HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
------------------------------------

NGUYỄN VĂN TÚ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TỐC ĐỘ KHUẤY,
NỒNG ĐỘ MUỐI ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH VÀ
KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE CỦA
CHỦNG Exiguobacterium profundum CH2.1

Hà Nội – Tháng 09/2021


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
------------------------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TỐC ĐỘ KHUẤY,
NỒNG ĐỘ MUỐI ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH VÀ
KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE CỦA
CHỦNG Exiguobacterium profundum CH2.1
Người thực hiện

: Nguyễn Văn Tú

Mã sinh viên

: 6207176

Khố

: 62

Ngành

: Cơng nghệ thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS. Nguyễn Hồng Anh
Bộ mơn

: Hóa sinh - Công nghệ sinh học thực phẩm

Hà Nội – Tháng 09/2021


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
trung thực và chưa hề được sử dụng; mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận
này đã được cảm ơn và các thơng tin được trích dẫn trong chun đề này đã được
ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 05 tháng 09 năm 2021
Sinh viên thực hiện

NGUYỄN VĂN TÚ


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân, tôi đã

nhận được sự quan tâm và giúp đỡ rất nhiều từ các cá nhân và tập thể.
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô và các cán bộ của Học viện
Nông nghiệp Việt Nam đã luôn chỉ bảo tận tình và ln tạo điều kiện thuận lợi để tôi
được học tập trong suốt những năm học vừa qua.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh,
ThS. Phạm Thị Dịu, ThS. Nguyễn Thị Hồng và cử nhân Nguyễn Thị Phương Anh tại
phịng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Cơng nghệ thực phẩm - những người đã nhiệt
tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập cũng như nghiên cứu.
Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân, bạn bè của tôi
đã động viên và tạo động lực cho tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 05 tháng 09 năm 2021
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Tú


MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu .................................................................................................2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu ..................................................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................3
2.1. Tổng quan về nước mắm ..........................................................................................3
2.1.1. Giới thiệu chung về nước mắm .............................................................................3
2.1.2. Nguyên liệu chính sản xuất nước mắm .................................................................4
2.1.3 . Quy trình sản xuất nước mắm ..............................................................................5
2.2. Giới thiệu về histamine.............................................................................................6
2.2.1. Giới thiệu chung ....................................................................................................6

2.2.2. Sự hình thành histamine trong thực phẩm .............................................................6
2.2.3. Histamine trong nước mắm ...................................................................................7
2.2.4. Tác hại của histamine ............................................................................................7
2.3. Phương pháp làm giảm histamine trong nước mắm.................................................7
2.3.1. Kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào ............................................................7
2.3.2. Tác động cơng nghệ để ngăn ngừa sự hình thành, tích tụ histamine ....................8
2.4. Tổng quan về phương pháp cố định .........................................................................9
2.4.1. Phương pháp hấp phụ (Adrorption).......................................................................9
2.4.2. Phương pháp liên kết chéo (Cross-linking) .........................................................10
2.5. Tổng quan về chất mang.........................................................................................10
2.5.1. Khái niệm về chất mang vi sinh vật ....................................................................10
2.5.2. Đặc điểm của chất mang vi sinh vật ....................................................................10
2.6. Giới thiệu chung về chủng Exiguobacterium profundum ......................................13
2.6.1. Giới thiệu về chi vi khuẩn Exiguobacterium .......................................................13
2.6.2. Giới thiệu về chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum ...............................13
2.6.3. Cơ chế phân giải histamine của chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum 14
2.7. Ảnh hưởng của hai yếu tố tốc độ khuấy và nồng độ muối trong quá trình cố định
tế bào..............................................................................................................................14
2.7.1. Nồng độ muối trong Tris HCl 50mM; pH 7,0 .....................................................14


2.7.2. Tốc độ khuấy .......................................................................................................14
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............15
3.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................15
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................15
3.1.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ..........................................................................15
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất...............................................................................15
3.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................16
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................17
3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................................17

3.3.2. Phương pháp phân tích .......................................................................................17
3.3.3. Phương pháp xử lí số liệu ....................................................................................22
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................23
4.1. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 ...........................................23
4.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 ...........................................26
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................29
5.1. Kết luận...................................................................................................................29
5.2. Kiến nghị ................................................................................................................29
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................30
PHỤ LỤC ......................................................................................................................34


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ cơng nghệ sản suất nước mắm ..............................................................5
Hình 2.2. Cơng thức cấu tạo và cấu trúc khơng gian của histamine ...............................6
Hình 2.3. Sự hình thành histamine từ histidine ...............................................................6
Hình 2.4. Phương pháp hấp phụ tế bào .........................................................................10
Hình 2.5. Phương pháp liên kết chéo ............................................................................10
Hình 2.6. Cấu tạo chất mang celite được chụp qua kính hiển vi ...................................11
Hình 2.7. Chất mang chitosan được chụp qua kính hiển vi ..........................................12
Hình 2.8. Chất mang pigbone được chụp qua kính hiển vi ...........................................12
Hình 2.9. Chất mang eggshell được chụp qua kính hiển vi ..........................................13
Hình 4.1. Đồ thị ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất cố định và khả năng phân
giải histamine trên chất mang celite sau 2h phản ứng ...................................................23
Hình 4.2. Đồ thị ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất cố định và khả năng phân
giải histamine trên chất mang pigbone sau 2h phản ứng ..............................................24
Hình 4.3. Đồ thị ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất cố định và khả năng phân
giải histamine trên chất mang chitosan sau 2h phản ứng ..............................................24

Hình 4.4. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine trên chất mang eggshell sau 2h phản ứng .....................................................25
Hình 4.5. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất cố định và khả năng phân
giải histamine trên chất mang celite sau 2h phản ứng ...................................................26
Hình 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine trên chất mang pigbone sau 2h phản ứng......................................................27
Hình 4.7. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất cố định và khả năng phân
giải histamine trên chất mang chitosan sau 2h phản ứng ..............................................27
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine trên chất mang eggshell sau 2h phản ứng .....................................................28


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của nước mắm ................................................................4
Bảng 3.1 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .................................................................15
Bảng 3.2. Danh sách hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .............................................16
Bảng 3.4. Chương trình dẫn xuất hóa tự động trên hệ thống HPLC .............................20


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
Chữ viết tắt
HPLC

Tên đầy đủ
High-performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam


HA

Halophilic

OPA

O-Phthalaldehyde

BME

β-mercaptoethanol

EDTA

Ethylene Diamine Tetracetic Acid

FAO

Food and Agricuture Organization of the United Nation

1-methoxy PMS

1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulphate

cs

Cộng sự

STT


Số thứ tự

v/p

Vòng/phút

HSCĐ

Hiệu suất cố định

KNPG

Khả năng phân giải


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nước mắm là một gia vị truyền thống có giá trị dinh dưỡng cao của Việt Nam.
Trong nước mắm chứa nhiều chất dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể, nhưng lại chứa
hàm lượng histamine cao đây là một amin sinh học mà nếu tồn tại trong cơ thể với
nồng độ cao sẽ gây nguy hại cho sức khỏe. Khi sử dụng những sản phẩm chứa hàm
lượng histamine cao thường gây ra các triệu chứng bất như co thắt phế quản, nổi mề
đay, phát ban, tiêu chảy và nghiêm trọng hơn như gây giãn mạch, co thắt tim,…(Vũ
Văn Đính, 2007). Hàm lượng histamine có trong nước mắm truyền thống của nước ta
cao vượt ngưỡng cho phép, dao động từ 1000-3000mg/l (Báo cáo của Hiệp hội nước
mắm Phan Thiết, 2013), theo Tiêu chuẩn Codex 302 năm 2011 hàm lượng histamine
trong nước mắm được quy định không vượt quá 400mg/l. Để đáp ứng các tiêu chuẩn
trong khu vực và quốc tế về tính an tồn cho người tiêu dùng cần tìm ra phương pháp
làm giảm hàm lượng histamine là vô cùng cần thiết.

Thực tế hiện nay đã có nhiều cơng trình nghiên cứu có sử dụng nhiều
phương pháp khác nhau như vật lí, hóa học, vi sinh vật để làm giảm hàm lượng
histamine trong nước mắm. Trong đó phương pháp vi sinh vật, đặc biệt là ứng dụng
các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine đang được hướng đến là
phương pháp có hiệu quả cao nhất, khắc phục được những hạn chế của phương
pháp vật lí và hóa học như tốn kém chi phí đặc biệt là ảnh hưởng tới sức khỏe của
con người. Phần lớn các nghiên cứu đang sử dụng phương pháp bổ sung vi sinh vật
tự do trực tiếp vào quá trình sản xuất chượp mắm, nhược điểm của phương pháp
này là tốn thời gian, chi phí, khó kiểm sốt được quy trình cơng nghệ, màu sắc, độ lên
men... (Robertson, 2005). Đồng thời nếu nuôi vi khuẩn ở dạng tự do vào trong nước
mắm thành phẩm thì rất khó để vi khuẩn có thể phân giải histamine một cách hiệu quả,
nên chúng tôi hướng đến phương pháp cố định tế bào vi khuẩn. Tế bào cố định có
nhiều ưu điểm so với việc sử dụng tế bào tự do như: tế bào sau khi được cố định có thể
sử dụng được nhiều lần, khơng lẫn vào sản phẩm và an tồn cho sức khỏe.

1


Kế thừa kết quả nghiên cứu của TS. Trần Thị Thu Hằng và cs., năm 2019 về
tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân giải histamine từ chượp mắm, đã tuyển chọn
được chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 có khả năng chịu mặn tốt và khả năng
phân giải histamine cao. Với mục đích nâng cao hiệu suất cố định và khả năng phân
giải histamine trong nước mắm thành phẩm các chất mang được lựa chọn để cố định vi
khuẩn vào cũng vô cùng quan trọng. Vì vậy từ kết quả của nhóm nghiên cứu trước 4
chất mang: celite, pigbone, chitosan flakes và eggshell có hiệu suất cố định cao, phổ
biến, dễ tìm, dễ ứng dụng được chọn để cố định và kết hợp nghiên cứu hai yếu tố ảnh
hưởng là tốc độ khuấy, nồng độ muối đến khả năng cố định và phân giải histamine của
chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 trong quá trình cố định .
Từ những lý do trên đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy, nồng
độ muối đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của chủng

Exiguobacterium profundum CH2.1” được thực hiện.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định ảnh hưởng của tốc độ khuấy, nồng độ muối đến hiệu suất cố định và
khả năng phân giải histamine của chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 góp phần
hồn thiện q trình cố định tế bào và nâng cao hiệu suất phân giải histamine.
1.2.2. Yêu cầu
+ Xác định ảnh hưởng của tốc độ khuấy trong quá trình cố định đến hiệu suất cố
định tế bào và khả năng phân giải histamine của tế bào cố định - chủng vi khuẩn
Exiguobacterium profundum CH2.1 trên 4 chất mang: celite, pigbone, chitosan flakes,
eggshell;
+ Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối dung dịch Tris-HCl trong quá trình cố
định đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của tế bào cố định - chủng
vi khuẩn Exiguobacterium profundum CH2.1 trên 4 chất mang: celite, pigbone,
chitosan flakes, eggshell.

2


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nước mắm
2.1.1. Giới thiệu chung về nước mắm
Nước mắm là một gia vị truyền thống lâu đời của người dân Việt Nam ta, được
sản xuất từ quá trình lên men các loại cá. Nước mắm mang lại cho món ăn hương vị
đậm đà, thơm ngon; hơn nữa trong nước mắm có những chứa các acid amin không thể
tự tổng hợp, omega 3 và một số vitamin khác. Về mặt khoa học nước mắm là dung
dịch đạm mà chủ yếu là các acid amin, được tạo thành do quá trình thủy phân protein
cá nhờ hệ enzyme protease có trong cá (Phan Thị Thanh Quế, 2005). Nước mắm có
nhiều tên gọi khác nhau phụ thuộc vào từng quốc gia sản xuất. Mỗi quốc gia lại có
điều kiện sản xuất và phương pháp sản xuất khác nhau tạo ra sản phẩm có giá trị dinh

dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau, mang hương vị riêng đặc trưng cho từng quốc
gia, dân tộc. Theo phương pháp lên men truyền thống, nước mắm được sản xuất từ hỗn
hợp cá với muối theo tỷ lệ 1 phần muối với 2 - 3 phần cá và được lên men ở khoảng
nhiệt độ 30 - 40oC trong thời gian 6 đến 12 tháng hoặc lâu hơn để quá trình thủy phân
xảy ra hồn tồn và tạo nên hương vị đặc trưng thơm ngon cho sản phẩm (Lopetcharat
và cs, 2001).
Nước mắm là sản phẩm quan trọng bậc nhất của ngành đánh bắt thủy hải sản ở
nước ta, tiêu thụ 40-60% tổng số cá đánh bắt được, và được sản xuất trên cả nước.
Hiện nay nước ta có khoảng 600 nhà máy chế biến nước mắm phân bố trong cả nước,
với nhiều thương hiệu nổi tiếng như nước mắm Phú Quốc, Phan Thiết, Khánh Hòa,
Cát Hải, Ninh Cơ,… (Lương Đức Phẩm, 2010).
Tại Việt Nam, các vùng miền duyên hải đều làm nước mắm. Nước mắm thường
chủ yếu làm từ các loại cá biển nhỏ, có giá trị kinh tế thấp (cá cơm, cá thu, cá nục...)
ướp với muối sau một thời gian dài sẽ chiết rút, phơi nắng, phối trộn để tạo ra nước
mắm. Tùy theo độ đạm trong nước mắm mà người ta phân cấp độ (loại đặc biệt, loại
thượng hạng, nước mắm loại 1, nước mắm loại 2). Thành phần hóa học của các loại
nước mắm theo TCVN 5107:2013 được thể hiện trong bảng 2.1:

3


Tên chỉ tiêu

Đặc biệt

Mức chất lượng
Thượng
Loại 1
hạng


Loại 2

Hàm lượng nitơ tồn phần, tính
bằng g/l, khơng nhỏ hơn

30

25

15

10

Hàm lượng nitơ amino acid, tính
bằng % so với nitơ tồn phần,
khơng nhỏ hơn

55

50

40

35

Hàm lượng nitơ amoniac, tính
bằng % so với nitơ tồn phần,
khơng lớn hơn

20


25

30

35

Hàm lượng acid, tính bằng g/l
theo acid axetic, khơng nhỏ hơn

8,0

6,5

4,0

3,0

Hàm lượng muối, tính bằng g/l,
trong khoảng

245 - 280

260 - 295

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của nước mắm
Theo cấp độ được phân từ loại đặc biệt tới loại 2 thấy rõ sự giảm xuống của giá
trị dinh dưỡng trong nước mắm.
2.1.2. Nguyên liệu chính sản xuất nước mắm
2.1.2.1. Cá

Nguyên liệu chính dùng để sản xuất nước mắm là các loại cá. Muốn có thành
phẩm nước mắm đạt đủ điều kiện thì loại cá được chọn cũng phải có đủ các tiêu chí
phù hợp. Nguyên liệu dùng để sản xuất nước mắm là những loại cá giàu protein và ít
mỡ. Mỗi loại cá dùng để làm nước mắm sẽ cho ra các loại nước mắm có độ đạm khác
nhau. Một số loại cá nguyên liệu phổ biến dùng để sản xuất nước mắm là cá cơm, cá
nhâm, cá nục,... (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990).
2.1.2.2 Muối
Sau cá, muối là nguyên liệu quan trọng thứ hai để sản xuất nước mắm. Thành
phần của muối chủ yếu là NaCl, và ít nhiều tạp chất. Muối được sử dụng trong sản
xuất nước mắm là muối loại 2. Thành phần của muối loại 2 bao gồm: không dưới 97%
NaCl và lớn hơn 0,85% chất không tan (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990).

4


2.1.3 . Quy trình sản xuất nước mắm
Muối

Cá

Trộn
Lên men
Chiết rút lần 1
Nước mắm
nguyên chất

Bã chượp chín

Nước mắm chiết
rút lần 2


Chiết rút lần 2

Bã

Pha đấu

Nước mắm
thành phẩm

Làm phân bón hoặc
thức ăn gia súc

Hình 2.1. Sơ đồ cơng nghệ sản suất nước mắm
Thuyết minh quy trình: Bản chất của quá trình sản xuất nước mắm là là quá
trình thủy phân protein trong cá nhờ muối (Phan Thị Thanh Quế, 2005). Nguyên liệu:
cá sau khi được xử lí làm sạch được ướp và trộn với muối. Lượng muối phụ thuộc vào
khối lượng và độ tươi của cá. Lên men khô: sau khi trộn muối hỗn hợp được ủ
trong thùng lên men từ 1 đến 2 ngày. Lên men (ướt chượm chín): có ba phương
pháp chế biến chượp cổ truyền. Phương pháp đánh khấy được thực hiện bằng cách cho
muối nhiều lần, cho nước lã, đánh khấy liên tục. Phương pháp gài nén được thực hiện
bằng cách cho muối một lần hoặc nhiều lần, không cho nước lã, gài nén. Phương pháp
hỗn hợp, lúc đầu thực hiện gài nén sau đó thực hiện đánh khuấy. Chiết rút: trước khi
tiến hành kéo rút để lấy sản phẩm cần phải tiến hành chính xác độ chín của chượp. Độ
5


chín của chượp được đánh giá theo TCVN 8336:2010. Pha đấu (phối trộn): để đảm bảo
độ đạm đủ yêu cầu (14 - 18g N/l) hoặc phù hợp với nhu cầu của người tiêu dùng người
ta pha đấu nước mắm nguyên chất và nước mắm chiết rút lần 2. Nước mắm thành

phẩm: sản phẩm được bao gói và ghi nhãn phù hợp với tiêu chuẩn hiện hành.
2.2. Giới thiệu về histamine
2.2.1. Giới thiệu chung
Histamine là một amine sinh học có cơng thức hóa học là C5H9N3, danh pháp
hóa học là 2-(3H-imidazol-4-yl) ethanamine. Nó có một hợp chất dị vịng, có 2 nhóm
amine (diamines), dạng tinh thể, nhiệt độ nóng chảy 83.5°C (182°F), nhiệt độ sơi
209.5°C (409°F). Histamine có tính hút nước, chịu được nhiệt cao mà không bị phá
hủy, dễ tan trong nước và ethanol, tan ít trong diethy ether. Histamine có đặc tính chịu
nhiệt, thậm chí khi được nấu chín histamine vẫn khơng bị phá hủy (Luten và cs, 1992).

Hình 2.2. Công thức cấu tạo và cấu trúc không gian của histamine
Trong cơ thể người, histamine là một chất nội sinh được tạo ra một cách tự
nhiên qua quá trình decarboxyl hóa amino acid histidine với sự xúc tác của histidine
decarboxylase. Enzyme này chỉ được tổng hợp khi cần thiết và bị phân hủy ngay khi
lượng histamine nội sinh được sinh tổng hợp đủ (FAO, 2013).
2.2.2. Sự hình thành histamine trong thực phẩm

Hình 2.3. Sự hình thành histamine từ histidine
Histamine được hình thành bởi sự tách nhóm α-carboxyl ra khỏi amino acid
histidine bởi enzyme histidin decarboxylase (Hình 2.3). Histidine là một trong các
amino acid không thay thế mà cơ thể người tự tổng hợp, được cung cấp từ thức ăn.
6


Histidine thường được tìm thấy trong thực phẩm như cá, thịt, trứng và các sản phẩm từ
sữa.
Trong các sản phẩm cá sống có các amine sinh học phổ biến khác như
histamine, putrescine, cadaverine và tyramine… và trong các sản phẩm lên men như
nước mắm, phomat, rượu, bia và dưa bắp cải, thịt lợn lên men (Tôn Nữ Minh Nguyệt,
2014).

2.2.3. Histamine trong nước mắm
Histamine được hình thành do vi sinh vật phát triển, sản sinh ra enzyme và tác
động chuyển hóa acid amin histidine thành histamine chứa trong thịt cá như vi khuẩn
Morganella moganii. Như vậy khi làm nước mắm sử dụng các loại cá nói trên trong
điều kiện đã bị phân hủy sẽ phát sinh chứ không phải do nhiễm histamine vì đã hội đủ
hai điều kiện: histidine tự do và nguồn enzyme chuyển hóa (do nhiễm khuẩn) (Phan
Thị Thanh Hiền, 2011).
2.2.4. Tác hại của histamine
Histamine luôn tồn tại trong cơ thể với một nồng độ nhất định, cần thiết cho
một số hoạt động sinh lí nhưng nếu tồn tại trong cơ thể với một lượng lớn sẽ gây độc
cho cơ thể.
Theo Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, 2007 nếu trong cơ thể người tồn tại một
lượng lớn histamine sẽ gây ra tác động xấu cho cơ thể như: đối với hệ hô hấp gây sổ
mũi, hen suyễn và co thắt khí quản; đối với hệ tiêu hóa gây tiết q độ HCl và pepsin dẫn
tới tiêu chảy do co thắt ruột, tăng tiết acid dịch vị do đó có thể gây viêm loét dạ dày - tá
tràng; đối với hệ bài tiết: histamine góp phần làm tăng bài tiết nước mắt, nước mũi, nước
bọt, dịch tụy làm viêm và sưng đỏ kết mạc mắt; phản ứng trên da nổi phát ban, mề đay.
Đối với hệ tim mạch: hạ huyết áp, gây co thắt tim, giãn mạch. Ngồi ra histamine cịn có
tác dụng trực tiếp đối với cơ tim và thần kinh nội tại làm tăng co bóp cả tâm nhĩ, tâm thất,
chậm dẫn truyền nhĩ thất và chậm khử cực nút xoang; histamine kích thích đầu sợi thần
kinh ngoại vi gây cảm giác ngứa và đau. Trên thần kinh trung ương histamine cịn tác
động gây ra tình trạng giảm thân nhiệt, gây mất ngủ, có thể chán ăn, tăng tiết ADH.
2.3. Phương pháp làm giảm histamine trong nước mắm
2.3.1. Kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào

7


Các phương án kiểm soát hiện đang được sử dụng để giảm thiểu sự hình thành
histamine cũng như các amine sinh học khác trong thực phẩm chủ yếu tập trung vào

việc xử lý và bảo quản nguyên liệu để đảm bảo tính an tồn, vệ sinh cho ngun liệu
trước q trình sản xuất nước mắm (Renes và cs., 2014).
2.3.2. Tác động cơng nghệ để ngăn ngừa sự hình thành, tích tụ histamine
Histamine là 1 hợp chất rất bền nhiệt, rất khó để loại bỏ amine khỏi các sản
phẩm thực phẩm ngay khi chúng được hình thành, thậm chí với việc xử lý nhiệt như
hấp tiệt trùng (Luten và cs., 1992). Ngồi ra, khơng thể phát hiện histamine bằng
phương pháp cảm quan, kể cả thành viên đánh giá đã qua huấn luyện (Zaman và cs.,
2010; Naila và cs., 2010). Có rất nhiều hướng nghiên cứu nhằm giảm lượng histamine
trong thực phẩm. Các phương pháp chủ yếu được sủ dụng: vật lí, hóa học, vi sinh vật.
Phương pháp vật lý: chiếu xạ, áp suất thủy tĩnh cao, thay đổi thành phần khi bao
gói sản phẩm. Các phương pháp vật lý này sẽ ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi
khuẩn sinh amine và ức chế hoạt tính của enzyme decarboxylase tuy nhiên phương
pháp này có thể tạo ra các hợp chất mang gốc tự do có hại (Naila và cs., 2010). Sử dụng
phương pháp vật lý có hiệu quả cao nhưng chi phí cho phương pháp này lớn và khơng
an tồn.
Phương pháp hóa học: Sử dụng hóa chất có tính kháng khuẩn để tác động vào
sự cân bằng của hệ vi khuẩn trong thực phẩm làm thay đổi đổi thành phần và hàm
lượng các amine trong thực phẩm (Gardini và cs., 2016). Hiện nay sử dụng các chất
bảo quản có nguồn gốc tự nhiên đang là xu thế. Tuy nhiên giá thành của các sản phẩm
này cao hơn rất nhiều so với chất bảo quản hóa học.
Phương pháp vi sinh vật: sử dụng vi khuẩn trong sản xuất thực phẩm nhằm hạn
chế sự tích tụ histamine trong thực phẩm gồm 2 hướng: bổ sung vi sinh vật tự do trực
tiếp vào quá trình sản xuất chượp mắm và sử dụng vi khuẩn được cố định vào các
chất mang. Trong đó sử dụng vi khuẩn được cố định vào các chất mang được hướng
đến là phương pháp tối ưu hơn do có ưu điểm là khơng ảnh hưởng tới hoạt tính của các
chủng vi khuẩn, không ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm, đặc biệt là không
gây nguy hại tới sức khỏe con người. Hiện nay, việc ứng dụng các vi khuẩn có chứa
các enzyme phân giải histamine đang nổi lên như là một phương pháp hữu hiệu trong
việc giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm lên men. Một số nước như Đài Loan,
8



Malaysia, và Thái Lan đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong việc làm giảm hàm
lượng histamine trong các sản phẩm lên men từ cá nói chung, cũng như với nước mắm
nói riêng (Zaman và cs., 2010, 2011; Lee và cs., 2015; Tapingkae và cs., 2010).
2.4. Tổng quan về phương pháp cố định
Kĩ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “kĩ thuật bao bọc hoặc định vị các tế
bào cịn ngun vẹn lên một vùng khơng gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc
tác mong muốn” (Karel và cs., 1985).
Kĩ thuật cố định các xúc tác sinh học nói chung và kĩ thuật cố định tế bào nói
riêng đã có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời sống. Các
loại hình kĩ thuật này đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế thiết thực và nhanh chóng đi
vào thực tế. Cố định tế bào được hiểu là sự giam giữ các tế bào trong một không gian
phản ứng và vẫn giữ được tính chất xúc tác và có thể được tái sử dụng nhiều lần hoặc
liên tục để sản xuất những sản phẩm theo mong muốn. Nói cách khác cố định tế bào
nhằm hạn chế mọi sự vận động vật lí của các tế bào bằng cách cố định chúng trên các
vật thể gọi là chất mang bằng nhiều phương pháp như hấp thụ, liên kết ion, liên kết
nguyên tử,... mà khơng ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của chúng.
2.4.1. Phương pháp hấp phụ (Adrorption)
Phương pháp hấp phụ là các tế bào được cố định trên bề mặt chất mang. Kỹ
thuật này dựa trên sự tương tác vật lý giữa vi sinh vật với bề mặt chất mang. Sự cố
định của vi sinh vật trên các chất mang phù hợp sẽ kích thích q trình trao đổi chất
của vi sinh vật, bảo vệ các tế bào khỏi các tác nhân bất lợi và duy trì hoạt động sinh lý
của chúng (Kozlyak và cs., 1993; Nikovskaya., 1989). Ưu điểm chính của phương
pháp hấp phụ đó là khả năng ràng buộc đảo ngược nghĩa là các tế bào vi sinh vật và
chất mang có thể tách rời nhau sau q trình hấp phụ do các lực liên quan đến hấp phụ
là rất yếu, các tế bào không bị hấp phụ mạnh sẽ dễ dàng được khử hấp phụ, từ đó hỗ
trợ trong quá trình tái sử dụng (Tapingkae và cs., 2010). Một số chất mang được sử
dụng trong phương pháp này là celite, pigbone, mảnh chitosan, …


9


Hình 2.4. Phương pháp hấp phụ tế bào
2.4.2. Phương pháp liên kết chéo (Cross-linking)
Cơ chế liên quan đến phương pháp này dựa trên sự hình thành liên kết cộng hóa
trị giữa hỗ trợ vơ cơ được kích hoạt và tế bào với sự có mặt của một tác nhân liên kết
(liên kết chéo). Đối với liên kết cộng hóa trị, thành tế bào chứa các nhóm chức như
NH2-, OH-, COOH- tự cho phép liên kết cộng hóa trị. Những nhóm này có thể kiên kết
chéo với nhau tạo thành giá đỡ để cố định tế bào. Liên kết ngang làm giảm sự rửa trôi
của tế bào và cải thiện độ bền cơ học của chất xúc tác sinh học (Akin., 1987). Các chất
mang được sử dụng trong phương pháp này là: alginate-chitosan beads, cross-linked
chitosan beads, cross-linked alginate beads, eggshell…

Hình 2.5. Phương pháp liên kết chéo
2.5. Tổng quan về chất mang
2.5.1. Khái niệm về chất mang vi sinh vật
Là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng làm nơi
trú ngụ và bảo vệ vi sinh vật chuyên tính trong chế phẩm từ lúc sản xuất đến khi sử
dụng (Chu Thị Thơm và cs., 2006).
2.5.2. Đặc điểm của chất mang vi sinh vật
Chất mang phải có tính cơ lý bền vững, ổn định. Về mặt hóa học chất mang
phải bền vững, khơng tan trong môi trường phản ứng, không được làm mất hay ức chế
hoạt tính của enzyme của vi sinh vật. Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền
vững với sự tấn công của vi sinh vật. Chất mang phải được chọn lọc sao cho cố định
vi sinh vật dễ dàng, có thể sử dụng nhiều lần, an tồn cho mơi trường sống. Chất mang
phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Chất mang có thể có cấu trúc siêu
lỗ, lỗ xốp, dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng. Khả năng hút nước cao 150- 200%. Hàm

10



lượng carbon hữu cơ cao, tốt nhất >60%. Không chứa các chất độc hại đối với vi sinh vật
tuyển chọn. Hàm lượng muối khống khơng vượt q 1% (Mitropoulou và cs., 2013)
2.5.2.1. Chất mang celite
Celite là một lọai đất mềm tự nhiên rất mịn được tạo thành bởi sự tích tụ vơ
định hình của silica trong các hóa thạch của tảo cát. Thành phần chủ yếu của celite là
SiO2 (89%) và một số thành phần khác như alumin Al2O3, oxit sắt Fe2O3 (V. Pace và
cs., 2010).
Trong điều kiện thường, celite có dạng bột mịn, mềm, màu trắng, kích thước
hạt từ 1μm đến hơn 1mm nhưng thông thường là từ 10-200μm. Ngồi ra, celite cịn có
độ xốp cao, trọng lượng nhẹ và trơ về mắt hóa học (Wang và cs., 2012).
Celite có cấu trúc chung bao gồm một bào nội bộ cùng một mạng lưới các lỗ
nối liền với nhau qua các thành silica. Điều này rất thích hợp cho quá trình hấp thụ vật
lý. Do vậy, celite đã được ứng dụng rộng rãi các lĩnh vực như chất trợ lọc, chất cách
nhiệt, chất khoáng, chật độn, chất làm trong… (V. Pace và cs., 2010).
Trong cơng nghệ vi sinh, celite có thể được sử dụng như một chất mang vi sinh
vật bởi các hạt celite có khả năng hấp thụ mạnh các tế bào vi sinh vật trên bề mặt do
diện tích bề mặt cao của chúng (Wang và cs., 2012).

Hình 2.6. Cấu tạo chất mang celite được chụp qua kính hiển vi
2.5.2.2. Chất mang chitosan
Chitosan là một biopolymer (polyglucosamine), là sản phẩm deacetyl của
chitin, một polysaccharide có trong thành phần cấu trúc của các lồi giáp xác như tơm,
cua, cơn trùng và vách tế bào nấm. Chitin có cấu tạo tương tự cellulose, nhưng có sự
khác biệt là đơn vị cấu tạo nên chitin là N-acetyl-D-glucosamine, các đơn vị này nối
với nhau bằng liên kết β-1-4-glycoside. Tính chất và hoạt tính sinh học của chitin và

11



chitosan phụ thuộc rất nhiều vào khối lượng phân tử và mức độ deacetyl hóa (Ravi
Kumar và cs., 2000).
Chitosan và các dẫn xuất của nó đã được sử dụng để điều chế chất hấp phụ tổng
hợp ở các dạng khác nhau như hạt, mảnh, màng,… (Ravi Kumar và cs., 2000). Màng
chitosan được ưa chuộng hơn cả các dạng chất hấp phụ chitosan khác do dễ tách sau
quá trình xử lý và không yêu cầu lọc sau xử lý. Các ưu điểm khác của chất hấp phụ
kiểu màng là khả năng hấp phụ cao hơn, động học nhanh hơn, khả năng tái sử dụng tốt
hơn, dễ xếp và mở rộng quy mơ và cũng có xác suất cơ chế tách khơng hấp phụ nâng
cao hiệu suất lọc (Salehi và cs., 2016).

Hình 2.7. Chất mang chitosan được chụp qua kính hiển vi
2.5.2.3. Chất mang pigbone
Pigbone được sản xuất từ xương ống lợn đã được loại bỏ hết phần thịt. Pigbone
có đặc tính cơ học mạnh, cấu trúc dạng xốp và không gây độc hại. Pigbone cấu tạo bao
gồm khoảng 60% các chất hữu cơ và 40% các chất vô cơ. Phần lớn mạng lưới tổng
hợp hữu cơ của nó là collagen chứa một lượng lớn các vị trí liên kết tiềm năng để gắn
vào enzyme, trong khi thành phần vô cơ gần với hydroxyapatite, trong khi thành phần
vơ cơ của nó có nhiều hydroxyapatite (Ca5(PO4)3(OH)) - một chất có tính thích ứng
sinh học cao (Bechtol và cs., 1977).Vì vậy pigbone thể hiện bản thân nó có tiềm năng
to lớn như một nguyên liệu hộ trỡ tốt cho quá trình cố định vi khuẩn.

Hình 2.8. Chất mang pigbone được chụp qua kính hiển vi
2.5.2.4. Chất mang eggshell
12


Eggshell (vỏ trứng) là một trong những phế phụ phẩm phổ biến nhất trên thế
giới. Eggshell là một loại canxi sinh, bao gồm các chất vô cơ và protein hữu cơ.
Eggshell có nhiều tính năng như độ xốp cao, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn và các sợi

mạng đan xen ổn định về mặt cơ học. Đặc biệt là màng vỏ trứng bao gồm 80% protein
và 20% vật liệu vơ cơ chứa các nhóm hữu cơ khác nhau (amino, hydroxyl, cacboxyl và
thiol), giúp nó trở thành một cơng cụ hỗ trợ lý tưởng cho quá trình cố định enzyme
(Liu và cs., 2016). Các nhóm này có thể tham gia vào một số cơ chế như hấp phụ bề
mặt, trao đổi ion, tạo phức và vi lượng mưa (Roswanir và cs., 2020).

Hình 2.9. Chất mang eggshell được chụp qua kính hiển vi
2.6. Giới thiệu chung về chủng Exiguobacterium profundum
2.6.1. Giới thiệu về chi vi khuẩn Exiguobacterium
Exiguobacterium là một chi trực khuẩn, lần đầu tiên mơ tả với đặc tính của
chủng E.aurantiacum từ một nhà máy chế biến khoai tây kiềm. Nó đã được tìm thấy ở
những khu vực có nhiệt độ rộng (-12oC, 55oC).
Một số chủng ngồi thích ứng nhiệt rộng mà cịn thích nghi với độ mặn cao, có
thể phát triển trong một phạm vi pH rộng các giá trị pH (5-11), chịu được mức độ cao của
bức xạ UV và các kim loại nặng (bao gồm asen) (Ordoñeza và cs., 2013).
Exiguobacterium là sinh vật đa dạng trên toàn cầu được tìm thấy trong nhiều
mơi trường bao gồm đại dương, hồ nước ngọt, băng, đất đá ở Himalaya, lỗ thông thủy
nhiệt,… (Vishnivetskaya và cs., 2009).
2.6.2. Giới thiệu về chủng vi khuẩn Exiguobacterium profundum
Vi khuẩn Exiguobacterium profundum là vi khuẩn thuộc chi Exiguobacterium,
vi khuẩn gram dương, kỵ khí tùy tiện, vi khuẩn ưa mặn, ưa nhiệt vừa phải và không
bào tử. Các khuẩn lạc hình trịn có màu kem hoặc màu cam trong điều kiện yếm khí
hoặc hiếu khí (Crapart v cs., 2007).
Exiguobacterium profundum cú kớch thc 0,5-1ì2-10 àm, kớch thước khuẩn
lạc 1-2 mm. Chủng phát triển trong khoảng nhiệt độ nhiệt độ từ 12°C đến 49°C, ngừng
13


phát triển ở 50°C, tối ưu ở 37°C, khoảng pH cho sự phát triển từ pH= 5,5 - 9,5, ph 7 là
tối ưu (Crapart và cs., 2007).

2.6.3. Cơ chế phân giải histamine của chủng vi khuẩn Exiguobacterium
profundum

Histamine được phân giải thơng qua q trình oxy hóa tách nhóm amine
được xúc tác bởi enzyme dehydrogenase được sinh ra bởi vi sinh vật. Vi khuẩn
sử dụng enzyme histamine dehydrogenase để xúc tác phản ứng oxy hóa tách
nhóm amine thành các sản phẩm là imidazole acetaldehyde và ammonia (Trần
Thị Thu Hằng và cs., 2019).
2.7. Ảnh hưởng của hai yếu tố tốc độ khuấy và nồng độ muối trong quá
trình cố định tế bào
2.7.1. Nồng độ muối trong Tris HCl 50mM; pH 7,0
Muối là một trong các yếu tố quan trọng trong quá trình sản xuất nước mắm
cũng như là một trong các yếu tố quyết định đến khả năng sinh trưởng và phân giải
histamine của chủng vi khuẩn. Việc tăng hay giảm nồng độ muối sẽ ảnh hưởng đến
quá trình trao đổi chất của vi khuẩn có khả năng sinh enzyme decarboxylase, từ đó làm
giảm sự tích lũy các amine sinh học trong thực phẩm. Tuy nhiên, con người có xu
hướng tránh sử dụng thực phẩm có hàm lượng muối cao do chúng ảnh hưởng đến sức
khỏe (Fausto., 2016).
2.7.2. Tốc độ khuấy
Sự cố định enzyme địi hỏi phải lắc hoặc khuấy để đình chỉ hoàn toàn các hạt
vận chuyển và tạo điều kiện cho chúng tiếp xúc với enzyme trong dung dịch. Quá trình
cố liên quan đến các bước sau: sự khuếch tán của các phân tử protein từ sinh khối của
vi khuẩn vào các lỗ rỗng bên trong chất mang và phản ứng hóa học giữa protein với
các nhóm chức trên chất mang. Các phân tử protein khuếch tán qua chất lỏng màng
(lớp ngồi) xung quanh chất mang và sau đó cố định trên bề mặt hoặc thâm nhập vào
vị trí liên kết và cuối cùng gắn vào bên trong chất mang. Tốc độ khuếch tán của các
chất trong hệ khác nhau ở các tốc độ lắc khác nhau sẽ ảnh hưởng rõ rệt đến sự khuếch
tán giới hạn của chất tan (Jingran Liu và cs., 2020).

14



PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 được kế thừa từ đề tài nghiên cứu của
TS. Trần Thị Thu Hằng và cs., năm 2019.
Chất mang được dùng để cố định: celite, pigbone, chitosan flakes và eggshell.
3.1.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 03/2021 đến tháng 09/2021.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và Cơng nghệ,
Khoa Cơng nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
3.1.3.1. Thiết bị và dụng cụ
Bảng 3.1 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT
1
Cân kỹ thuật

Thiết bị

Xuất xứ
Mỹ

2

Cân phân tích

Mỹ


3

Tủ ni vi sinh có lắc JSR

Hàn Quốc

4

Tủ nuôi vi sinh Memmert

Mỹ

5

Máy khuấy từ (IKA RH basic 2)

Đức

6

Tủ lạnh Panasonic

7

Nồi hấp ALP

Nhật

8


Máy phân tích HPLC

Mỹ

9

Máy đo pH (Thermo Scientific)

Singapore

10

Tủ cấy Air stream ESCO

Singapore

11

Tủ sấy Memmert

Mỹ

12

Bể siêu âm Elma

Đức

Thái Lan


Dụng cụ sử dụng gồm: gồm có pipet các loại, pipet man 1ml, pipet man 0.1ml,
bình tam giác các loại, đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, phễu chiết, bình định
mức các loại, lam kính, ống phancol, ống eppendorf, bút viết kính, túi bóng kính, dây
nịt, màng bọc thực phẩm, đèn cồn,...

15


3.1.3.2. Hóa chất sử dụng
Bảng 3.2. Danh sách hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Hóa chất

Xuất xứ


STT

KCl
Trung Quốc 16
MgSO4.7H2O
Trung Quốc 17
Cao nấm men
Ấn Độ
18
Trisodium citrate Trung Quốc 19
MnCl2.4H2O
Trung Quốc 20
FeCl3.4H2O
Trung Quốc 21
Axit casamino
Mỹ
22
NaCl
Trung Quốc 23
Sodium glutamat Trung Quốc 24
Agar
Việt Nam
25
Methanol
Đức
25
Axetonnitrin
Đức
27

HCOOH
Đức
HCl
Đức
Glutaraldehyde
Trung Quốc
Mơi trường Halophilic (HA): Mơi trường

Hóa chất
CH3COONH4
OPA
Na2B4O7.7H2O
BME
EDTA
NaOH
Histamine
Albumin
1-methoxy PMS
Celtie
Tris- HCl
Ethanol

Xuất xứ
Đức
Đức
Đức
Đức
Đức
Đức
Đức

Đức
Đức
Ấn Độ
Hàn Quốc
Đức

dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn chịu

mặn, thành phần môi trường được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần môi trường halophilic bổ sung 21% muối
STT
Thành phần
Hàm lượng(g/l)
1
NaCl
210
2
MnCl2.4H2O
0.00036
3
Cao nấm men
5
4
Sodium glutamate
1
5
Axit casamino
5
6
KCl

1
7
MgSO4.7H2O
20
8
FeCl3.4H2O
0.036
9
Trisodium citrate
3
Lên thể tích 1000ml bằng H2O; pH= 7,2±0,2; hấp khử trùng 121°C trong 15 phút
(Tapingkae và cs., 2010)
3.2. Nội dung nghiên cứu
+ Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trong quá trình cố định đến hiệu suất cố định và
khả năng phân giải histamine của chủng Exiguobacterium profundum CH2.1 cố định
trên 4 chất mang: celte, pigbone, chitosan flakes, eggshell;
16