HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
-----------------------------------------------------

ĐẬU TRẦN LINH ĐAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ,
THỜI GIAN ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH VÀ
KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE CỦA
CHỦNG Virgibacillus campisalis TT8.5

Hà Nội - Tháng 09/2021


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
-----------------------------------------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ,
THỜI GIAN ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH VÀ
KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE CỦA
CHỦNG Virgibacillus campisalis TT8.5
Người thực hiện

: Đậu Trần Linh Đan

MSV

: 621034

Khóa

: 62

Ngành

: Cơng nghệ thực phẩm

Giảng viên hướng dẫn

: PGS. TS. Nguyễn Hồng Anh

Bộ mơn

: Hóa sinh - Cơng nghệ sinh học thực phẩm

Hà Nội - Tháng 09/2021


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
trung thực và chưa hề được sử dụng; mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận
này đã được cảm ơn và các thơng tin được trích dẫn trong chun đề này đã được ghi
rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021
Sinh viên thực hiện

Đậu Trần Lınh Đan



LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn từ nhiều cá nhân và tập thể.
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô và các cán bộ của Học viện Nông
nghiệp Việt Nam đã dạy bảo tận tình và ln tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập
trong suốt những năm học vừa qua.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh,
ThS. Phạm Thị Dịu, ThS. Nguyễn Thị Hồng, Nguyễn Thị Huyền tại phịng thí nghiệm
Trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm - những người đã nhiệt tình hướng dẫn,
chỉ bảo, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập cũng như nghiên cứu.
Và cuối cùng, với tất cả lịng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn
tới bố mẹ, những người thân của tôi đã động viên và tạo động lực cho tơi trong suốt q
trình học tập, nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2021
Sinh viên thực hiện

Đậu Trần Linh Đan


MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .........................................................................................................1
1.2. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu .................................................................................................2
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu ..................................................................................................................2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................3
2.1. Tổng quan về nước mắm ..........................................................................................3

2.1.1. Giới thiệu về nước mắm ........................................................................................3
2.1.2. Quy trình sản xuất nước mắm ...............................................................................4
2.2. Giới thiệu về Histamine ............................................................................................5
2.2.1. Tổng quan về histamine.........................................................................................5
2.2.2. Tác hại của histamine đối với cơ thể người...........................................................6
2.2.3. Sự hình thành histamine trong nước mắm.............................................................7
2.3. Tổng quan về vi chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis ......................................8
2.3.1. Giới thiệu chung ....................................................................................................8
2.3.2. Giới thiệu về Virgibacillus campisalis ..................................................................8
2.4. Tổng quan về chất mang...........................................................................................8
2.4.1. Khái niệm về chất mang vi sinh vật ......................................................................8
2.4.2. Đặc điểm của chất mang vi sinh vật ......................................................................8
2.4.3. Lựa chọn chất mang .............................................................................................. 9
2.5. Tổng quan về phương pháp cố định........................................................................12
2.5.1. Phương pháp hấp phụ ..........................................................................................12
2.5.2. Phương pháp liên kết chéo ..................................................................................13
PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........14
3.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 14


3.1.1. Đối tượng .............................................................................................................14
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất...............................................................................14
3.1.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ...........................................................................16
3.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 16
3.3. Phương pháp nghiên cứu: .......................................................................................16
3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................................17
3.3.2. Phương pháp phân tích ........................................................................................17
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................23
4.1. Mơ tả hình thái chế phẩm cố định và đồ thị đường chuẩn .....................................23
4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của

chủng Virgibacillus campisalis TT8.5 ..........................................................................24
4.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine của
chủng Virgibacillus campisalis TT8.5 ..........................................................................27
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................31
5.1. Kết luận...................................................................................................................31
5.2. Kiến nghị ................................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 33
PHỤ LỤC ......................................................................................................................36


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tác hại của histamine đối với cơ thể người ....................................................6
Bảng 3.1 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .................................................................14
Bảng 3.2. Danh sách hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .............................................15
Bảng 3.3. Thành phần môi trường halophilic bổ sung 21% muối ................................ 15
Bảng 3.4. Chương trình dẫn xuất hóa tự động trên hệ thống HPLC ............................. 20


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ cơng nghệ sản suất nước mắm (Lương Đức Phẩm, 2010) ....................4
Hình 2.2. Cơng thức cấu tạo ............................................................................................5
Hình 2.3. Cấu trúc khơng gian.........................................................................................5
Hình 2.4. Sự chuyển hóa từ histidine thành histamine bởi histidine decarboxylase .......6
Hình 2.5. Nguồn gốc hình thành histamine trong quy trình sản xuất nước mắm ...........7
Hình 2.6. Cấu trúc của celite qua kính hiển vi .............................................................. 10
Hình 2.7. Cấu trúc của pigbone qua kính hiển vi ..........................................................10
Hình 2.8. Cấu trúc của chitosan qua kính hiển vi..........................................................11
Hình 2.9. Cấu trúc của eggshell qua kính hiển vi..........................................................11
Hình 2.10. Phương pháp hấp phụ tế bào .......................................................................13
Hình 2.11. Phương pháp liên kết chéo ..........................................................................13

Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp nghiên cứu .....................................................................16
Hình 4.1. Mẫu chưa sấy đơng khơ .................................................................................23
Hình 4.2. Mẫu sau sấy đơng khơ ...................................................................................23
Hình 4.3. Mẫu chế phẩm eggshell .................................................................................23
Hình 4.4. Đồ thị đường chuẩn histamine (mM) ............................................................ 24
Hình 4.5. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của TT8.5 trên chất mang celite ....................................................................24
Hình 4.6. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của TT8.5 trên chất mang pigbone ............................................................... 25
Hình 4.7. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của TT8.5 trên chất mang chitosan flakes ....................................................26
Hình 4.8. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của TT8.5 trên chất mang eggshell ............................................................... 26
Hình 4.9. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của TT8.5 trên chất mang celite ....................................................................27
Hình 4.10. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của TT8.5 trên chất mang pigbone ............................................................... 28
Hình 4.11. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của TT8.5 trên chất mang chitosan flakes ....................................................29
Hình 4.12. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của TT8.5 trên chất mang eggshell ............................................................... 30


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
Chữ viết tắt
BME
Cs
EDTA

Chữ viết đầy đủ

β-mercaptoethanol
Cộng sự
Ethylene Diamine Tetracetic Acid

FAO

Food and Agricuture Organization of the United Nation

HA

Halophilic

HPLC

High-performance liquid chromatography

OPA

o-Phthalaldehyde

STT

Số thứ tự

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam


PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.2. Đặt vấn đề
Nước mắm là một loại gia vị mang lại hương vị đặc trưng thơm ngon cho món
ăn và bổ sung những chất dinh dưỡng quan trọng như các acid amin không thể tự tổng
hợp, omega 3 và một số vitamin khác. Ở Việt Nam, nước mắm truyền thống luôn
không thể thiếu trong bữa ăn gia đình hằng ngày.
Nước ta đã sản xuất ra nhiều loại nước mắm ngon, có thương hiệu trong nước và
nước mắm cũng được xem là một mặt hàng chính trong ngành thủy sản. Tuy nhiên,
nước mắm truyền thống Việt Nam lại chưa xuất hiện nhiều trên thị trường quốc tế. Lý
do khó xuất khẩu là nước mắm Việt Nam chứa một lượng histamine cao (một amin
sinh học có mối nguy hại cho sức khỏe con người) tùy theo vùng miền có thể biến động
từ 1000 – 3000mg/lít (Báo cáo của Hiệp hội nước mắm Phan Thiết, 2013), trong khi
theo Codex (Ủy ban Tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế) quy định “hàm lượng histamine
trong nước mắm không được quá 400mg/l”. Nên nguy cơ cao có thể gây ngộ độc, biểu
hiện như ngứa, phát ban, nổi mề đay, nhức đầu, đau bụng, tiêu chảy, mạch nhanh, khó
thở, co thắt khí quản, hạ huyết áp do giãn mạch…cho người tiêu dùng (Nguyễn Trần
Thị Giáng Hương, 2007). Vì vậy cần tìm ra giải pháp tối ưu nhằm làm giảm hàm lượng
histamine có trong nước mắm.
Trên thực tế, việc sử dụng các phương pháp vật lý hóa học để phân giải histamine
vừa tốn kém vừa gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Vì vậy, phương pháp sinh học
có thể nói là phương pháp hữu hiệu nhất bởi tính an tồn của nó và đặc biệt việc ứng
dụng các vi khuẩn có khả năng phân giải histamine mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên,
thay vì việc sử dụng phương pháp bổ sung vi khuẩn tự do vào nước mắm thành phẩm
vừa tốn thời gian, tốn chi phí, vừa khó kiểm sốt được quy trình cơng nghệ, màu sắc, độ
lên men... vì vậy các nhóm nghiên cứu trước đã hướng đến phương pháp cố định tế bào.
Phương pháp này giúp vi khuẩn phân giải histamine đạt hiệu quả tốt nhất mà khơng ảnh
hưởng đến hoạt tính sinh học của chủng vi khuẩn. Đặc biệt, tế bào cố định có thể sử
dụng được nhiều lần và có thể ngừng ứng dụng theo ý muốn của người nghiên cứu
nên không ảnh hưởng đến chất lượng của nước mắm.

1



Kế thừa kết quả nghiên cứu của TS. Trần Thị Thu Hằng và cộng sự (2019) về
tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân giải histamine từ chượp mắm, đã tuyển chọn
được chủng Virgibacillus campisalis TT8.5. Cùng với đó theo đánh giá kết quả các
nghiên cứu trước đã chọn ra được bốn loại chất mang: chitosan flakes, pigbone, celite,
eggshell là những chất mang mà cố định mang lại hiệu suất cố định cao nhất cũng như
khả quan và phổ biến dễ tìm.
Vậy nhằm mục đích tìm ra những điều kiện thích hợp nhất của các yếu tố ảnh
hưởng đến phương pháp cố định tế bào làm giảm lượng histamine trong nước mắm, đề
tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất cố định và khả
năng phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5” được thực
hiện.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất cố định và khả
năng phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5;
- Xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nước mắm
2.1.1. Giới thiệu về nước mắm
Nước mắm được bạn bè quốc tế biết đến là một loại gia vị “quốc hồn, quốc túy”

của Việt Nam. Nước mắm Việt Nam không chỉ được sử dụng để nêm nếm các món ăn
lúc nấu nướng, chúng còn được dùng để pha chế các loại nước chấm. Nếp văn hóa sử
dụng nước mắm thường trực ở mỗi gia đình Việt đã có hơn hàng trăm năm nay.
Theo cách hiểu thông thường, đây là chất nước được rỉ ra từ cá, tôm và một số
động vật nước khác được ướp muối lâu ngày. Loại gia vị (nước chấm) này được sử dụng
rộng rãi trong ẩm thực của các quốc gia Đông Nam Á như Việt Nam và Thái Lan. Hiểu
theo góc nhìn khoa học, nước mắm là hỗn hợp đồng nhất của muối với các axit amin
được chuyển biến từ protein trong thịt cá qua một quá trình thuỷ phân nhờ tác nhân là
các hệ enzyme có sẵn trong ruột cá cùng với một loại vi khuẩn kỵ khí chịu mặn.
Tại Việt Nam, nước mắm có thể được làm từ cá sống, cá khơ hoặc từ cả các loại
sị hến, tơm cua. Một số loại nước mắm chỉ có cá và muối, một số khác có thể có thêm
dược thảo và một số gia vị khác. Nước mắm cần được lên men trong thời gian dài nhằm
làm giảm mùi tanh và tạo ra hương vị đậm đà, hấp dẫn. Đặc biệt, cá và muối dùng làm
mắm phải trải qua quá trình tuyển chọn nghiêm ngặt. Ở một số nhà thùng lớn, các nguyên
liệu này còn buộc phải tuân thủ 5 tiêu chí khắt khe của nhà thùng đưa ra để cho ra được
những giọt nước mắm đạt chuẩn của Bộ Y tế.

3


2.1.2. Quy trình sản xuất nước mắm
2.1.2.1. Quy trình sản xuất
Cá + muối

Trộn

Lên men

Chiết rút lần 1
Bã chượp chín


Chiết rút lần 2

Nước mắm chiết
rút lần 2

Bã

Nước mắm
nguyên chất

Pha đấu

Nước mắm
thành phẩm

Làm phân bón hoặc
thức ăn gia súc
Hình 2.1. Sơ đồ công nghệ sản suất nước mắm (Lương Đức Phẩm, 2010)
2.1.2.2. Thuyết minh quy trình
Trộn muối: Muối sau khi chuẩn bị được trộn với cá. Đối với cá nhỏ thì muối được
trộn đều với cá hoặc 1 lớp muối, 1 lớp cá. Một số loại cá lớn trước khi trộn muối phải
xay nhỏ. Tỉ lệ muối thường là từ 20-25% so với khối lượng cá. Mức độ muối cho vào tùy
thuộc vào độ tươi của cá, cá ươn lượng muối cho vào sẽ nhiều hơn cá tươi. Sau khi trộn
muối hỗn hợp được để trong thùng lên men từ 1 đến 2 ngày.
Chượp: Có ba phương pháp chế biến chượp cổ truyền. Phương pháp đánh khuấy
được thực hiện bằng cách cho muối nhiều lần, cho nước lã, đánh khấy liên tục. Phương
pháp gài nén được thực hiện bằng cách cho muối một lần hoặc nhiều lần, không cho
nước lã, gài nén. Phương pháp hỗn hợp, lúc đầu thực hiện gài nén sau đó thực hiện đánh
4



khuấy. Sau đó tiến hành chiết rút. Trước khi tiến hành kéo rút để lấy sản phẩm cần phải
tiến hành chính xác độ chín của chượp. Độ chín của chượp được đánh giá theo TCVN
8336:2010.
Pha đấu nước mắm: Thông thường nước mắm kéo rút ra không đúng độ đạm
quy định, để đảm bảo độ theo tiêu chuẩn quy định hoặc phù hợp với nhu cầu khách hàng
người ta pha đấu các loại nước mắm khác nhau để đạt được nước mắm thành phẩm có
độ đạm đạt yêu cầu. Sản phẩm đạt yêu cầu được bao gói và ghi nhãn phù hợp với tiêu
chuẩn hiện hành.
2.2. Giới thiệu về Histamine
2.2.1. Tổng quan về histamine
Histamine là một amin sinh học, có cơng thức phân tử là C5H9N3, tên khoa học
là 2-(3H-imidazol-4-yl) ethanamine. Nó là 1 hợp chất dị vịng, có 2 nhóm amin
(diamines), dạng tinh thể, dễ hút ẩm, nhiệt độ nóng chảy 83,50C, nhiệt độ sơi 209,50C,
dễ hịa tan trong nước và ethanol, tan rất ít trong diethyl ether (FAO, 2013).

Hình 2.2. Cơng thức cấu tạo

Hình 2.3. Cấu trúc khơng gian

Phần lớn histamine trong cơ thể được tìm thấy ở các hạt trong tế bào mast (hay
mastocytes, dưỡng bào) hoặc bạch cầu ái kiềm. Tế bào mast đặc biệt tập trung nhiều ở
các vị trí dễ bị tổn thương như mũi, miệng, chân; bề mặt nội mô cơ thể, và thành mạch
máu,... là chất nội sinh được tạo ra một cách tự nhiên khi cần thiết và bị thủy phân ngay
khi lượng histamine nội sinh được tổng hợp đủ (FAO, 2013). Những tế bào chứa
histamine không phải là tế bào mast cũng được tìm thấy ở một vài tổ chức như não, nơi
mà chức năng của nó như là một chất dẫn truyền thần kinh. Một vị trí quan trọng nữa
của sự tích trữ và giải phóng histamine là ở các tế bào ái chrom của niêm mạc dạ dày.


5


2.2.2. Tác hại của histamine đối với cơ thể người
Histamine có nguồn gốc từ q trình decarboxy hóa của axít amin histidine, phản
ứng được xúc tác bởi enzym L-histidine decarboxylase. Nó là một amin có tính hút nước
và tính gây giãn mạch.

Hình 2.4. Sự chuyển hóa từ histidine thành histamine bởi histidine decarboxylase
Một vài dạng bệnh do thức ăn, còn gọi là ngộ độc thức ăn, có nguyên nhân do sự
chuyển hóa từ histidine thành histamine trong thức ăn chín, chẳng hạn như thức ăn chế
biến từ cá chứa histamine cao xảy ra ở rất nhiều nước và được phát hiện đầu tiên ở cá
ngừ, cá nục, cá thu...Một số bệnh dị ứng như dị ứng thời tiết,dị ứng hóa chất,dị ứng chất
tẩy nhuộm dị ứng xi măng người ta thấy lượng histamine tăng lên. Nếu lượng histamine
trong cơ thể vượt ngưỡng cho phép thì có thể dẫn tới các phản ứng dị ứng sau theo
Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, 2007:
Bảng 2.1. Tác hại của histamine đối với cơ thể người
Ảnh hưởng
Đối với hệ hơ hấp
Đối với hệ tiêu hóa
Đối với hệ bài tiết
Ảnh hưởng tới mắt
Phản ứng trên da
Đối với hệ tim mạch
Đối với hệ thần kinh
Đối với các cơ trơn

Triệu chứng
Gây sổ mũi, hen suyễn do ảnh hưởng của viêm, phù nề và
co thắt khí quản

Gây tiết quá độ HCl và pepsin dẫn tới tiêu chảy do co thắt
ruột, làm tăng nhu động và bài tiết dịch ruột
Histamine góp phần làm tăng bài tiết nước mắt, nước mũi,
nước bọt, dịch tụy
Làm viêm và sưng đỏ kết mạc mắt
Nổi phát ban, mề đay, chàm, ngứa, sưng phù trên da
Hạ huyết áp, gây co thắt tim, giãn mạch. Histamine còn có
tác dụng trực tiếp đối với cơ tim và thần kinh nội tại
Histamine kích thích đầu sợi thần kinh ngoại vi gây cảm
giác ngứa và đau. Trên thần kinh trung ương histamine
cịn tác động gây ra tình trạng giảm thân nhiệt, gây mất
ngủ, có thể chán ăn, tăng tiết ADH
Ở người, histamine làm tăng co bóp cơ trơn tử cung (cơ
trơn bàng quang, túi mật, niệu đạo ít bị ảnh hưởng)

6


2.2.3. Sự hình thành histamine trong nước mắm
Một số nghiên cứu đã được tiến hành để xác định nguyên nhân hình thành
histamine trong nước mắm. Brillantes và cộng sự (2002) đã chỉ ra rằng hàm lượng
histamine cao trong nước mắm là sự kết hợp của histamine trong nguyên liệu ban đầu
và histamine hình thành trong quá trình lên men. Enzyme histidine decarboxylase khơng
chỉ được hình thành trong ngun liệu trước giai đoạn lên men mà được tiếp tục được
sinh ra trong giai đoạn lên men. Q trình lên men có thể đáp ứng được đầy đủ các điều
kiện cần thiết cho sự hình thành các amin hữu cơ chẳng hạn như: có sẵn các amino acid
tự do, sự có mặt của vi sinh vật sinh enzyme decarboxylase, điều kiện cho phép vi sinh
vật phát triển tổng hợp enzyme decarboxylase và hoạt động của enzyme này. Hàm lượng
histamine tăng nhanh theo thời gian lên men và đạt cực đại vào tháng thứ sáu. Sau sáu
tháng hàm lượng histamine giảm dần điều này cho thấy việc kéo dài thời gian lên men

cho phép giảm đáng kể histamine trong sản phẩm (Lee và cs, 2013). Sanceda và cộng
sự (1999) chứng minh hàm lượng histamine giảm trong quá trình lên men do hoạt động
của các vi khuẩn phân giải histamine.
Nguồn gốc hình thành histamine có thể được tóm lược lại trên sơ đồ quy trình sản
xuất nước mắm (Lee và cs, 2013):
Cá

Histamine (phụ thuộc vào độ tươi và loại cá)

Trộn muối

Lên men (9-12 tháng)

Histamine (hình thành trong 6 tháng đầu tiên)

Lọc rút
Ủ chín

Nước mắm
Hình 2.5. Nguồn gốc hình thành histamine trong quy trình sản xuất nước mắm

7


2.3. Tổng quan về vi chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis
2.3.1. Giới thiệu chung
Chi Virgibacillus thuộc họ Bacillaceae, là một chi vi khuẩn gram (+), hình que. Các
lồi chi này được tìm thấy rộng rãi ở nhiều mơi trường sống và các lồi hiện đang được mơ
tả chủ yếu được phân lập từ mơi trường nước mặn. Các lồi Virgibacillus có thể là loại
vi sinh vật hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện. Trong điều kiện mơi trường thích hợp, vi khuẩn có

thể tạo ra các nội bào tử hình bầu dục hoặc hình elip ở đầu hoặc đi.
2.3.2. Giới thiệu về Virgibacillus campisalis
Virgibacillus campisalis là trực khuẩn gram (+), hình que, kớch thc (0,52 0,67)
ì (1,21 1,82) àm. Các khuẩn lạc trên đĩa thạch có hình trịn, hơi lồi, màu trắng đục,
hơi bóng, có rìa răng cưa và đường kính 0.5–1.5 mm sau khi ủ trong 5 ngày ở 37oC. Là
loại vi khuẩn có khả năng di chuyển, phát triển được trong điều kiện nhiệt độ 15 – 40oC,
pH 6.0 – 9.0 và nồng độ muối là 5 – 20%, phát triển tối ưu ở điều kiện nhiệt độ 37oC,
pH 7.5 – 8 và nồng độ muối 4 – 5% (Lee và cs, 2012).
2.4. Tổng quan về chất mang
2.4.1. Khái niệm về chất mang vi sinh vật
Chất mang được dùng là các hợp chất vô cơ (bột photphorit, bột apatit, bột xương,
bột vỏ sò…) hay các chất hữu cơ (than bùn, bã nấm, phế thải nông nghiệp, rác thải...).
Chất mang được ủ yếm khí hoặc hiếu khí nhằm tiêu diệt một phần vi sinh vật tạp và
trứng sâu bọ, bay hơi các hợp chất dễ bay hơi và phân giải phần nhỏ các chất hữu cơ
khó tan (Chu Thị Thơm và cs, 2006).
2.4.2. Đặc điểm của chất mang vi sinh vật
Yêu cầu khi lựa chọn sử dụng chất mang (Mitropoulou và cs, 2013; Klein và
Wagner, 1983):
Điểm quan tâm đầu tiên khi lựa chọn chất mang là giá thành thấp. Điều này liên
quan đến hiệu quả kinh tế của quy trình cơng nghệ, đặc biệt là khi quy trình đó ứng dụng
vào quy mơ cơng nghiệp.
Về mặt vật lý chất mang phải có tính cơ lý bền vững, ổn định, chịu được các điều
kiện môi trường như khuấy trộn, áp lực trong quy trình sản xuất. Về mặt hóa học chất
mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng, khơng được làm mất hay
ức chế hoạt tính của enzyme của vi sinh vật. Về mặt sinh học chất mang phải có tính

8


kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật, phù hợp hình dạng thiết bị

phản ứng sinh học.
Chất mang phải được chọn lọc sao cho cố định vi sinh vật dễ dàng, có thể sử dụng
nhiều lần, an tồn cho mơi trường sống. Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích
bề mặt tiếp xúc lớn. Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định vi sinh vật,
vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoặt tính enzyme
và vơ số lần tái sử dụng. Chất mang có thể có cấu trúc siêu lỗ, lỗ xốp, dạng hạt, dạng
màng, dạng phim mỏng. Khả năng hút nước cao 150- 200%, hàm lượng carbon hữu cơ
cao, tốt nhất >60%, không chứa các chất độc hại đối với vi sinh vật tuyển chọn, hàm
lượng muối khống khơng vượt q 1%, kích thước hạt phù hợp với đối tượng sử dụng.
2.4.3. Lựa chọn chất mang
Từ kết quả của các nhóm khóa luận trước, chúng tơi đã chọn lọc ra các chất mang
cho hiệu suất cao như: celite, pigbone, chitosan flakes. Ngồi ra, chúng tơi sử dụng thêm
chất mang eggshell bởi nó là chất mang dễ sử dụng và là 1 trong những chế phẩm phổ
biến nhất.
2.4.3.1. Celite
Celite có tên gọi khác là diatomite một lọai đất mềm tự nhiên rất mịn được tạo
thành bởi sự tích tụ vơ định hình của silica trong các hóa thạch của tảo cát. Thành phần
chủ yếu của celite là SiO2 (89%), một lượng lớn đáng kể alumin (Al2O3) và oxit sắt
(Fe2O3) (Wang và cs, 2012, Ibrahim và Selim, 2011). Trong điều kiện thường, celite có
dạng bột mịn, mềm, màu trắng, kích thước hạt từ 1μm đến hơn 1mm nhưng thơng thường
là từ 10-200μm. Ngồi ra, celite cịn có độ xốp cao, trọng lượng nhẹ và trơ về mắt hóa
học (Wang và cs, 2012).
Celite có cấu trúc chung bao gồm một bào nội bộ cùng một mạng lưới các lỗ nối
liền với nhau qua các thành silica. Vì vậy trong cơng nghệ vi sinh, celite có thể được sử
dụng như một chất mang vi sinh vật bởi các hạt celite có khả năng hấp thụ mạnh các tế
bào vi sinh vật trên bề mặt do diện tích bề mặt cao của chúng (Wang và cs, 2012).

9



Hình 2.6. Cấu trúc của celite qua kính hiển vi
2.4.3.2. Pigbone
Pigbone được sản xuất từ xương ống lợn đã được loại bỏ hết phần thịt. Pigbone có
đặc tính cơ học mạnh, cấu trúc dạng xốp và không gây độc hại và được cấu tạo bao gồm
khoảng 60% các chất hữu cơ và 40% các chất vơ cơ. Trong đó thành phần vơ cơ của nó
có nhiều hydroxyapatite (Ca5(PO4)3(OH)) - một chất có tính thích ứng sinh học cao.
Các hạt pigbone lấy từ xương ống lợn được chứng minh là một vật liệu hỗ trợ hữu
ích có các đặc tính sau: trọng lực của hạt pigbone là 1,7 g/cm3 và người ta quan sát thấy
rằng các hạt pigbone phân tán tốt cả trong dung môi phân cực và không phân cực. Những
đặc điểm này có một lợi thế rất quan trọng trong việc sử dụng làm vật liệu hỗ trợ cho sự
cố định của lipase, bởi vì lipase khơng chỉ được sử dụng để thủy phân chất béo và dầu
trong hệ thống nước hoặc hữu cơ trong nước mà còn cho q trình ester hóa và sự quan
tâm hóa trong hệ thống vi bám (Bechtol và cs, 1977). Độ xốp này là một lợi thế bổ sung
cho sự cố định của các enzym. Vì vậy pigbone có tiềm năng to lớn như một nguyên liệu
hộ trỡ tốt cho quá trình cố định vi khuẩn.

Hình 2.7. Cấu trúc của pigbone qua kính hiển vi
2.4.3.3. Chitosan Flakes
Chitosan thu được từ quá trình khử kitin (vốn là chất tạo nên cấu trúc của lớp vỏ
của các loài giáp xác và thành tế bào của loài nấm ), bao gồm các liên kết β- (1-4) của
N–acetyl–D –glucosamine và D – glucosamine. Chitosan và các dẫn xuất của nó đã
được sử dụng để điều chế chất hấp phụ tổng hợp ở các dạng khác nhau như hạt, mảnh,
10


bột, tấm và màng (Rinaudo, 2006; Zhang, Zeng & Cheng, 2016). Các chất hấp phụ phân
tán như hạt, mảnh và bột mặc dù cung cấp diện tích bề mặt hoạt tính cao và hiệu suất xử
lý nhưng lại có vấn đề vì chúng phải được tách ra khỏi sản phẩm cuối cùng sau quá trình
xử lý. Màng chitosan được ưa chuộng hơn các dạng chất hấp phụ chitosan khác do dễ
tách sau q trình xử lý và khơng u cầu lọc sau xử lý. Các ưu điểm khác của chất hấp

phụ kiểu màng là khả năng hấp phụ cao hơn, động học nhanh hơn, khả năng tái sử dụng
tốt hơn, dễ xếp và mở rộng quy mơ và cũng có xác suất cơ chế tách không hấp phụ nâng
cao hiệu suất lọc (Salehi và cs, 2016).

Hình 2.8. Cấu trúc của chitosan qua kính hiển vi
2.4.3.4. Eggshell
Trên thực tế, các sản phẩm phụ này có nhiều tính năng cao như độ xốp, diện tích
bề mặt lớn và các sợi mạng đan xen ổn định về mặt cơ học. Đặc biệt là màng vỏ trứng
bao gồm 80% protein và 20% vật liệu vơ cơ chứa các nhóm hữu cơ khác nhau (amino,
hydroxyl, cacboxyl và thiol), giúp nó trở thành một cơng cụ hỗ trợ lý tưởng cho quá
trình cố định enzyme (Liu và cộng sự, 2016). Các nhóm này có thể tham gia vào một số
cơ chế như hấp phụ bề mặt, trao đổi ion, tạo phức và vi lượng mưa (Roswanir và cộng
sự, 2020). Từ các ưu điểm của cố định enzyme và đặc điểm của màng vỏ trứng thì việc
sử dụng loại phế phụ phẩm này làm chất mang là một phương pháp phù hợp để phát
triển việc cố định trong tương lai.

Hình 2.9. Cấu trúc của eggshell qua kính hiển vi
11


2.5. Tổng quan về phương pháp cố định
Kĩ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “kĩ thuật bao bọc hoặc định vị các tế
bào còn nguyên vẹn trên một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc
tác mong muốn” (Karel và cộng sự, 1985).
Kĩ thuật cố định các xúc tác sinh học nói chung và kĩ thuật cố định tế bào nói riêng
đã có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời sống. Các loại hình
kĩ thuật này đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế thiết thực và nhanh chóng đi vào thực tế.
Cố định tế bào được hiểu là sự giam giữ các tế bào trong một khơng gian phản ứng và vẫn
giữ được tính chất xúc tác và có thể được tái sử dụng nhiều lần hoặc liên tục để sản xuất
những sản phẩm theo mong muốn. Nói cách khác cố định tế bào nhằm hạn chế mọi sự

vận động vật lí của các tế bào bằng cách cố định chúng trên các vật thể gọi là chất mang
bằng nhiều phương pháp như hấp thụ, liên kết ion, liên kết nguyên tử, bao bọc tế bào mà
khơng ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của chúng.
2.5.1. Phương pháp hấp phụ
Phương pháp hấp phụ là các tế bào được cố định trên bề mặt chất mang. Kỹ thuật
này dựa trên sự tương tác vật lý giữa vi sinh vật với bề mặt chất mang. Sự cố định của
vi sinh vật trên các chất mang phù hợp sẽ kích thích q trình trao đổi chất của vi sinh
vật, bảo vệ các tế bào khỏi các tác nhân bất lợi và duy trì hoạt động sinh lý của chúng
(Kozlyak và cộng sự, 1993; Nikovskaya, 1989).
Ưu điểm chính của phương pháp hấp phụ đó là khả năng đảo ngược của ràng buộc
nghĩa là các tế bào vi sinh vật và chất mang có thể tách rời nhau sau q trình hấp phụ
do các lực liên qua đến hấp phụ là rất yếu, các tế bào không bị hấp phụ mạnh sẽ dễ dàng
được khử hấp phụ. Từ đó hỗ trợ trong quá trình sử dụng lặp lại (Tapingkae và cs, 2010).
Kỹ thuật này dựa trên vật lý tương tác giữa vi sinh vật và bề mặt chất mang, trong khi
thường xuyên thuận nghịch là đơn giản, rẻ và hiệu quả (Akin, 1987).
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp phụ của tế bào vi sinh vật chẳng hạn như
tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Cấu trúc, diện tích bề mặt của tế bào hay tính kỵ
nước cũng rất quan trọng trong việc kết dính các tế bào vi sinh vật với bề mặt chất rắn.
Ngoài ra, bản chất của chất hấp phụ cũng đóng một vai trị rất quan trọng như sự ổn định
về mặt hóa học, cấu trúc lỗ hay khả năng tái sử dụng. Vì vậy nhược điểm của phương
pháp này là tế bào dễ bị tách khỏi chất mang do tác động cơ học hay thay đổi môi trường.
12


Chất mang được sử dụng trong phương pháp này là celite, pigbone, chitosan flakes.

Hình 2.10. Phương pháp hấp phụ tế bào
2.5.2. Phương pháp liên kết chéo
Cơ chế liên quan đến phương pháp này dựa trên sự hình thành liên kết cộng hóa
trị giữa hỗ trợ vơ cơ được kích hoạt và tế bào với sự có mặt của một tác nhân liên kết

(liên kết chéo) (Akin, 1987).
Ưu điểm của liên kết chéo là đối với liên kết cộng hóa trị, thành tế bào chứa các
nhóm chức như NH2-, OH-, COOH- tự cho phép liên kết cộng hóa trị. Những nhóm này
có thể kiên kết chéo với nhau tạo thành giá đỡ để cố định tế bào. Liên kết ngang làm
giảm sự rửa trôi của tế bào và cải thiện độ bền cơ học của chất xúc tác sinh học (Akin,
1987). Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là gắn kết cộng hóa trị và liên kết
chéo là hiệu quả và bền với enzyme, nhưng nó hiếm khi được áp dụng để cố định các tế
bào. Nguyên nhân chủ yếu là do các chất mang được sử dụng để hình thành liên kết
cộng hóa trị thường gây độc tế bào và rất khó tìm điều kiện để các tế bào có thể cố định
mà khơng bị tổn hại (Ramakrishna và Prakasham, 1999).
Chất mang được sử dụng trong phương pháp này là: eggshell

Hình 2.11. Phương pháp liên kết chéo

13


PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng
Chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5 được kế thừa từ đề tài nghiên cứu
của nhóm nghiên cứu TS. Trần Thị Thu Hằng và cs, năm 2019 và được cung cấp từ phịng
thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ Thực
phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Chất mang được dùng để cố định: Celite (Ấn Độ), pigbone (Việt Nam),
chitosan flakes (Đức), eggshell (Việt Nam).
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Bảng 3.1 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Thiết bị


Xuất xứ

1

Cân kỹ thuật

Mỹ

2

Cân phân tích

Mỹ

3

Tủ ni vi sinh có lắc JSR

Hàn Quốc

4

Tủ ni vi sinh Memmert

Mỹ

5

Máy khuấy từ (IKA RH basic 2)


Đức

6

Tủ lạnh Panasonic

Thái Lan

7

Nồi hấp ALP

Nhật

8

Máy phân tích HPLC

Mỹ

9

Máy đo pH (Thermo Scientific)

Singapore

10

Tủ cấy Air stream ESCO


Singapore

11

Tủ sấy Memmert

Mỹ

12

Bể siêu âm Elma

Đức

13

Kính hiển vi

Mỹ

14

Máy so màu UV1800 Spectrophotometer

Nhật Bản

Dụng cụ sử dụng gồm: gồm có pipet các loại, pipet man 1ml, pipet man 0.1ml,
bình tam giác các loại, đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, phễu chiết, bình định
mức các loại, lam kính, ống phancol, ống eppendorf, bút viết kính, túi bóng kính, dây
nịt, màng bọc thực phẩm, đèn cồn,...


14


Bảng 3.2. Danh sách hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT

Hóa chất

Xuất xứ

STT

Hóa chất

Xuất xứ

1

KCl

Trung Quốc

15 CH3COONH4

Đức

2

MgSO4.7H2O


Trung Quốc

16 OPA

Đức

3

Cao nấm men

Ấn Độ

17 Na2B4O7.7H2O

Đức

4

Trisodium citrate

Trung Quốc

18 BME

Đức

5

MnCl2.4H2O


Trung Quốc

19 EDTA

Đức

6

FeCl3.4H2O

Trung Quốc

20 NaOH

Đức

7

Axit casamino

Mỹ

21 Histamine

Đức

8

NaCl


Trung Quốc

22 H3PO4

Đức

9

Sodium glutamat

Trung Quốc

23 1-methoxy PMS

Đức

10

Agar

Việt Nam

24 Celtie

Ấn Độ

11

Methanol


Đức

25 Ethanol

Đức

12

Axetonnitrin

Đức

26 Coomassie Brilliant Blue Đức

13

HCOOH

Đức

27 Tris- HCl

14

HCl

Đức

-


Hàn Quốc
-

-

Môi trường Halophilic (HA): Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn chịu mặn,
thành phần môi trường theo Tapingkae và cộng sự, 2010 được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần môi trường halophilic bổ sung 21% muối
STT
Thành phần
Hàm lượng(g/l)
1
NaCl
210
2
MnCl2.4H2O
0.00036
3
Cao nấm men
5
4
Sodium glutamate
1
5
Axit casamino
5
6
KCl
1

7
MgSO4.7H2O
20
8
FeCl3.4H2O
0.036
9
Trisodium citrate
3
10
Agar
20
Lên thể tích 1000ml bằng H2O; pH= 7,2±0,2; hấp khử trùng 121°C trong 15 phút

15


- Môi trường thạch HA: Môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy đếm khuẩn lạc
của các chủng vi khuẩn.
- Mơi trường lỏng HA: Có thành phần như mơi trường HA nhưng khơng có agar
để hoạt hóa và ni sinh khối các chủng vi khuẩn.
3.1.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm bộ mơn Hóa sinh – Cơng nghệ sinh học
thực phẩm, phịng thí nghiệm trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Công
nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 03/2021 đến tháng 09/2021.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine
của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5
- Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải histamine

của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5
3.3. Phương pháp nghiên cứu:
Nuôi cấy

Ly tâm thu sinh khối

Chất mang:

Nhiệt độ:
4°C; 37°C; t°p

- Pigbone,
celite, chitosan
(hấp phụ)

Cố định tế bào

- Egghell (liên

Thời gian:

kết chéo)

0,5h; 1h; 1,5h; 3h.
Chế phẩm cố định

Hiệu suất cố

Khả năng phân


định tế bào

giải histamine

Hình 3.1. Sơ đồ phương pháp nghiên cứu

16