Công nghệ Enzym -
Protein
Đại cương

Công nghệ enzym: ứng dụng enzym hoặc xúc tác sinh học để tạo
ra sản phẩm hay dịch vụ

Ứng dụng của enzym

Công nghiệp:

Thực phẩm: Làm bánh mì, rượu bia, các sản phẩm sữa

Tẩy rửa: protease, lipase

Xử lý tinh bột: các amylase, isomerase

Dệt-da: amylase, lipase, cellulase

Y Dược

Trợ tiêu hóa: amylase, protease

Chẩn đoán: Alcol dehydrogenase, Cholesterol esterase, Creatinase,
Glucose oxidase, Uricase

Điều trị: Asparaginase, Lactamase, Urease, Uricase, Streptokinase

Hóa dược: Steroid, Ibuprofen, Salbutamol, Propanolol

Nghiên cứu: Endonuclease, RNase, DNase, Polymerase, Ligase

Khái niệm xúc tác sinh học

Enzym là chất xúc tác của các quá trình sinh học,

Bản chất là protein

Giúp phản ứng đạt được điểm cân bằng nhanh hơn

Enzym không thể xúc tác phản ứng với sự thay đổi
năng lượng tự do không thuận lợi trừ khi phản ứng
đó có thể song hành với một phản ứng khác có sự
thay đổi năng lượng tự do thuận lợi hơn

Giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn trong điều kiện
bình thường về áp suất, nhiệt độ, pH
Công nghệ enzym hiện đại

Hóa học protein

Lý sinh phân tử

Sinh học phân tử

Cấu trúc, hoạt động của protein-enzym

Can thiệp để thay đổi phân tử protein-enzym
Nhu cầu sử dụng enzym
Chỉ tiêu Công nghiệp Phân tích Dược phẩm
Lượng sử
dụng

Tấn
Milligam  gam Milligam  gam
Độ tinh
khiết
Không tinh
khiết
Tinh thể tinh
khiết
Tinh thể tinh
khiết
Nguồn gốc Vi sinh vật,
thường ngoại
bào
Vi sinh vật, động
vật, thực vật,
thường nội bào
Vi sinh vật, động
vật, thực vật,
thường nội bào
Giá sản
xuất
Thấp Trung bình Cao
Xúc tác sinh học

Tính chọn lọc cao

Chọn lọc theo vị trí nhóm hóa học

Chọn lọc không gian


Hoạt động trên cơ chất đa dạng

Hoạt động được trong môi trường không phải là
nước

Khả năng đảm nhận lượng cơ chất cao

Có độ bền đủ cao

Tính kinh tế
Tính chọn lọc theo vị trí
N
N
N
N
O
CH
3
NH
2
O
OH
HO
HO
N
N
N
N
O
CH

3
NH
2
O
OH
HO
O
CH
3
O
5'
vinyl acetat
C. antarctica
lipase

Dẫn xuất Purine (Nelarabine)

Sản phẩm acyl hóa
Tính chọn lọc không gian
COOCH
3
H
3
CO
COOH
H
3
CO
COOCH
3

H
3
CO
lipase
H
2
O
+


(R,S)-naproxen methyl ester

(S)-naproxen

(R)-naproxen methyl ester
Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu

Chiết tách

Động vật

Thực vật

Lên men

Vi sinh vật

Nuôi cấy tế bào

Công nghệ gen

Sản xuất enzym - Nguồn nguyên liệu

Chiết tách từ mô: lysozym, papain, bromelin, …

Lên men bề mặt: amylase, protease nấm mốc
 Lên men chìm: các enzym dùng trong phân tích và y
học
 Qui mô lớn: enzym thô dùng trong công nghiệp

Qui mô nhỏ: enzym dùng trong y học

Chủng được chọn lọc thông qua biến đổi di truyền

Tăng hoạt tính

Tính ổn định

Nhiệt độ, pH tối ưu

Chuyển gen sản xuất enzym vào các ký chủ dễ nuôi cấy
Phương pháp sản xuất - Tổng quát
Chuẩn bị nguyên liệu
Chiết tách
Cô đặc
Tinh chế
Hoàn chỉnh sản phẩm
• Loại bỏ mô tạp
• Phá vỡ tế bào
• Ly tâm, lắng
• Tủa bông

• Lọc
• Bay hơi
• Tủa
• Siêu lọc
• Kết tinh trực tiếp
• Sắc ký
• Hấp phụ
• Cô đặc
• Kết tinh
• Đông khô
• Ổn định
Chuẩn bị nguyên liệu sinh học

Cơ quan động vật

Loại chất béo và mô liên kết trước khi đông lạnh

Bảo quản lạnh đến khi đủ mẫu để xử lý

Nghiền trên máy nghiền thịt và enzym được chiết với dung dịch
đệm.

Enzym để phá vỡ tế bào

Nguyên liệu thực vật

Thực vật có thể được nghiền và chiết với dung dịch đệm.

Tế bào cũng có thể được phá vỡ bằng cách xử lý với enzym.


Vi sinh vật

Ngoại bào: tách tế bào ra khỏi dung dịch lên men.

Nội bào: phá vỡ tế bào
Các phương pháp phá vỡ tế bào
 Áp suất cao (Manton - Gaulin, French-
press)
 Nghiền (máy nghiền bi)
 Siêu âm
 Làm khô (đông khô, dung môi hữu cơ)
 Ly giải:

Vật lý: đông lạnh, sốc thẩm thấu

Hóa học: chất tẩy, kháng sinh

Enzym: lysozyme, kháng sinh
French-press
Sản xuất enzym - Chiết tách

Tách dịch enzym ra khỏi các phần khác.

Lắng

Ly tâm liên tục

Lọc

truyền thống


lọc áp suất, lọc chân không
 lọc chảy qua (cross-flow filtration).

Phương pháp kết bông
Cô đặc

Bay hơi

Kết tủa

Muối
 Dung môi hữu cơ

Polymer

Siêu lọc
Tinh chế

Kết tinh

Điện di

Sắc ký
Loại sắc ký Nguyên lý Tách theo
Hấp phụ Liên kết bề mặt Ái lực bề mặt
Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cực
Trao đổi ion Liên kết ion Điện tích
Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thước và hình dạng phân tử
Ái lực Hấp phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tử

Kỵ nước Tương tác kỵ nước Cấu trúc phân tử
Đồng hóa trị Liên kết đồng hóa trị Tính phân cực
Đánh bắt ion kim
loại
Sự thành lập phức Cấu trúc phân tử
Nguyên lý Sắc ký
Nguyên lý Sắc ký
Chọn Phương pháp sắc ký
GF = Lọc gel
AC = Sắc ký Ái lực
IEX = Sắc ký Trao đổi Ion
HIC = Sắc ký Tương tác kỵ nước
RPC = Sắc ký Pha đảo
Ví dụ tinh chế amylase bằng hấp phụ
Dịch Enzym thô
Phức Enzym Alginat natri
Tủa Enzym Alginat Calci
Dịch Enzym tinh
• Natri alginat
• Calcium chlorid
• Lọc lấy tủa
• Phản hấp phụ
• Lọc lấy dịch
Dịch tạp chất
Alginat Calci
Sản phẩm amylase
• Cô đặc
• Thẩm tích
Ví dụ sản xuất
Taq

polymerase
Thermus aquaticus
hay E.coli tái tổ hợp
Môi trường
Lên men
Thu tế bào
Phá tế bào
Tủa (NH
4
)
2
SO
4
Thẩm phân
Cột DEAE
Cột Hydroxyapatide
Cột DEAE
Cột phosphocellulose
Taq polymerase tinh khiết
Môi trường thừa
Xác tế bào
Dịch nổi
Enzym cố định

Ưu điểm

Enzym có thể được sử dụng lặp lại nhiều lần

Chế phẩm bền hơn enzym tự do


Enzym cố định có tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản
xuất ở mức độ tự động hóa cao.

Nhờ sự cố định mà enzym không lẫn vào sản phẩm
cuối

Enzym cố định bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng
loại

Nhược điểm

Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu.

Cản trở về không gian do liên kết với chất mang làm
hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất.
Vật liệu cố định

Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm hoặc dễ tổng hợp

Chất mang phải có tính cơ lý ổn định

Chất mang phải bền vững về mặt hóa học, không
hòa tan trong môi trường phản ứng.

Chất mang phải có diện tích bề mặt lớn

Có khả năng trương nở trong môi trường
Các phương pháp cố định enzym
Đặc tính
Phương pháp liên kết với chất mang Phương pháp khác

Hấp phụ
vật lý
Liên kết
ion
Liên kết
đồng hóa trị
Liên kết
chéo
Bắt giữ
Kỹ thuật Dễ Dễ Khó Khó Khó
Hoạt tính enzym Thấp Cao Cao Trung bình Cao
Tính đặc hiệu cơ
chất
Không đổi Không đổi Thay đổi Thay đổi Không đổi
Lực liên kết Yếu Trung bình Mạnh Mạnh Mạnh
Khả năng tái cố
định
Có thể Có thể Không Không Không
Khả năng ứng dụng Thấp Trung bình Trung bình Thấp Cao
Chi phí cố định Thấp Thấp Cao Trung bình Thấp