HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
------------------------------------------------

LÊ THỊ KHUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS
CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE
PHÂN GIẢI LACTOSE

Hà Nội – 09/2021


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

HOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
------------------------------------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS
CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE
PHÂN GIẢI LACTOSE

Người thực hiện

: LÊ THỊ KHUYÊN

Mã sinh viên

: 620767

Lớp

: K62CNTPA

Ngành

: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn

: TS V QU NH H

Địa điểm thực tập

NG

: KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội – 09/2021


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của cá nhân tôi dƣới sự hƣớng
dẫn khoa học của TS. Vũ Quỳnh Hƣơng. Các nội dung nghiên cứu trong đề tài của tôi
là trung thực và chƣa cơng bố dƣới bất kỳ hình thức nào trƣớc đây.
Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh
giá đƣợc cá nhân thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ nguồn gốc. Nếu phát hiện
có bất kỳ sự gian lận nào tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung bài khóa luận

của mình.

Hà Nội, ngày 6 tháng 9 năm 2021
Sinh viên thực hiện

Lê Thị Khuyên

i


LỜI CẢM

N

Q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp là giai đoạn quan trọng nhất trong
quãng đời mỗi sinh viên. Với tôi, đƣợc học tập trong môi trƣờng của Học viện Nông
nghiệp Việt Nam và nhận đƣợc sự dạy dỗ, giúp đỡ tận tình của thầy cơ khoa Cơng
nghệ thực phẩm là điều mà tôi luôn trân trọng. Đặc biệt, tôi phải gửi lời cảm ơn sâu
sắc đến giảng viên hƣớng dẫn của tôi, TS. Vũ Quỳnh Hƣơng, ngƣời đã ln sát cánh
bên tơi trong suốt q trình thực hiện môn học đặc biệt này. Cảm ơn cô đã định hƣớng
nghiên cứu, giải đáp mọi thắc mắc và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tơi có thể hồn
thành khóa luận tốt nghiệp.
Xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ thực phẩm đã trang bị
những kiến thức, kĩ năng cần thiết, tạo điều kiện để tôi nghiên cứu và học hỏi. Đồng
thời tôi xin cảm ơn chị Phạm Thị Dịu và các bạn sinh viên trong nhóm thực hiện khóa
luận tốt nghiệp đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình hồn thành đề tài.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến Dự án VIBE, Khoa Cơng nghệ thực phẩm
đã tài trợ kinh phí để tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu là một phần
của dự án VIBE này.
Cuối cùng, tôi cảm xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã ở luôn bên cạnh ủng hộ

tinh thần, động viên trong thời gian tơi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tuy nhiên, đây là nghiên cứu khoa học đầu tiên do tôi thực hiện nên khơng
tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của thầy cơ và
các bạn để bản báo cáo này đƣợc hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 6 tháng 9 năm 2021
Sinh viên thực hiện

Lê Thị Khuyên

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ........................................................... v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................................... 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu ...................................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ....................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu......................................................................................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
2.1. T ng quan về sữa tƣơi .................................................................................................. 3
2.1.1. Khái niệm ..................................................................................................... 3
2.1.2. Tình hình phát triển ngành cơng nghiệp sữa Việt Nam hiện nay ................ 4
2.1.3. Tiềm năng phát triển ngành sữa và các sản phẩm sữa không lactose .......... 5

2.2. Vi khuẩn Bacillus .......................................................................................................... 8
2.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus ........................................................ 8
2.2.2. Ứng dụng của Bacillus trong thực phẩm.................................................... 10
2.3. Enzyme β-galactosidase ............................................................................................. 11
2.3.1. Đặc điểm chung của enzyme β-galactosidase ............................................ 11
2.3.2. Vai tr của β-galactosidase ........................................................................ 12
2.3.3. Tình hình nghiên cứu β-galactosidase có liên quan đề tài ......................... 12
PHẦN 3 ĐỐI T ỢNG – NỘI DUNG VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14

3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................................. 14
iii


3.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................................... 15
3.3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................... 17
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................................ 17
3.4.1. Xác định mơi trƣờng ni cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus ............... 18
3.4.2. Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase .............. 18
3.4.3. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase ............................ 21
3.4.4. Phƣơng pháp tinh sạch sơ bộ β-galactosidase bằng muối amonisunfate ... 24
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 25
4.1. Xác định môi trƣờng phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Bacillus ................................. 25
4.2. Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase ............................ 26
4.2.1. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase từ các chủng
phân lập từ sữa tƣơi .............................................................................................. 26
4.2.2. Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase từ các chủng trong bộ
sƣu tập có sẵn ....................................................................................................... 27
4.3. Xác định hoạt độ β-galactosidase của vi khuẩn ........................................................ 30

4.4. Tinh sạch sơ bộ β-galactosidase ................................................................................. 31
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................... 33
5.1. Kết luận........................................................................................................................ 33
5.2. Đề nghị......................................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 34
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 38

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
Abs 420nm

: Độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 420nm

Abs 595nm

: Độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 595nm

cs

: Cộng sự

FDA

: Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ

GRAS

: Generally Recognized As Safe


IPTG

: Isopropyl β–D–1-thiogalactopyranoside

LB

: Lysogeny Broth

NA

: Nutrient Agar (môi trƣờng thạch dinh dƣỡng)

NB

: Nutrient Broth (môi trƣờng canh thang)

oNPG

: Ortho– nitrophenyl-β-D-galactopyranoside

oNP

: Ortho – nitrophenol

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosit

v/v


: Thể tích/thể tích

w/v

: Khối lƣợng/thể tích

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần dinh dƣỡng trong 100g sữa b tƣơi .............................................3
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn đƣợc chọn để nghiên cứu .............................................15
Bảng 3.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu .....................................................................16
Bảng 3.3. Danh sách hóa chất .......................................................................................17
Bảng 4.1. Thời gian nuôi chủng Bacillus trong môi trƣờng lỏng .................................25
Bảng 4.2. Kết quả định tính các chủng Bacillus sau phân lập với X-gal ......................27
Bảng 4.3. Kết quả định tính các chủng Bacillus trong bộ sƣu tập với X-gal ................29

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cơ cấu doanh thu thị trƣờng sữa Việt Nam4 (Nguồn: Euromonitor, trích từ
Vneconomy.vn) ................................................................................................................4
Hình 2.2. Sự thay đ i thói quen tiêu dùng sữa của ngƣời Việt Nam do tác động của
Covid-19 trong 2 quý đầu năm 2020 (%) (Nguồn: Invest Vietnam, 2020) .....................5
Hình 2.3. Tiêu thụ sữa bình qn đầu ngƣời năm 2020 (lít/ngƣời/năm) ........................6
Hình 2.4. Dự báo tăng trƣởng sản lƣợng tiêu thụ các sản phẩm sữa giai đoạn 20202024 (Nguồn: Invest Vietnam, 2020)...............................................................................7
Hình 2.5. Một số sản phẩm sữa bột và sữa nƣớc khơng lactose trên thị trƣờng .............8

Hình 3.1. Biểu đồ đƣờng chuẩn oNP.............................................................................22
Hình 4.1. Hình ảnh khuẩn lạc Bacillus khi ni cấy trên 2 mơi trƣờng thạch ..............26
Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc Bacillus phân lập từ sữa mẹ và sữa b ..........................27
Hình 4.3. Màu của khuẩn lạc Bacillus khi thủy phân X-gal .........................................28
Hình 4.4. Hoạt độ enzyme β-galactosidase (U/l) của vi khuẩn Bacillus .......................30

vii


PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sữa và các chế phẩm từ sữa hiện là nguồn dinh dƣỡng thiết yếu trong chế độ ăn
hàng ngày của con ngƣời trên toàn thế giới. Không chỉ là thực phẩm cung cấp lƣợng
canxi, vitamin và nhiều khoáng chất quan trọng cho cơ thể ở mọi lứa tu i mà nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra các sản phẩm từ sữa c n có thể giúp ngăn ngừa bệnh loãng
xƣơng, giảm nguy cơ mắc ung thƣ, làm hạ huyết áp, chống nhiễm khuẩn... (Nguyễn Ý
Đức, 2018).
Tuy nhiên, trên thế giới có đến 68% dân số đang mắc chứng kém hấp thu
lactose (Storhaug & cs., 2017). Họ gặp phải các vấn đề nhƣ tiêu chảy, đau bụng, đầy
hơi... khi sử dụng sữa và các sản phẩm từ sữa do sự thiếu hụt enzyme phân giải lactose
trong cơ thể. Lactose là thành phần đƣờng có trong các sản phẩm từ sữa và enzyme
phân giải lactose là lactase (c n gọi là β-galactosidase). Lƣợng lactase trong cơ thể sẽ
giảm dần theo thời gian và tu i tác (Shinya, 2019). Vì thế khi sử dụng các thực phẩm
làm từ sữa thì đƣờng lactose sẽ khơng đƣợc chuyển hóa và hấp thu trong ruột non
mà đƣợc chuyển xuống ruột già. Tại đây các vi khuẩn sẽ phân hủy lactose thành chất
lỏng và khí khiến ngƣời bệnh xuất hiện các triệu chứng ở hệ tiêu hóa nhƣ trên (Nguyễn
Thị Lâm, 2021).
Để có thể sản xuất các sản phẩm sữa dành cho ngƣời kém hấp thu lactose thì
cần tìm một nguồn sinh vật có khả năng sinh β-galactosidase nhằm ứng dụng vào
trong q trình chế biến sữa. Nhờ đó, các sản phẩm sữa khơng chứa lactose có thể thu

hút lƣợng lớn ngƣời tiêu dùng không thể dung nạp lactose, đồng thời các nhà sản xuất
có thể mở rộng tồn bộ thị trƣờng tiêu thụ sữa.
Enzyme β-galactosidase có thể đƣợc tìm thấy trong nhiều loại thực vật, động
vật có vú, nấm men, vi khuẩn và nấm mốc. Enzyme nói chung đƣợc thu nhận từ nguồn
thực vật, động vật c n nhiều hạn chế do phải phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, hiệu
quả kinh tế không cao; hơn nữa đa số nguồn enzyme chƣa phải là mục đích ƣu tiên khi
ni trồng động thực vật nên việc thu nhận enzyme từ nguồn này đang đƣợc thay thế
dần bằng enzyme vi sinh vật (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Nguồn enzyme từ vi sinh
vật hiện chiếm 90% thị trƣờng enzyme. Một vài ƣu điểm điển hình của vi sinh vật nhƣ
có hệ thống trao đ i chất mạnh mẽ, linh hoạt và dễ dàng nhân lên ở cấp độ lớn, dễ
1


dàng thao tác cả về mặt môi trƣờng cũng nhƣ biến đ i di truyền, hơn nữa nhu cầu dinh
dƣỡng của chúng đơn giản và không phụ thuộc vào sự thay đ i thời tiết theo mùa nhƣ
thực vật và động vật (Nguyễn Thị Hiền & cs., 2012). Ngoài ra, một điểm đặc biệt ở vi
sinh vật là chúng có khả năng sinh enzyme nhờ những cơ chất cảm ứng tƣơng ứng
đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy, c n enzyme sản xuất từ động thực vật thì chỉ thu
nhận đƣợc ở những bộ phận tạo ra enzyme đó (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Những ƣu
điểm này rất thuận lợi cho q trình sản xuất enzyme nói chung và enzyme βgalactosidase nói riêng ở quy mơ cơng nghiệp.
Một số vi sinh vật đƣợc nghiên cứu sản xuất β-galactosidase quy mô lớn nhƣ
Aspergillus sp. và Khuyveromyces sp. (sản lƣợng đều nhỏ hơn 1 tấn/năm)... (Nguyễn
Đức Lƣợng, 2004). Hiện nay một số chủng Bacillus đạt đƣợc yêu cầu khắt khe về độ
an toàn, chịu đƣợc điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt và đƣợc FDA cấp chứng nhận an
toàn GRAS (Generally Recognized as Safe) nhƣ B. subtilis MB40 (FDA, 2020); B.
coagulans GBI-30,6086 (FDA, 2020); B. coagulans SNZ1069 (FDA, 2015)...Chính vì
vậy, với mong muốn tìm đƣợc nhiều nguồn sản sinh enzyme β-galactosidase chúng tôi
tiến hành nghiên cứu “Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme βgalactosidase phân giải lactose”.
1 2 Mục đích – Yêu cầu
1 2 1 Mục đích

Xác định đƣợc 1 – 2 chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme βgalactosidase hoạt tính cao nhằm phân giải lactose trong quá trình chế biến sữa ở nhiệt
độ thấp.
1 2 2 Yêu cầu
- Xác định mơi trƣờng ni cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus.
- Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase từ nguồn phân
lập và bộ sƣu tập có sẵn.
- Xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase.
- Tinh sạch sơ bộ chế phẩm enzyme β-galactosidase thô.
2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về s a tư i
2.1.1. Khái niệm
Theo Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-186:2017/BNNPTNT Sữa tƣơi nguyên
liệu là sữa nguyên chất dạng lỏng thu đƣợc từ b , trâu, dê, cừu, chƣa b sung hoặc
tách bớt bất cứ thành phần nào của sữa, chƣa xử lý qua bất kỳ phƣơng pháp nào, đƣợc
dùng làm nguyên liệu để chế biến . Hàm lƣợng các thành phần dinh dƣỡng chính có
trong sữa tƣơi đƣợc trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2 1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g s a bò tư i
Thành phần dinh dưỡng

Đ n vị tính

Hàm lượng tính trên 100g

Nƣớc

g


87.4

Năng lƣợng

kcal

74

Protein

g

3.9

Lipit

g

4.4

Lactose

g

5.26

Calci

mg


120

Cholesterol

mg

42
(Nguồn: Bộ Y tế, 2007)

Các sản phẩm chế biến từ sữa rất đa dạng, có thể chia thành 7 loại chính: Sữa
tƣơi, sữa đặc, sữa bột, sữa lên men, phô mai, kem tƣơi, kem. Do có sự khác nhau về
kết cấu, thành phần dinh dƣỡng, mục đích chế biến nên các sản phẩm sữa đáp ứng
đƣợc đa dạng nhu cầu của ngƣời sử dụng, thƣờng trở thành nguyên liệu ph biến trong
thực phẩm nhƣ dùng làm thức uống trực tiếp, làm bánh, pha chế, chế biến thức ăn...
3


Các sản phẩm sữa không lactose cũng là một sản phẩm thƣơng mại, trong sữa
không chứa thành phần lactose, đƣợc sản xuất bằng cách thêm enzyme lactase vào sữa
mới vắt nhằm phân giải lactose. Sữa khơng lactose dễ tiêu hóa hơn đối với nhóm
ngƣời khơng dung nạp lactose.
2.1.2. Tình hình phát triển ngành công nghiệp s a Việt Nam hiện nay
Ngành công nghiệp sản xuất, chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa của Việt
Nam hiện đang phát triển rất tích cực, nhiều sản phẩm đa dạng đƣợc cung cấp cho đủ
mọi lứa tu i, mọi nhu cầu của ngƣời sử dụng. Ngoài việc đáp ứng nhu cầu trong nƣớc,
các sản phẩm từ sữa của Việt Nam cũng dần thay thế các mặt hàng sữa nhập khẩu và
đang từng bƣớc xuất khẩu sữa tới các thị trƣờng quốc tế nhƣ Trung Đông, Đông Nam
Á, châu Âu, kể cả Mỹ và mới đây là Trung Quốc (Báo Chính phủ, 2019; Nhân dân,
2021).
Về cơ cấu sản phẩm, sữa nƣớc (47.6%) và sữa bột (29%) vẫn chiếm thị phần

chính trong cơ cấu doanh thu các sản phẩm sữa năm 2020 (Hình 2.1)

Hình 2 1 C cấu doanh thu thị trường s a Việt Nam
(Nguồn: Euromonitor, trích từ Vneconomy.vn)

4


Về phân vùng chế biến sữa, theo quy hoạch ngành sữa năm 2020, vùng Đông
Nam Bộ đƣợc quy hoạch t ng công suất các sản phẩm sữa năm 2025 là lớn nhất với
2624 triệu lít/năm, sau đó là Đồng bằng sơng Hồng với 1225 triệu lít/năm.
Năm 2020, kinh tế Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung chịu ảnh hƣởng
lớn của đại dịch Covid-19. Thói quen tiêu dùng của ngƣời dân Việt Nam cũng có sự
thay đ i ít nhiều. Hình 2.2 dƣới đây thể hiện ảnh hƣởng của Covid-19 tới thói quen
tiêu dùng các sản phẩm sữa của ngƣời Việt Nam.

Hình 2 2 Sự thay đổi thói quen tiêu dùng s a của người Việt Nam do tác
động của Covid-19 trong 2 quý đầu năm 2020 (%) (Nguồn: Invest Vietnam, 2020)
Có thể thấy chỉ trong 6 tháng đầu năm 2020 mặc dù Việt Nam phải chịu nhiều
ảnh hƣởng của đại dịch nhƣng riêng các sản phẩm sữa chua uống và sữa bột tại thành
thị và nông thôn đều có xu hƣớng tăng trƣởng khá cao. Đặc biệt sữa bột trẻ em tại
nông thôn tăng 65% lƣợng sản phẩm tiêu thụ so với năm 2019.
2.1.3. Tiềm năng phát triển ngành s a và các sản phẩm s a không lactose
Ngành sữa nói chung
Nhu cầu sử dụng sữa bình qn đầu ngƣời của Việt Nam hiện vẫn thấp, chỉ đạt
26-28 lít/ngƣời/năm, trong khi Thái Lan là 35 lít/ngƣời/năm, Singapore là 45
lít/ngƣời/năm và các nƣớc châu Âu từ 80 – 100 lít/ngƣời/năm (Hình 2.3). Đồng thời,
5



theo Quy hoạch ngành sữa (2010) của Bộ Công Thƣơng, mức tiêu thụ sữa bình quân
đầu ngƣời năm 2025 là 34 lít/ngƣời/năm. Do đó, ngành sữa trong nƣớc hiện có tiềm
năng rất lớn trong việc tăng năng suất, quy mô sản xuất nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu
dùng sữa và các chế phẩm từ sữa ở trong nƣớc.

Hình 2 3 Tiêu thụ s a bình quân đầu người năm 2020 (lít/người/năm)
Theo T ng cục Thống kê, GDP bình qn đầu ngƣời của Việt Nam đạt 3521
USD, GDP trong 6 tháng đầu năm 2021 tăng 5,64%, cao hơn tốc độ tăng 1,82% của 6
tháng đầu năm 2020. Thu nhập tăng kéo theo nhu cầu về các sản phẩm sữa của ngƣời
tiêu dùng cũng tăng theo. Bộ Công Thƣơng cũng nhận định xu hƣớng tiêu thụ của
ngành sữa ít bị tác động bởi Covid-19 do nhóm thu nhập trung bình và cao ít bị ảnh
hƣởng hơn nhóm thu nhập nhấp và họ có xu hƣớng sử dụng các sản phẩm cao cấp.
Điều này cho thấy ngành cơng nghiệp sữa Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung
đang dần n định và phát triển theo hƣớng tích cực.

6


Hình 2 4 Dự báo tăng trưởng sản lượng tiêu thụ các sản phẩm s a giai
đoạn 2020-2024 (Nguồn: Invest Vietnam, 2020)
Theo dự báo của Invest Vietnam, sữa uống và sữa chua dự kiến sẽ tăng trƣởng
với tốc độ cao, lần lƣợt là 10% và 11,9% trong giai đoạn 2020-2024 (Hình 2.4). Ƣớc
tính sữa nƣớc sẽ đạt mức tiêu thụ hơn 2 triệu tấn, sữa chua đạt 560 nghìn tấn vào năm
2024. Nguyên nhân chính là do ngƣời dân hiện đang chú trọng rất nhiều vào các sản
phẩm giúp tăng miễn dịch cho cơ thể, trong đó có sữa tƣơi và sữa chua. Riêng ngành
sữa bột, kỳ vọng tăng trƣởng chính đƣợc tập trung vào các sản phẩm cao cấp chất
lƣợng cao và tiện lợi đối với ngƣời tiêu dùng.
Các sản phẩm sữa khơng lactose nói riêng
Thị trƣờng sữa khơng chứa lactose là phân khúc phát triển nhanh nhất trong
ngành sữa. Sữa không chứa đƣờng lactose dự kiến sẽ đạt doanh thu 9 tỷ € vào năm

2022 và tiếp tục tăng trƣởng nhanh hơn ngành sữa nói chung (7,3% so với 2,3%). Sữa
uống là loại sữa không chứa lactose lớn nhất, chiếm 2/3 thị trƣờng và thúc đẩy sự tăng
trƣởng tuyệt đối của loại sữa này, loại thứ hai là sữa chua khơng chứa lactose (dữ liệu
trích từ phân tích của Euromonitor).
Sản phẩm sữa không lactose đƣợc Vinamilk ra mắt lần đầu tiên tại Việt Nam
vào năm 2013 (Vũ Văn Tiến, 2013). Đến nay, do ứng dụng nhiều phƣơng pháp xử lý
lactose trong sữa nên lƣợng sản phẩm loại này đang có chỗ đứng trên thị trƣờng. Hiện
sản phẩm này đã bắt đầu đƣợc sản xuất bởi các hãng sữa lớn nhƣ Abbott, Nutricare,
7


Vitadairy, A2… với đa dạng các loại sữa dành cho trẻ em, ngƣời lớn tu i, ngƣời mắc
các bệnh lý (Hình 2.5).

Hình 2 5 Một số sản phẩm s a bột và s a nước không lactose trên thị trường
Nhận thức và thu nhập ngày càng tăng nên ngƣời tiêu dùng ngày càng chú trọng
tới các sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao nhƣ sữa và các sản phẩm từ sữa, kể cả
nhóm sản phẩm sữa khơng lactose. Một khảo sát với những ngƣời bất dung nạp lactose
chỉ ra 82% ngƣời trong số họ chọn sữa chua không lactose, 73% chọn phô mai và kem
phô mai không lactose và 64% chọn bơ khơng lactose (Nguyen, 2014). Do đó, việc tập
trung sản xuất các chế phẩm enzyme b sung vào q trình chế biến các sản phẩm sữa
khơng chứa lactose nên đƣợc quan tâm nhiều hơn nữa.
2.2. Vi khuẩn Bacillus
2 2 1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus đƣợc phân bố rộng rãi trong tự nhiên và rất đa dạng, Khoảng
hơn 200 loài khác nhau đã đƣợc phát hiện và có thể tìm thấy vi khuẩn Bacillus ở rất
nhiều hệ sinh thái trong tự nhiên.
Đặc điểm hình thái: tế bào trực khuẩn hình que, kích thƣớc (0.5-2.5) x (1.2-10)
m. Các tế bào thƣờng xếp thành cặp hoặc chuỗi, đầu tr n hoặc hơi vng. Tế bào
Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiên mao.

Bacillus là vi khuẩn Gram dƣơng, hầu hết có catalase dƣơng tính, sống hiếu khí
hoặc kỵ khí tùy nghi.
8


Bacillus có khả năng hình thành bào tử, giúp chúng vƣợt qua những điều kiện bất
lợi của ngoại cảnh nhƣ cạn kiệt chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy, nhiệt độ,
pH khơng thích hợp, mơi trƣờng chứa nhiều chất bất lợi. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo một bào
tử. Khi điều kiện sống thuận lợi bào tử lại nẩy mầm để đƣa vi khuẩn trở lại sinh sản
(Priest & Grigorova, 1991).
Phần lớn chủng Bacillus là vi khuẩn ƣa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ƣu từ 3045 C, một số là vi khuẩn chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu lên đến 65 C, c n
lại là những vi khuẩn ƣa lạnh, có thể sinh trƣởng và tạo bào tử ở 0 C (Rosovitz & cs.,
1998).
Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus sinh trƣởng trong khoảng pH rộng từ 2-11.
Đa số Bacillus sinh trƣởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 nhƣ B.
alcaldophillus hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 nhƣ B. acidocaldrius (Nguyễn Thị
Trần Thụy, 2009).
Hình thái một số khuẩn lạc Bacillus đƣợc thể hiện trong hình 2.1.

Hình 2 1 Hình thái khuẩn lạc đ n của vi khuẩn Bacillus
Bacillus có thể đƣợc phân lập từ nhiều nguồn khác nhau: đất, tƣơng ớt, phân b ,
nƣớc thải, dạ cỏ b , phân ngƣời, sữa b , sữa mẹ, sữa chua, phô mai… thuận tiện cho
quá trình lấy mẫu và phân lập vi khuẩn. Nghiên cứu năm 2016 của nhóm tác giả
Nguyễn Thị Thanh Thủy & cs., khi phân lập vi khuẩn từ tƣơng ớt lên men không qua
xử lý nhiệt cho thấy lƣợng vi khuẩn Bacillus trong mẫu khá cao. Sau khi phân lập từ
34 mẫu tƣơng ớt lấy từ huyện Mƣờng Khƣơng vào mùa hè thu đƣợc 48 chủng Bacillus
9


sp. trong số 435 loại khuẩn lạc. Một nghiên cứu khác của tác giả Nguyễn Hoàng Anh

& Trần Thị Na, (2017) xác định đƣợc 94 chủng Bacillus sp. trong t ng số 221 khuẩn
lạc phân lập từ 3 mẫu dạ cỏ b , các chủng này đƣợc đem đi kiểm tra khả năng sinh
enzyme β-glucanase ngoại bào.
Đồng thời, môi trƣờng nuôi cấy đƣợc đánh giá là phù hợp với vi khuẩn có thành
phần dễ kiếm nhƣ mơi trƣờng NB (cao thịt, peptone, NaCl), NA (Nguyễn Hoàng Anh
& Trần Thị Na, 2017), môi trƣờng LB (cao nấm men, tryptone, NaCl) (Nguyễn Văn
Phúc & Phan Thị Phƣợng Trang, 2014)...Điều này giúp quá trình nghiên cứu trở nên
dễ dàng và nhanh chóng hơn.
Ngồi ra, do có khả năng sinh enzyme ngoại bào (enzyme h a tan vào dịch mơi
trƣờng và có thể thu đƣợc ngay sau khi ly tâm) nhƣ protease, amylase, lipase, βgalactosidase... tùy theo cơ chất cảm ứng nên Bacillus tạo khả năng thu nhận enzyme
một cách dễ dàng ở quy mô công nghiệp. Cụ thể, theo tác giả Võ Hồng Thi & cs.,
(2012), 10 chủng Bacillus đƣợc phân lập từ nƣớc thải giàu đạm đều có hoạt tính
protease ngoại bào đạt cực đại, dao động từ 1 đến 1.15 U/ml ở pH 7 và 50 C sau 72h
nuôi cấy. C n nghiên cứu của Nguyễn Văn Phúc & Phan Thị Phƣợng Trang (2014)
cho thấy đa số các chủng Bacillus khi ni cấy trên mơi trƣờng LB – agar có b sung
cơ chất thích hợp đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào. Bán kính các v ng phân
giải tinh bột, cellulose, gelatin, casein đạt 6 – 8 mm.
2 2 2 Ứng dụng của Bacillus trong thực phẩm
Nhiều loài Bacillus đƣợc đánh giá là an toàn và đƣợc ứng dụng nhiều trong
thực phẩm, điển hình là B. subtilis, B. clausii, B. coagulans và B. licheniformis đƣợc
coi nhƣ lợi khuẩn probiotic. Chúng thƣờng đƣợc b sung vào các sản phẩm nhƣ sữa
chua, thực phẩm chức năng… nhằm cải thiện cân bằng vi khuẩn đƣờng ruột, giảm các
bệnh viêm đƣờng ruột nặng…Chủng B.subtilis đƣợc dùng để sản xuất kháng sinh và
enzyme quan trọng trong cả khoa học y tế và công nghiệp (Anabio, 2018).
Tác giả Vũ Thanh Thảo & cs., (2014) đã nhận thấy chủng B. subtilis BS02 có
tiềm năng ứng dụng làm probiotic sau khi tiến hành các thử nghiệm về đặc tính của
10


chủng làm probiotic nhƣ khả năng kháng khuẩn, chịu acid dạ dày, muối mật và thử

nghiệm khả năng nhạy kháng kháng sinh, độc tính cấp và khả năng điều trị tiêu chảy
trên mơ hình chuột.
Nhiều nhà khoa học hiện nay cũng bắt đầu nghiên cứu về khả năng sinh enzyme
β-galactosidase của Bacillus sp. nhằm ứng dụng trong thực phẩm. Gần đây nhất là
nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Hồng Anh & Trần Thị Na (2017) nhằm tuyển
chọn Bacillus sinh enzyme lactase có khả năng chịu nhiệt. 24 chủng vi khuẩn Bacillus
phân lập từ dạ cỏ b , tƣơng ớt, thịt lên men, nƣớc thải, sữa chua lên men, l ng non lợn
có khả năng sinh enzyme lactase; trong đó có một chủng bền nhiệt ở 60 C.
2.3. Enzyme β-galactosidase
2.3.1. Đặc điểm chung của enzyme β-galactosidase
β-galactosidase (c n gọi là lactase) là một loại enzyme giúp phân giải lactose
(thành phần chính của đƣờng sữa). Nhiệt độ hoạt động của enzyme thƣờng tƣơng ứng
với nhiệt độ tối ƣu của vi sinh vật sinh ra nó. Phần lớn lactase hoạt động trong khoảng
nhiệt độ từ 35-45 C đƣợc sinh ra từ cá chủng nhƣ K. fragilus, K. lactic, E. coli với
nhiệt độ tối ƣu lần lƣợt là 37 C, 35 C, 40 C; một số khác từ 45-65 C (Bacillus sp., A.
niger, A. oryzae…) và chỉ một số enzyme có thể hoạt động xúc tác ở 4 C.
β-galactosidase trong tự nhiên có thể tìm thấy ở các lồi thực vật, động vật và vi
sinh vật. Tuy nhiên, tính chất của enzyme đƣợc thu nhận từ các nguồn khác nhau có sự
khác nhau rõ rệt. Enzyme đƣợc sản xuất từ vi sinh vật ngày càng nhiều, là nguồn duy
nhất đƣợc sử dụng nhƣ nguồn sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp. Nguồn
enzyme từ động vật và thực vật rất khó triển khai theo quy mơ cơng nghiệp vì những
hạn chế sinh lý và hạn chế kỹ thuật. So với động vật và thực vật, vi sinh vật có rất
nhiều ƣu điểm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Enzyme lactase thƣờng đƣợc thu hoạch từ các vi sinh vật nhƣ vi khuẩn
Lactobacillus fermentum FV4 (460U/l) (Nguyễn Hoàng Anh & cs., 2021),
Trichoderma crissum (Akinola & cs., 2012) (hoạt độ 347,6-2236,9 U/l)... Các enzyme
có nguồn gốc từ nấm men hoặc vi khuẩn rất thích hợp cho q trình thủy phân lactose
11



trong sữa, thƣờng hiển thị hoạt động tối ƣu ở gần pH của sữa (pH 6.5 đến 7.0) (Chen
& cs., 2009)…
2.3.2 Vai trò của β-galactosidase
- Loại bỏ lactose trong sữa ở nhiệt độ thấp để sản xuất sữa cho ngƣời mắc chứng
không dung nạp lactose.
- Thủy phân lactose trong sữa thành glucose và galactose nhằm tăng độ ngọt và
giảm độ hút ẩm của nó.
- Ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi bảo quản sữa ở nhiệt độ thấp và ở sản phẩm sữa
cô đặc.
- Hơn nữa việc sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm
tăng q trình acid hóa, bởi vì thủy phân lactose thƣờng làm giảm thời gian đông đặc
của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và hƣơng vị cho phomat (Parmjit & cs.,
2010).
- Sử dụng làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa cho những ngƣời thiếu khả năng hấp thụ lactose
hoặc b sung cho những ngƣời bị bệnh GM1- gangliosidosis và bệnh Morquio type B do
suy giảm hoạt độ của của β- galactosidase trong tế bào (Trƣơng Nam Hải, 2004).
2 3 3 Tình hình nghiên cứu β-galactosidase có liên quan đề tài
Một số nghiên cứu về β-galactosidase đƣợc phân lập từ các vi sinh vật khác
nhau có liên quan đến đề tài, điển hình là:
Nhóm tác giả Nguyễn Hoàng Anh & Trần Thị Na (2017) tuyển chọn đƣợc
chủng B. flexus NT2.8 sinh enzyme lactase có khả năng chịu nhiệt. Chủng này đƣợc
phân lập từ nƣớc thải nhà máy sữa, hoạt tính enzyme đạt cao nhất 42,4 U/l, bền ở 60 C
sau 50 giờ.
Nguyễn Thị Huyên (2018) đã tuyển chọn đƣợc vi khuẩn Streptococcus
thermophilus SC3 sinh enzyme nội bào hoạt độ cao (389U/l). Enzyme từ chủng này có
khả năng thủy phân 59,33% lactose sau 27h ở 4 C với lƣợng enzyme sử dụng là 2,11
U/1g lactose.
12



Tuy nhiên, các nghiên cứu về enzyme lactase từ vi khuẩn đã đƣợc cơng bố đều
chƣa có nhiều thơng tin về tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme chịu
lạnh. Do đó, đề tài tập trung tuyển chọn những chủng vi khuẩn Bacillus an tồn trong
thực phẩm có khả năng sinh β-galactosidase ngoại bào với hoạt độ cao có khả năng
phân giải lactose trong sữa tƣơi ở nhiệt độ thấp nhằm ứng dụng vào quá trình sản xuất
sữa không lactose là hƣớng đi mới của đề tài so với các nghiên cứu trên.

13


PHẦN 3. ĐỐI T ỢNG, NỘI DUNG VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN CỨU

3 1 Đối tượng nghiên cứu
V t i u nghiên c u ao gồm:
-Mẫu sữa dùng để phân lập vi khuẩn Bacillus gồm mẫu sữa b tƣơi (lấy từ hộ chăn
ni b sữa tại huyện Ba Vì, Hà Nội ngày 04/07/2021) và mẫu sữa mẹ (lấy ngày
04/07/2021). Hai mẫu sữa đƣợc bảo quản trong túi tiệt trùng ở 4oC.
-79 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ tƣơng ớt đã đƣợc định danh sơ bộ bằng hình
thái và phƣơng pháp hóa sinh, lƣu giữ tại ngân hàng giống của ph ng Thí nghiệm Trung
tâm, khoa Cơng nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (bảng 3.1) đƣợc sử
dụng để sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ƣa lạnh.
Môi trường sử dụng trong nghiên c u:
-Môi trƣờng LB: tryptone (10g/l), NaCl (5g/l), cao nấm men (5g/l). Tiệt trùng
121C/21 phút, pH 7.
-Môi trƣờng LB – agar: tryptone (10g/l), NaCl (5g/l), cao nấm men (5g/l), agar
(20g/l). Tiệt trùng 121C/21 phút, pH 7.
-Môi trƣờng NB: peptone (10g/l), NaCl (5g/l), cao thịt (5g/l). Tiệt trùng 121C/21
phút, pH 7.

-Môi trƣờng NA: peptone (10g/l), NaCl (5g/l), cao thịt (5g/l), agar (20g/l). Tiệt
trùng 121C/21 phút, pH 7.

14


Bảng 3 1 Các chủng vi khuẩn được chọn để nghiên cứu
Nguồn
phân lập

Tên kí hiệu các chủng

Số chủng

TO40.1.22, TO35.5, TO40.20, TO57.7, TO35.7, TO40.21,
TO40.9, TO33.17, TO37.7, TO36.18.1, TO427.11, TO33.19,
TO43.5.1, TO40.1.2.2, TO40.19, TO43.5, TO36.5,
TO42.7.1.1, TO40.16.1, TO35.15.2
40
TO23, TO32.9, TO483.2, TO36.13.2, TO32.3.1.1, TO47.51,
TO35.4, TO40.6, 008, TO43.1, TO40.16.1, TO22, TO47.5,
Tƣơng ớt

TO33.5, TO3.29, TO33.1.1, TO48.3.2, TO36.1.2, TO36.16,
TO33.16
39.5, 36.5, 35.12, 46.6, 60.1, 47.3, 46.5, 36.35, 59.2, 60.4,
41.14, 41.5, 52.5, 54.4, 59.5, 39.6, 59.3, 51.2, 61.1
39
40.38, 53.2, 31.11, 41.11, 32.4, 48.4, 53.4, 43.10, 35.18, 51.5,
47.6, 31, 32.12, 49.5, 64.6, 41.15, 54.3, 61.11, 32.13


3.2. Phạm vi nghiên cứu
Thiết bị dùng trong nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.

15


Bảng 3 2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu
STT

Tên thiết bị

1

Tủ lạnh

7

Nồi hấp tiệt trùng

2

Máy Vortex

8

Máy đo pH để bàn

3


Máy ly tâm lạnh Rotor 24 chỗ

9

Buồng cấy vô trùng

4

Cân kỹ thuật điện tử

10

Bể siêu âm

5

Cân phân tích điện tử

11

Máy lắc n nhiệt

6

Tủ sấy

12

Tủ nuôi


STT

Tên thiết bị

Dụng cụ: cốc đong, pipet thủy tinh, bình đựng, que cấy, que trang, ống nghiệm,
ống fancol (15 ml, 50 ml), đĩa peptri, bình tam giác, bình định mức, ống đong, cốc thủy
tinh, đũa thủy tinh, đèn cồn, màng bọc, micropipet, ống eppendorf…

16