồn thiện đề tài của mình tốt hơn.
Đề tài là bước khởi đầu trong sự nghiệp học tập nghiên cứu khoa học của
mình, vì vậy nh ng lời cảm ơn này chưa đủ để nói hết nh ng tình cảm thật đáng
quý của tất cả mọi người đã bên tôi và giúp đỡ tôi. Tôi s mang theo nh ng tình
cảm này trong suốt hành trang cuộc đời mình.


ii

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .....................................................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4
1.1.

Vi khuẩn Clostridium botulinum.....................................................................4

1.1.1. Đặc điểm hình thể và tính chất sinh vật hóa học Clostridium botulinum .......4
1.1.2. Tính chất ni cấy ............................................................................................4
1.1.3. Phân nhóm độc tố .............................................................................................5
1.1.4. Thực phẩm thường gây ngộ độc C. botulinum .................................................7
1.2.

Dịch tễ học của C. botulinum trên thế giới và tại Việt Nam ............................7

H
P

1.2.1. Trên thế giới .............................................................................................................. 7
1.2.2. Tại Việt Nam ............................................................................................................. 8
1.3.

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp ......................................................9

1.3.1. Định nghĩa xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp ....................................9
1.3.2. Mục đích xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp ......................................9

U

1.3.3. Phân biệt xác nhận phương pháp (Verification) và xác nhận giá trị sử dụng

của phương pháp (Validation)...................................................................................10
1.3.4. Các thông số xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định tính sử dụng

H

trong nghiên cứu........................................................................................................11
1.3.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) .................................................................................. 12
1.3.4.2. Độ nhạy (Se) ........................................................................................................ 12
1.3.4.3. Độ đặc hiệu (Sp) .................................................................................................. 12
1.3.4.4. Tỷ lệ dương tính giả ............................................................................................ 13
1.3.4.5. Tỷ lệ âm tính giả .................................................................................................. 13
1.3.4.6. Độ đúng ................................................................................................................ 13
1.3.4.7. Hệ số Kappa ......................................................................................................... 14
1.4.

Các phương pháp xác định độc tố C. botulinum ............................................15

1.4.1. Thử nghiệm gây chết chuột ............................................................................15
1.4.2. Phương pháp miễn dịch học ...........................................................................15


iii

1.4.3. Quy trình ni cấy phân lập phát hiện độc tố của vi khuẩn C. botulinum type
A, B………………………………………………………………………………...16
1.4.4. Phương pháp sinh học phân tử .......................................................................17
1.5.

Kỹ thuật LAMP ..............................................................................................18


1.5.1. Lịch sử phát triển của kỹ thuật LAMP ...........................................................18
1.5.2. Nguyên lý chung của kỹ thuật LAMP............................................................18
1.5.3. Thành phần cơ bản của phản ứng LAMP ......................................................19
1.5.4. Cơ chế phản ứng LAMP ................................................................................20
1.5.5. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật LAMP .............................................................21
1.5.5.1. Ưu điểm của kỹ thuật LAMP............................................................................. 21

H
P

1.5.5.2. Nhược điểm của kỹ thuật LAMP ...................................................................... 22
1.5.6. Ứng dụng của LAMP chẩn đoán tác nhân gây bệnh ........................................27
1.5.7. Nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng quy trình LAMP trong phát hiện
C. botulinum ..............................................................................................................27
1.5.8. Nghiên cứu trong và ngồi nước đánh giá quy trình LAMP trong phát hiện C.

U

botulinum ...................................................................................................................28
1.5.9. Nghiên cứu sản xuất bộ kít LAMP phát hiện nhanh gen độc tố của
Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt ...........................................................29

H

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................31
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu..................................................................31

2.2.


Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................31

2.1.1. Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ
dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả: ..............................................................................31
2.1.1. Nghiên cứu so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát
hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B. .............................................31
2.3.

Thiết kế và nội dung nghiên cứu ....................................................................32

2.3.1. Thiết kế thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ
đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện gen độc
tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B ....................................................................32
2.3.1.1. Thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện trên nền mẫu: .................................. 32


iv

2.3.1.2. Thí nghiệm xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ
dương tính giả. ................................................................................................................... 34
2.3.2. Thiết kế thí nghiệm so sánh quy trình LAMP với quy trình ni cấy phát hiện
độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B .............................................................34
2.3.3. Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................36
2.4.

Cỡ mẫu ...........................................................................................................37

2.5.


Phương pháp chọn mẫu ..................................................................................37

2.6.

Phương pháp thu thập số liệu .........................................................................37

2.7.

Các biến số nghiên cứu ..................................................................................38

2.8.

Các quy trình sử dụng trong nghiên cứu ........................................................39

H
P

2.8.1. Quy trình tạo mẫu gây nhiễm thực nghiệm C. botulinum ...............................39
2.8.2. Quy trình LAMP với cặp mồi thiết kế đặc hiệu phát hiện gen độc tố của vi
khuẩn C. botulinum type A, B ...................................................................................39
2.8.2.1. Thành phần phản ứng LAMP ............................................................................ 40
2.8.2.2. Các bước tiến hành .............................................................................................. 42
2.9.

U

Phương pháp phân tích số liệu: ......................................................................45

2.10. Vấn đề đạo đức của nghiên cứu .....................................................................46
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................48

3.1.

H

Xác định giá trị sử dụng của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi

khuẩn C. botulinum type A, B ...................................................................................48
3.1.1. Mẫu thực phẩm (MMO) ..................................................................................48
3.1.2. Mẫu thực phẩm (MPC) ...................................................................................52
3.1.3. Mẫu lâm sàng (MP) .........................................................................................57
3.2. So sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố
của vi khuẩn C. botulinum type A, B ........................................................................62
3.2.1. So sánh kết quả xét nghiệm C. botulinum type A, B trên quy trình LAMP với
quy trình ni cấy phân lập phát hiện gen độc tố .....................................................62
3.2.2. Kết quả so sánh khả năng áp dụng của quy trình LAMP với quy trình ni
cấy phân lập phát hiện gen độc tố .............................................................................66
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................69


v

4.1.Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn
C. botulinum type A, B .............................................................................................69
4.1.1. Giới hạn phát hiện (LOD) trên nền mẫu của quy trình LAMP phát hiện gen
độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B .............................................................70
4.1.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy
trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B trên nền
mẫu…………………………………………………………………………………70
4.1.3. So sánh quy trình LAMP với quy trình PCR phát hiện độc tố của vi khuẩn C.
botulinum type A, B ..................................................................................................71

4.2. So sánh quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát hiện gen độc tố

H
P

của vi khuẩn C. botulinum type A, B ........................................................................73
4.2.1. So sánh kết quả quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát hiện
gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B ......................................................73
4.2.2. So sánh khả năng áp dụng của quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân
lập phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B ................................75

U

KẾT LUẬN ..............................................................................................................78
KHUYẾN NGHỊ......................................................................................................80
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................81

H

PHỤ LỤC .................................................................................................................89


vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

: Acid Deoxy Ribonucleic

bp


: Base pair

BoNT

: Botulinum neurotoxin

CDC

: Trung tâm kiểm sốt và phịng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ

CFU

: Colony Forming Units

CLSI

: Clinical and Laboratory Standards Institute

CS

: Cộng sự

ELISA

: Enzyme – Linked Immunosorbent Assay

Kappa

: Hệ số Kappa


LAMP

: Loop – Mediated Isothermal Amplification

LOD

: Giới hạn phát hiện

MMO

: Mẫu mật ong

MP

: Mẫu phân

MPC

: Mẫu pate chay

NIHE

: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

PCR

: Polymerase Chain Reaction

Real – time PCR


: Real – time Polymerase Chain Reaction

SARS–CoV–2
Se
Sp

H

U

H
P

: Severe acute respiratory syndrome corona virus 2
: Độ nhạy

: Độ đặc hiệu


vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1. Hình ảnh vi khuẩn C. botulinum dưới kính hiển vi điện tử .......................4
Hình 1.2. Hình ảnh khuẩn lạc C. botulinum trong ni cấy trên thạch EYA. ............5
Hình 1.3. Hình ảnh cấu trúc phân tử độc tố C. botulinum type A, B. .........................6
Hình 1.4. Hình ảnh ghi nhận toàn cầu về ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh theo quốc gia từ
năm 1976–2006. ..........................................................................................................8
Hình 1.5. Hình ảnh các vị trí thiết kế các mồi LAMP . ............................................19
Hình 1.6. Hình ảnh tạo vật liệu khởi đầu .................................................................20

Hình 1.7. Hình ảnh tái bản và kéo dài chuỗi ADN . .................................................21
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu……………………………………………….36

H
P

Hình 2.2. Hình ảnh tách chiết ADN từ mẫu thu thập ................................................42
Hình 3. 1. Xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố
của vi khuẩn C. botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MMO)…………………48
Hình 3.2. Xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát hiện gen
độc tố của vi khuẩn C. botulinum type B trên mẫu thực phẩm (MMO). ..................49

U

Hình 3.3. Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen
độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MPC). ...................53
Hình 3.4. Kết quả xác định giới hạn phát hiện giai đoạn một bằng quy trình LAMP

H

phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type B trên mẫu thực phẩm (MPC).
...................................................................................................................................54
Hình 3.5. Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen
độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A trên mẫu lâm sàng (MP). .........................58
Hình 3.6. Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen
độc tố của vi khuẩn C. botulinum type B trên mẫu lâm sàng (MP). .........................59
Hình 3.7. Hình ảnh kết quả sáu mẫu MP dương tính trên quy trình LAMP xác định
gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A ...........................................................63
Hình 3. 8. Hình ảnh kết quả sáu mẫu MMO mẫu dương tính trên quy trình LAMP
xác định gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A ............................................63

Hình 3.9. Hình ảnh kết quả sáu mẫu MP dương tính trên quy trình LAMP xác định
gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type B ...........................................................65


viii

Hình 3.10. Hình ảnh kết quả sáu mẫu MMO dương tính trên quy trình LAMP xác
định gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type B ...................................................65

H
P

H

U


ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Cơng thức tính hệ số Kappa......................................................................14
Bảng 1.2. Đánh giá mức độ đồng thuận gi a 2 phương pháp dựa trên chỉ số Kappa
...................................................................................................................................14
Bảng 1.3. Tóm tắt so sánh ưu nhược điểm của LAMP với quy trình thử nghiệm gây
chết chuột, nuôi cấy, PCR, real – time PCR và ELISA ............................................23
Bảng 2.1. Các biến số nghiên cứu………………………………………………….38
Bảng 2.2. Trình tự mồi đặc hiệu của phản ứng LAMP phát hiện gen độc tố type A,
B của C. botulinum ....................................................................................................40
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng LAMP phát hiện gen độc tố type A, B của ...........42


H
P

Bảng 2.4. Các bước thực hiện quy trình LAMP .......................................................43
Bảng 2.5. Cơng thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ
dương tính giả lý thuyết của quy trình LAMP ..........................................................45
Bảng 2.6. Cơng thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ
dương tính giả và hệ số kappa (K) theo cơng thức ...................................................46

U

Bảng 3.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát
hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm
(MMO)……………………………………………………………………………..50

H

Bảng 3.2. Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen
độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm (MMO). .............51
Bảng 3.3. Kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ
dương tính giả bằng LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A,
B trên mẫu thực phẩm (MMO). ................................................................................52
Bảng 3.4. Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát
hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MPC). .....55
Bảng 3.5. Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng LAMP phát hiện gen độc tố của
vi khuẩn C. botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm (MPC). ................................56
Bảng 3.6. Kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ
dương tính giả bằng LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A,
B trên mẫu thực phẩm (MPC). ..................................................................................57



x

Bảng 3.7. Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát
hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MP). .......60
Bảng 3.8. Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng LAMP phát hiện gen độc tố của
vi khuẩn C. botulinum type A, B trên mẫu lâm sàng (MP). .....................................61
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ
dương tính giả bằng LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A,
B trên mẫu lâm sàng (MP). .......................................................................................62
Bảng 3.10. Kết quả so sánh quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát
hiện độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A ..........................................................64
Bảng 3.11. Kết quả so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát

H
P

hiện độc tố của vi khuẩn C. botulinum type B ..........................................................66
Bảng 3.12. Kết quả so sánh khả năng áp dụng quy trình LAMP với quy trình nuôi
cấy phân lập phát hiện độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B. .......................67

H

U


xi

TÓM TẮT NGHIÊN CỨU
Độc tố thần kinh botulinum gây bệnh ngộ độc thịt được coi là một trong

nh ng chất độc mạnh, được tạo ra chủ yếu bởi vi khuẩn Clostridium botulinum (C.
botulinum). Năm 2021, nhóm nghiên cứu do TS. Lê Huy Hoàng tại Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ương (NIHE) đã thiết lập quy trình khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng
– Loop mediated isothermal amplification (LAMP) phát hiện nhanh gen độc tố của
vi khuẩn C. botulinum gây bệnh ngộ độc thịt. Trên cơ sở đó chúng tơi thiết kế một
nghiên cứu thực nghiệm tại phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme và
protein, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với hai mục tiêu
chính: 1) Xác định giới hạn phát hiện – Limit of Detection (LOD), độ nhạy, độ đặc

H
P

hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện
gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B. 2) So sánh quy trình LAMP với
quy trình ni cấy phát hiện độc tố type A, B của vi khuẩn C. botulinum. Nghiên
cứu được tiến hành từ tháng 10/2021 đến tháng 07/2022. Sử dụng plasmid tái tổ hợp
mang đoạn gen đích của vi khuẩn C. botulinum type A, B và bộ mẫu tự nhiên thêm

U

chuẩn (các mẫu tự nhiên được xác định âm tính với C. botulinum type A, B 3 lần
bằng kỹ thuật nuôi cấy phân lập và PCR phát hiện độc tố tại Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương (NIHE)) để tiến hành thí nghiệm thực hiện mục tiêu 1. Sử dụng các

H

mẫu thực phẩm (mật ong (MMO), mẫu pate chay (MPC)) và mẫu lâm sàng (mẫu
phân (MP)) lưu tại NIHE và kết quả nuôi cấy phân lập xác định độc tố của vi khuẩn
C. botulinum để mục tiêu 2.


Kết quả nghiên cứu cho thấy giới hạn phát hiện của quy trình LAMP phát
hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm ( MMO,
MPC) và mẫu lâm sàng (MP) đều là 1.0x102 copies/gam. Độ nhạy, độ đặc hiệu, độ
đúng của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A,
B trên mẫu thực phẩm (MMO, MPC) và mẫu lâm sàng (MP) là 100%, tỷ lệ âm tính
giả, tỷ lệ dương tính giả là 0%.
Kết quả so sánh quy trình LAMP với quy trình ni cấy phát hiện gen độc tố
của vi khuẩn C. botulinum type A, B như sau: Độ nhạy, độ đặc hiệu và độ đúng lần
lượt là 91.6, 100, và 98.8%, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả lần lượt là 8.33 và


xii

0%, hệ số kappa là 0.986 cho thấy mức độ đồng thuận gần như hồn tồn gi a 2
quy trình. Quy trình LAMP cho thấy nhiều ưu điểm hơn so với quy trình ni cấy
phát hiện gen độc tố của vi khuẩn của vi khuẩn C. botulinum type A, B, có khả năng
trở thành thường quy và thay thế quy trình ni cấy phân lập phát hiện gen độc tố
của vi khuẩn C. botulinum type A, B.

H
P

H

U


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nhức nhối không chỉ ở Việt Nam mà là
vấn đề chung của toàn cầu. Độc tố botulinum được sản sinh bởi vi khuẩn
Clostridium botulinum (C. botulinum) có thể xuất hiện trong thực phẩm, và gây nên
bệnh ngộ độc thịt sau khi ăn phải. Các trường hợp ngộ độc C. botulinum ở người
chủ yếu do hai loại độc tố type A, B. Tại Mỹ mỗi năm có 70 – 100 trường hợp ngộ
độc thịt được báo cáo, Nhật Bản và rất nhiều quốc gia khác trên thế giới đã có thống
kê về ngộ độc C. botulinum (1). Theo báo cáo của trung tâm kiểm sốt và phịng
ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) cho thấy khoảng 15% trong số 145 trường hợp ngộ
độc thịt được báo cáo trong năm 2011 là do thực phẩm (2).

H
P

Tại việt Nam đầu năm 2020 trên phạm vi nhiều tỉnh thành của cả nước đã
xuất hiện nhiều ca nghi ngờ ngộ độc thịt đến khám và điều trị (3). Thực tế lâm sàng
cho thấy bệnh ngộ độc thịt do độc tố thần kinh của C. botulinum mang tính cấp tính
nặng, tiến triển nguy kịch rất nhanh, tỉ lệ tử vong và gây biến chứng rất cao vì vậy
việc chẩn đốn nhanh, chính xác là điều kiện tiên quyết cứu sống người bệnh, giúp

U

người bệnh phục hồi, giảm biến chứng. Hiện nay, có bốn loại xét nghiệm chính để
chẩn đoán C. botulinum bao gồm xét nghiệm miễn dịch phát hiện độc tố, thử
nghiệm gây chết chuột, nuôi cấy phân lập phát hiện độc tố C. botulinum và phương

H

pháp khuếch đại gen sinh độc tố (4). Xét nghiệm miễn dịch có ưu điểm nhanh, đơn
giản nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp; thử nghiệm gây chết chuột có độ nhạy, đặc
hiệu cao nhưng mất công sức, thao tác phức tạp, giá thành đắt và liên quan đến vấn

đề y đức do sử dụng động vật sống làm thí nghiệm; nuôi cấy phân lập phát hiện độc
tố C. botulinum cần thời gian dài. Do vậy các phương pháp này đều chưa đáp ứng
được tính cấp thiết trong chẩn đốn ca bệnh ngộ độc do C. botulinum. Trong
phương pháp khuếch đại gen sinh độc tố, quy trình LAMP là một kỹ thuật khuếch
đại axit nucleic diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt (trong khoảng 60–65˚C). Khi được
tối ưu, phản ứng LAMP có thể đạt ngưỡng bão hịa với nồng độ khn từ vài bản
sao với thời gian dưới 30 phút, cho phép phát hiện nhanh hơn và giới hạn phát hiện
thấp hơn 100 lần so với PCR (5).


2

Năm 2021, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (NIHE) đã thiết lập quy trình
LAMP (thiết kế mồi, điều kiện phản ứng…) phát hiện nhanh gen độc tố của C.
botulinum gây bệnh ngộ độc thịt. Đây cũng là cơng trình nghiên cứu đầu tiên ứng
dụng quy trình LAMP trong chẩn đốn bệnh ngộ thịt ở nước ta. Tuy nhiên, nhóm
nghiên cứu chưa đánh giá các thông số xác nhận giá trị sử dụng phương pháp như
giới hạn phát hiện, độ nhạy, đặc hiệu trên các mẫu lâm sàng để đánh giá ảnh hưởng
của nền mẫu, quá trình tách chiết đến hiệu quả của quy trình LAMP. Do vậy, học
viên tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu “Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình
LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum type A, B”.

H
P

H

U



3

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương
tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C.
botulinum type A, B.
2. So sánh thông số kỹ thuật (độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính
giả, tỷ lệ âm tính giả, hệ số kappa) quy trình LAMP và quy trình ni cấy phát hiện
gen độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B.

H
P

H

U


4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Vi khuẩn Clostridium botulinum

1.1.1. Đặc điểm hình thể và tính chất sinh vật hóa học Clostridium botulinum
Clostridium botulinum (C. botulinum) là trực khuẩn kỵ khí, có khả năng di
động và sinh nha bào. Nha bào hình oval, ở gần đầu tế bào, chỗ có nha bào bị phình
ra. Trên tiêu bản nhuộm gram, vi khuẩn bắt màu gram dương, có hình dạng thẳng

hoặc hơi cong, kích thước chiều rộng 0.5 – 2 µm, chiều dài 1.6 – 22 µm, có nha bào
ở gần tận cùng (Hình 1.1).

H
P

U

H

Hình 1. 1. Hình ảnh vi khuẩn C. botulinum dƣới kính hiển vi điện tử (6).
1.1.2. Tính chất ni cấy

Vi khuẩn C. botulinum phát triển ở môi trường lỏng, sinh H2S và sinh mùi
khó chịu với điều kiện thuận lợi trong thức ăn, vi khuẩn tiết ra ngoại độc tố thần
kinh có độc tính rất cao, cao hơn hẳn độc tố của các vi khuẩn khác. So với độc tố
uốn ván, độc tố C. botulinum mạnh gấp 7 lần. Liều gây nhiễm tối thiểu là 104 – 105
CFU/g thực phẩm (4).
Khuẩn lạc C. botulinum trịn, bờ khơng đều và đường kính khoảng 3mm,
nhưng đường kính có thể tăng đến 8mm sau thời gian ủ dài hơn. Khuẩn lạc có thể


5

vồng lên hoặc dẹt, thơ ráp hoặc trơn bóng và thường có xu hướng lan. Tuy nhiên,
hình thái khuẩn lạc của các chủng thuần khiết thuộc giống Clostridium có thể rất
khác nhau nên nuôi cấy thường bị nhầm lẫn. Khi cấy chuyển các khuẩn lạc thuần thì
khuẩn lạc thường giống nhau gi a các nhóm khác nhau. Chủng vi khuẩn C.
botulinum sản sinh enzyme lipolytic (enzyme tiêu mỡ), tạo ra a xít béo tự do từ lịng
đỏ trứng (trong thạch EYA) kết tủa phía dưới khuẩn lạc và tạo màng óng ánh (lớp

ngọc trai – Hình 1.2) bao phủ khuẩn lạc. Một số chủng của nhóm III cịn có khả
năng sinh lecithinase (vùng kết tủa). Nhìn chung, khuẩn lạc của tất cả các nhóm C.
botulinum thường được bao quanh bởi vịng tan máu hồn tồn. Ni cấy kỵ khí đặc
trưng bởi mùi hơi thối do sinh a xít béo bay hơi, sản phẩm cuối cùng của amin và

H
P

H2S (4).

U

H

Hình 1.2. Hình ảnh khuẩn lạc C. botulinum trong ni cấy trên thạch EYA (7).
1.1.3. Phân nhóm độc tố

Dựa vào đặc điểm huyết thanh, độc tố thần kinh của C. botulinum được chia
thành các type độc tố kí hiệu từ A đến H và một số subtype. Tuy nhiên sự phân loại
này đã lỗi thời mà dựa vào kiểu gen và kiểu hình người ta chia C. botulinum làm 4
nhóm khác nhau đánh số từ I – IV. C. botulinum nhóm I là nhóm ly giải protein và
nhóm II là nhóm khơng ly giải protein (4). Thơng thường nhóm I, II gây bệnh trên
người, nhóm III gây bệnh trên động vật, nhưng có xuất hiện ngoại lệ. Nhóm IV
thường khơng gây bệnh, hiện nay được đổi tên thành C. argentinense. Trong số


6

chủng gây bệnh trên người, chủng nhóm I sản sinh độc tố type A, B hoặc F và
chủng nhóm II sinh độc tố type B, E hoặc F (4).

Về cấu trúc phân tử độc tố C. botulinum là protein lớn có trọng lượng phân
tử type A và B lần lượt là 900 kDa và 150 kDa với hoạt tính của enzym zincendopeptidase (Hình 1.3). Phân tử độc tố thần kinh được tiết ra nguyên bản có chứa
cả cấu phần độc tố cũng như cấu phần không độc tố. Cấu phần không độc tố bảo vệ
cấu phần độc tố khỏi áp lực môi trường và hỗ trợ cấu phần độc tố thẩm thấu vào cơ
thể. Phân tử độc tố thần kinh chứa 2 tiểu đơn vị gồm 1 chuỗi nặng và 1 chuỗi nhẹ
(8, 9).

H
P

U

H

Hình 1.3. Hình ảnh cấu trúc phân tử độc tố C. botulinum type A, B (10).
Độc tố type A và B là hai type gây bệnh chủ yếu (11-13). Hiện nay có bốn
phương pháp chính phát hiện và phân loại độc tố thần kinh bao gồm thử nghiệm gây
chết chuột, phương pháp miễn dịch học, phương pháp sinh học phân tử (PCR,
realtime PCR) và quy trình ni cấy phân lập phát hiện độc tố. Thử nghiệm chết
chuột được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán xác định độc tố botulinum type
A, B. Tuy nhiên phương pháp này tốn kém, phức tạp và có liên quan đến vấn đề đạo
đức do sử dụng động vật thí nghiệm nên chỉ được sử dụng hạn chế tại một vài
phòng thí nghiệm trên thế giới. Phương pháp miễn dịch có độ nhạy và độ đặc hiệu


7

không cao. Phương pháp nuôi cấy phân lập phức tạp và gặp khó khăn trong việc
định danh được vi khuẩn C. botulinum ngay cả trên nh ng hệ thống định danh tự
động do C. botulinum là vi khuẩn dùng làm vũ khí sinh học nên WHO, CDC Hoa kì

quản lý chặt ch thư viện máy. Để định danh vi khuẩn và xác định type độc tố
phương pháp PCR thường được áp dụng dựa trên nh ng cặp mồi đặc hiệu nhận biết
sự có mặt của các ADN đặc hiệu quy định độc tố type A và B. Chính vì vậy các quy
trình sinh học phân tử (PCR, realtime PCR) đang là phổ biến hiện nay để chẩn đoán
và phân loại độc tố của vi khuẩn C. botulinum type A, B) (14).
1.1.4. Thực phẩm thường gây ngộ độc C. botulinum
Vi khuẩn C. botulinum có mặt phổ biến trên thực phẩm đóng hộp, đặc biệt là

H
P

thức ăn có độ acid thấp (pH> 4.5), đây là nguồn thực phẩm có nguy cơ cao nhiễm
độc tố botulinum; 10% số ca ngộ độc do độc tố botulinum trong thực phẩm liên
quan đến các sản phẩm thực phẩm chế biến thương mại. Độc tố botulinum được
sinh ra do vi khuẩn C. botulinum trong môi trường kỵ khí Các sản phẩm từ rau, củ,
quả, thịt, hải sản lên men, đóng hộp khơng đảm bảo điều kiện an tồn thực phẩm có

U

nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn C. botulinum và sinh độc tố botulinum.Trong các vụ
dịch bùng phát gây ra bởi hải sản, type E gây ra khoảng 50%; các type A và B gây
ra phần còn lại (15).

H

Một số ca lâm sàng khi ăn thực phẩm nướng còn thừa để ở nhiệt độ phòng
hoặc để trong lò nướng qua đêm. Hầu hết bệnh ngộ độc thịt liên quan tới đồ hộp
làm tại nhà, thực phẩm có độ a xít thấp, sản phẩm thịt như xúc xích, pa tê và giăm
bơng, cá muối hoặc cá lên men. Ngồi ra, các sản phẩm như s a chua lên men
truyền thống thời gian dài, phô mai mềm, dầu tỏi và khoai tây bọc giấy bạc nướng

cũng có thể gây bệnh ngộ độc thịt (16). Trong khi hàm lượng độc tố trong mơ của
động vật vừa chết vẫn cịn chưa rõ, một vài ca lâm sàng đã báo cáo do ăn các mô
sống từ xác cá voi (17).
1.2.

Dịch tễ học của C. botulinum trên thế giới và tại Việt Nam

1.2.1. Trên thế giới
Theo một báo cáo mới nhất của CDC trong năm 2017 tại hoa kỳ, 182 trường
hợp ngộ độc thịt được các phịng thí nghiệm xác định đã được báo cáo cho CDC.


8

Trong đó 141 (77%) trường hợp là trẻ sơ sinh, 19 (10%) trường hợp do thực phẩm,
19 (10%) trường hợp đến từ vết thương và 3 (1%) trường hợp khác. Cũng theo công
bố này của CDC trong các trường hợp ngộ độc thịt được báo cáo có 87 trường hợp
do độc tố của C. botulinum type A và 89 trường hợp do C. botulinum type B (18).
Theo một nghiên cứu có quy mơ lớn của Ruth Koepke và CS trong giai đoạn
từ năm 1976 – 2006 tại tất cả các tiểu Bang của Hoa Kỳ và các quốc gia châu Á bao
gồm Nhật Bản, Trung Quốc cũng đã xác định nh ng ca ngộ độc do C. botulinum
(19) (Hình 1.4).

H
P

U

Hình 1.4. Hình ảnh ghi nhận tồn cầu về ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh theo quốc


H

gia từ năm 1976–2006 (20).

1.2.2. Tại Việt Nam

Tại Việt Nam tính đến thời điểm trước năm 2020, chưa có báo cáo ca bệnh
ngộ độc thịt trên người nào được báo cáo.Vài năm trước chỉ có một số ít nghiên cứu
về bệnh ngộ độc thịt ở vịt và việc phân lập C. botulinum do một số tác giả tại Cần
thơ (21-23). Tuy nhiên cho đến đầu tháng 8 năm 2020 trên phạm vi nhiều tỉnh thành
trong cả nước đã có xuất hiện nhiều ca nghi ngờ bệnh ngộ độc thịt đến khám và
điều trị tại các bệnh viện (bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện bệnh Nhiệt đới thành phố
Hồ Chí Minh, bệnh viện Chợ Rẫy, bệnh viện Đa khoa Vĩnh Đức ở Quảng Nam).
Điển hình là chùm ca bệnh là 2 vợ chồng ăn pate Minh Chay, xuất hiện triệu chứng
tăng tiết đờm dãi, khó nuốt, khó thở, tê yếu 2 tay, sụp mí mắt 2 bên, nhìn mờ và


9

phải thở máy. Tuy nhiên gần 2 tuần sau MPC và MP bệnh nhân mới được gửi tới
phịng thí nghiệm vi khuẩn kỵ khí viện NIHE xét nghiệm và kết luận mẫu pate
dương tính với C. botulinum độc tố B và MP âm tính với C. botulinum(3). Gần đây
nhất, tháng 3 năm 2021 theo báo cáo của sở y tế Kon Tum cho biết đã có 25 người
nhập viện vì nhiễm độc tố của C. botulinum, 3 trường hợp trong số đó đã tử vong
(24). Việt Nam hiện cũng chưa sẵn có thuốc điều trị đặc hiệu (kháng độc tố C.
botulinum), bệnh nhân phải chờ nhập thuốc nước ngoài, nên bệnh tình càng trầm
trọng. Tổng hợp tài liệu trên y văn cũng cho thấy, kháng độc tố có hiệu quả tốt nếu
dùng ở giai đoạn bệnh sớm, khi độc tố chưa bám vào đầu mút thần kinh.
1.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp


H
P

1.3.1. Định nghĩa xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm
tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng
được các yêu cầu đặt ra. Kết quả của xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp có
thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Trong

U

các tiêu chuẩn phiên bản mới nhất TCVN/ISO 15189:2015 (25); TCVN/ISO 17025:
2017 (26) đều dùng thuật ng xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (Validation)
thay cho thẩm định phương pháp như trước đây.

H

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp có hai dạng. Một là xác xác nhận
phương pháp (Verification) áp dụng với các phương pháp theo tiêu chuẩn quốc gia,
quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như TCVN, ISO,
ASTM, AOAC…Hai là xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (Validation): Áp
dụng với các phương pháp không tiêu chuẩn, phương pháp nội bộ do phòng xét
nghiệm xây dựng, phương pháp chuẩn được sử dụng ngoài phạm vi áp dụng, hoặc
phương pháp tiêu chuẩn nhưng có sửa đổi (25, 26).
1.3.2. Mục đích xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
Mục đích chung của xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là đánh giá
sai số, trong đó bao gồm việc xác định tiêu chuẩn kỹ thuật (analytical goal) phù hợp
mục đích sử dụng trước khi đưa phương pháp vào áp dụng. Chuyển các số liệu sang



10

sai số ước tính bằng thống kê. So sánh sai số ước tính với các tiêu chuẩn sai số cho
phép về y khoa (27, 28).
Theo yêu cầu của ISO 17025 (26), ISO 15189 (25), phương pháp phân tích
phải được xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp khi (29): 1) Nhà sản xuất
muốn đưa một phương pháp xét nghiệm mới, hoặc phương pháp cũ được cải tiến ra
thị trường thì xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là yêu cầu bắt buộc; 2)
Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn (nonstandard method);
3) Phương pháp do phòng xét nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa vào sử dụng
thành thường quy; 4) Có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp
dụng của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn; và 5) Có sự thay

H
P

đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm định (ví dụ: thiết bị phân
tích với các đặc tính khác biệt, nền mẫu,...).

1.3.3. Xác nhận phương pháp (Verification) và xác nhận giá trị sử dụng của
phương pháp (Validation)

Xác nhận phương pháp (Verification) được thực hiện đối với các phương

U

pháp đã được chuẩn hóa, các kỹ thuật mới trước khi áp dụng cần xác nhận lại giá trị
so với công bố của nhà sản xuất hay phương pháp đó đáp ứng yêu cầu đặt ra. Yêu
cầu này không chỉ cho các phương pháp thử nội bộ mà còn cần cho các phương


H

pháp tiêu chuẩn. Hay nói các khác chúng ta thực hiện xác nhận lại trên một phương
pháp tiêu chuẩn đã có sẵn, đã được nhà sản xuất tối ưu và công bố các thơng số giá
trị cụ thể của phương pháp. Có hai yêu cầu chủ yếu của việc xác nhận giá trị sử
dụng của phương pháp: 1) Phải có kết quả thẩm định của phương pháp tiêu chuẩn,
và kết quả này phải phù hợp với yêu cầu của phòng thử nghiệm; 2) Phịng thử
nghiệm cần đảm bảo có thể đạt được các thông số được mô tả trong phương pháp
tiêu chuẩn sau khi xác nhận lại giá trị sử dụng (25-28).
Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (Validation) thực hiện với các
phương pháp không tiêu chuẩn, phương pháp nội bộ do phòng xét nghiệm xây
dựng, phương pháp chuẩn được sử dụng ngoài phạm vi áp dụng, hoặc phương pháp
tiêu chuẩn nhưng có sửa đổi. Q trình này phải trải qua nhiều bước hơn, bắt đầu từ
quá trình nghiên cứu khảo sát phương pháp, tối ưu hóa phương pháp đến khi hoàn


11

thiện phương pháp. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là một yêu cầu bắt
buộc phải thực hiện đi kèm với việc phát triển phương pháp mới và áp dụng các
phương pháp không tiêu chuẩn vào thực hiện thành thường quy (25-28).
1.3.4. Các thông số xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định tính sử
dụng trong nghiên cứu
Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào
nguồn gốc có thể phân loại các phương pháp thành hai nhóm: 1) Các phương pháp
tiêu chuẩn : Các phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa
học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như TCVN, ISO, ASTM, AOAC…; 2)
Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ: Là các phương pháp


H
P

do phòng thử nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của nhà sản xuất
thiết bị, phương pháp theo các tạp chí, tài liệu chuyên ngành... (27, 28).
Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng trong
phương pháp, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thử
nghiệm. Từng trường hợp cụ thể các thông số thẩm định có thể có sự khác nhau.

U

Đối với phương pháp định tính hoặc bán định lượng ví như phương pháp
LAMP. Theo Trần Cao Sơn, các thông số cần lựa chọn để thẩm định gồm: giới hạn
phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lệch dương (tỷ lệ dương tính giả), độ lệch âm (tỷ

H

lệ âm tính giả) (27).

Tiêu chuẩn cải tiến phịng thí nghiệm lâm sàng – CLIA (Vol. 23, No. 3) User
Validation of Laboratory-Developed Molecular Assays for Infectious Diseases
(CLIA) (30) là tổ chức phi lợi nhuận, thiết lập và duy trì các tiêu chuẩn, thúc đẩy
kiểm tra chất lượng, tăng cường cung cấp dịch vụ chăm sóc bệnh nhân và cải thiện
sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới và được Cục quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận. CLIA tham gia xây dựng các tiêu chuẩn quốc tế
với tư cách là ban thư ký của ủy ban kỹ thuật ISO. So sánh gi a bộ tiêu chuẩn
TCVN ISO 15189:2014 (25) và tiêu chuẩn ISO 17025:2017 (26) thì các hướng dẫn
của CLIA (30) có số thực nghiệm và thời gian phân tích ít hơn. Vì vậy, trong đề
tài này chúng tôi sử dụng các hướng dẫn của CLIA để xác định giá trị sử dụng
phương pháp để tiết kiệm hơn về chi phí và thời gian.