HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LÊ VĂN BÌNH

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI CHẤT MANG
VÀ TỶ LỆ TẾ BÀO/CHẤT MANG ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ
ĐỊNH VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE CỦA
CHỦNG Virgibacillus Campisalis TT8.5

Hà Nội – 09/2021


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI CHẤT MANG
VÀ TỶ LỆ TẾ BÀO/CHẤT MANG ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ
ĐỊNH VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE CỦA
CHỦNG Virgibacillus Campisalis TT8.5

Người thực hiện

: Lê Văn Bình

Mã sinh viên

: 621013

Lớp

: K62QLTP

Khóa

: 62

Chun nghành

: Quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Hồng Anh
Bộ mơn

: Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm

Hà Nội – 09/2021


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu riêng của tôi với sự giúp đỡ tận tình
của thầy giáo hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực,
chưa từng được sử dụng. Các thơng tin, trích dẫn đã được ghi rõ nguồn gốc và tôi xin
chịu trách nhiệm về những số liệu trong bài khóa luận này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Sinh viên thực hiện


Lê Văn Bình

i


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện ở phịng thí nghiệm Trung tâm Khoa
học và Cơng nghệ Thực phẩm - Khoa Công nghệ thực phẩm - Học viện Nông nghiệp
Việt Nam dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Hồng Anh thuộc bộ mơn Hóa
Sinh – Cơng nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nơng
nghiệp Việt Nam.
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của nhiều tổ chức, cá nhân trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu đề tài.
Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS. Nguyễn Hoàng Anh
đã quan tâm giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tơi, hướng dẫn tơi trong
suốt q trình nghiên cứu và hồn thành tốt đề tài này.
Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ tại phòng thí nghiệm Trung tâm
Khoa học và Cơng nghệ thực phẩm - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, bạn Hồng
Thái Bảo - lớp K62QLTP đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề tài này.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã ln ở bên tơi,
chăm sóc, động viên tơi và tồn thể các bạn bè đã giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực
hiện đề tài tốt nghiệp.
Với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế của một sinh viên
khơng thể tránh được những thiếu sót. Tơi rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý
kiến của các thầy cơ để tơi có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức của mình, phục vụ
tốt hơn công tác thực tế sau này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2021


Sinh viên

Lê Văn Bình

ii


MỤC LỤC
PHẦN I: MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2. Mục đích, yêu cầu .................................................................................................2
1.2.1. Mục đích .........................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu ...........................................................................................................2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3
2.1. Nước mắm .............................................................................................................3
2.1.1. Giới thiệu chung về nước mắm ......................................................................3
2.1.2. Quy trình sản xuất nước mắm.........................................................................3
2.1.2.1. Sơ đồ quy trình .........................................................................................3
2.1.2.2. Thuyết minh quy trình cơng nghệ ............................................................4
2.2. Histamine ..............................................................................................................6
2.2.1. Khái niệm, cấu tạo histamine..........................................................................6
2.2.2. Sự hình thành của histamine trong thực phẩm ...............................................7
2.2.3. Cơ chế gây độc và tác hại của histamine đối với cơ thể người. .....................8
2.2.4. Phương pháp giảm hàm lượng histamine .......................................................9
2.3 .Vi khuẩn Virgibacillus campisalis ......................................................................11
2.3.1. Giới thiệu chung về chi Virgibacillus ...........................................................11
2.3.2. Giới thiệu vi khuẩn Virgibacillus campisalis ...............................................12
2.4. Tổng quan về chất mang .....................................................................................13
2.4.1. Khái niệm của chất mang vi sinh vật ............................................................13
2.4.2. Đặc điểm của chất mang vi sinh vật .............................................................13

2.4.3. Các loại chất mang........................................................................................13
2.4.3.1. Chất mang celite .....................................................................................13
2.4.3.2. Chất mang chitosan ................................................................................14
2.4.3.3. Chất mang pigbone .................................................................................15
2.4.3.4. Chất mang eggshell ................................................................................16
2.5. Phương pháp cố định tế bào ................................................................................17
2.5.1. Phương pháp hấp phụ (Adsorption)..............................................................17

iii


2.5.2. Phương pháp liên kết chéo (Cross-linking) ..................................................18
PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....19
3.1. Đối tượng, địa điểm nghiên cứu..........................................................................19
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................19
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu .....................................................................................19
3.1.3. Thiết bị và hóa chất.......................................................................................19
3.1.3.1. Thiết bị ...................................................................................................19
3.1.3.2. Hóa chất ..................................................................................................20
3.1.3.3. Mơi trường ni cấy ...............................................................................21
3.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................22
3.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................23
3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm .....................................................................23
3.3.2. Phương pháp vi sinh .....................................................................................25
3.3.2.1. Phương pháp hoạt hóa chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5
trên môi trường lỏng HA .....................................................................................25
3.3.2.2. Phương pháp nuôi cấy, thu hồi sinh khối ...............................................26
3.3.3. Phương pháp phân tích .................................................................................26
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................29
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................30

4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định tế bào và khả năng
phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5 ................................30
4.2. Ảnh hưởng của loại chất mang đến hiệu suất cố định tế bào và khả năng phân
giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5 .........................................33
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................34
5.1. Kết luận ...............................................................................................................34
5.2. Kiến nghị .............................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................35
PHỤ LỤC .....................................................................................................................38

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ cơng nghệ sản xuất nước mắm (Trần Xn Ngạch, 2007) ..................4
Hình 2.2. Cơng thức cấu tạo histamine ...........................................................................6
Hình 2.3. Cấu trúc khơng gian histamine ........................................................................7
Hình 2.4. Sự hình thành histamine từ histidine ...............................................................7
Hình 2.5. Phương trình chuyển hóa histamine bằng enzyme của vi sinh vật ...............11
Hình 2.6. Chất mang celite được chụp qua kính hiển vi ...............................................14
Hình 2.7. Cơng thức cấu tạo của chitosan .....................................................................14
Hình 2.8. Chitosan dạng mảnh ......................................................................................15
Hình 2.9. Cấu trúc nano của chitosan ............................................................................15
Hình 2.10. Chất mang chitosan được chụp qua kính hiển vi ........................................15
Hình 2.11. Chất mang pigbone được chụp qua kính hiển vi .........................................16
Hình 2.12. Cấu trúc vỏ trứng qua mặt cắt ngang...........................................................16
Hình 2.13. Chất mang eggshell được chụp qua kính hiển vi ........................................17
Hình 2.14. Phương pháp hấp phụ tế bào .......................................................................18
Hình 2.15. Phương pháp liên kết chéo ..........................................................................18
Hình 4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định và khả năng

phân giải histamine trên chất mang celite sau 2 giờ phản ứng ......................................30
Hình 4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định và khả năng
phân giải histamine trên chất mang chitosan sau 2 giờ phản ứng .................................31
Hình 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định và khả năng
phân giải histamine trên chất mang pigbone sau 2 giờ phản ứng .................................31
Hình 4.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định và khả năng
phân giải histamine trên chất mang eggshell sau 2 giờ phản ứng .................................32
Hình 4.5. Ảnh hưởng của loại chất mang đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của Virgibacillus campisalis TT8.5 sau 2 giờ phản ứng ..............................33
v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tác hại của histamine đối với cơ thể người ....................................................9
Bảng 2.2. Loài Virgibacillus .........................................................................................12
Bảng 2.3. Thành phần của celite ...................................................................................13
Bảng 3.1. Thiết bị sử dụng nghiên cứu .........................................................................20
Bảng 3.2. Hóa chất sử dụng nghiên cứu ........................................................................21
Bảng 3.3. Thành phần môi trường lỏng HA 21% trong 1 lít mơi trường......................22
Bảng 3.4: Q trình dẫn xuất hóa tự động trên hệ thống HPLC ...................................28

vi


DANH MỤC VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ


1

BME

β-mercaptoethanol

2

Cs

Cộng sự

3

DM

Dry matter

4

EDTA

Edetic Acid

5

GABA

Gamma-Aminobutyric acid


6

HA

Halophilic

7

HPLC

High-performance liquid chromatography

8

OD

ODorbance

9

OPA

Ortho-Phthalaldehyde

10

STT

Số thứ tự


11

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

vii


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nước mắm là gia vị đặc trưng không thể thiếu trong bữa ăn của các gia đình
Việt, khơng chỉ đem lại hương vị thơm ngon mà còn được coi là một nguồn protein và
các amino acid quan trọng. Mặc dù có giá trị dinh dưỡng cao, nhưng sự có mặt các
amine sinh học trong nước mắm với hàm lượng cao, đặc biệt là histamine là mối nguy
hại cho sức khoẻ con người (Zaman và cs, 2010).
Trên thực tế ở Việt Nam nước mắm truyền thống có hàm lượng histamine biến
động từ 1000-3000 mg/l (Hiệp hội nước mắm Phan Thiết, 2013). Trong khi đó, Ủy ban
Châu Âu (EC) năm 2005 quy định giới hạn hàm lượng histamine trong nước mắm là
400 mg/l. Như vậy, các sản phẩm nước mắm truyền thống chứa hàm lượng histamine
vượt quá nhiều so với tiêu chuẩn của EC. Khi hàm lượng histamine trong cơ thể vượt
mức quy định sẽ gây ra ngộ độc histamine hay còn gọi là ngộ độc scombrotoxin
(James M. Hungerford, 2010).
Hiện nay có một số phương pháp có thể làm giảm hàm lượng histamine như
phương pháp vật lý, hóa học, vi sinh…, tuy nhiên phương pháp vật lí, hóa học lại gây
ảnh hưởng đến sức khỏe con người cũng như gây tốn kém chi phí. Do đó, phương
pháp sinh học đang được hướng đến bởi tính an tồn và đặc biệt việc ứng dụng các vi
khuẩn có khả năng phân giải histamine mang lại hiệu quả cao (Leuscher và cs, 1998).
Hiện nay, có 2 cách tiếp cận để ứng dụng vi khuẩn trong phân giải histamine trong

nước mắm là bổ sung trực tiếp vào trong chượp mắm hoặc ứng dụng vi sinh vật cố
định trong chất mang để phân giải trực tiếp histamine trong nước mắm thành phẩm.
Tuy nhiên phương pháp bổ sung trực tiếp vi sinh vật tự do vào quá trình lên men nước
mắm lại khó kiểm sốt các yếu tố hay các chủng vi khuẩn khác có trong nước mắm.
Do đó, hướng ứng dụng tế bào vi khuẩn cố định để phân giải histamine trong nước
mắm thành phẩm cần được nghiên cứu.
Kết quả nghiên cứu trước của PGS.TS. Nguyễn Hoàng Anh (kết quả chưa công
bố) đã chỉ ra rằng cố định chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5 (do nhóm
phân lập được) bằng phương pháp hấp phụ và liên kết chéo luôn đạt hiệu suất cố định
và khả năng phân giải histamine cao. Bên cạnh đó, việc cố định tế bào vi khuẩn vào
1


các chất mang khác nhau để tăng hiệu quả phân giải histamine cũng như độ tái sử dụng
chất mang cũng rất cần phải quan tâm. Các chất mang được sử dụng trong nghiên cứu
này bao gồm: bột vỏ trứng (eggshell), celite, bột xương lợn (pigbone) và chitosan vì
giá thành rẻ, dễ kiếm, thân thiện với môi trường và tiết kiệm chi phí sản xuất sản
phẩm.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chất
mang và tỷ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định và khả năng phân giải
histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5” được thực hiện.
1.2. Mục đích, yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định ảnh hưởng của loại chất mang và tỷ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất
cố định và khả năng phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5.
1.2.2. Yêu cầu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của loại chất mang tới hiệu suất cố định và khả năng
phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ tế bào/chất mang đến hiệu suất cố định và
khả năng phân giải histamine của chủng Virgibacillus campisalis TT8.5.


2


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nước mắm
2.1.1. Giới thiệu chung về nước mắm
Nước mắm là sản phẩm giàu dinh dưỡng, một đặc sản của Việt Nam. Với vài
ngàn kilomet bờ biển và phong phú các loại cá là điều kiện thuận lợi cho ngành chế
biến nước mắm ỏ nước ta phát triển, sản phẩm nước mắm được sản xuất ở nhiều nơi
với các thương hiệu nổi tiếng từ lâu như nước mắm Phú Quốc, Phan Thiết, Khánh
Hoà, Cát Hải,... Ngày nay, nước mắm là loại nước chấm không thể thiếu vắng trong
bữa ăn hàng ngày của nhân dân ta và đang dần dần có uy tín trên thị trường thế giới
(Lương Đức Phẩm, 2010).
Q trình cơng nghệ sản xuất, nước mắm gồm hai giai đoạn. Hai giai đoạn cơ
bản là thuỷ phân và tạo mùi. Có thể coi đây là hai giai đoạn lên men nước mắm: lên
men chính và lên men phụ. Trong lên men chính, chủ yếu là thuỷ phân protein của thịt
cá thành amino acid:
Protein → Polypeptit → Oligopeptit → Amino acid
Tác nhân thuỷ phân protein ở đây là enzyme, protelytic gồm một phức hợp
enzyme, proteinaza và peptidaza.
Lên men phụ là hồn thiện q trình thuỷ phân, hình thành hương vị đặc trưng
của nước mắm từ các sản phẩm phụ của quá trình lên men (Lương Đức Phẩm, 2010).
Nước mắm hấp dẫn bởi hương vị đặc biệt của nó cùng với giá trị dinh dưỡng
cao. Khoảng 86% hàm lượng nitơ tổng số là các nitơ hữu cơ và 49% là nitơ của các
amino acid tự do. Hàm lượng các amino acid đạt khoảng 4 g/L với sự có mặt gần như
đầy đủ của các amino acid thiết yếu như lysine, leucine, valine, isoleucine, histidine,
phenylalanine, threonine và methionine (Lopetcharat và cs, 2001).
2.1.2. Quy trình sản xuất nước mắm
2.1.2.1. Sơ đồ quy trình


3


Cá

Lựa chọn và xử lý

Muối

Trộn muối

Ủ lên men

Chiết rút lần 1

Nước mắm nguyên chất

Bã chượp chín

Chiết rút lần 2

Nước mắm chiết rút
lần 2

Pha đấu

Lựa chọn và
lý
Bãxử

mắm
Nước mắm
thành phẩm

ần 2
Làm phân bón hoặc
thức ăn gia súc

Hình 2.1. Sơ đồ cơng nghệ sản xuất nước mắm (Trần Xuân Ngạch, 2007)
2.1.2.2. Thuyết minh quy trình cơng nghệ
- Ngun liệu:
Cá: việc lựa chọn cá để sản xuất nước mắm rất quan trọng đối với chất lượng sản
phẩm (thương hiệu). Phần lớn nước mắm được sản xuất từ cá biển, những loại nước
mắm ngon được làm từ các loại cá là: cá cơm, cá mòi, cá nục, cá trích, cá phèn, lươn
ngắn, …
Muối: muối để sử dụng làm mắm là muối biển.
-

Trộn muối:

4


Trước khi chế biến, phải tiến hành vệ sinh thùng chượp và tính tốn lượng muối
cho vào chượp. Cho cá và muối vào thùng. Cứ một lớp cá thì một lớp muối và dùng
bàn cào gỗ để dàn đều lớp cá và lớp muối. Phủ một lớp muối mặt khá dày khoảng 2 –
3 cm trên cùng. Mục đích là giữ nhiệt và tránh ruồi nhặng đậu vào.
Lấy nhiều lớp lá phủ lên lớp muối mặt. Lớp lá được cột chặt vào các thanh nẹp,
dùng các đòn hạ gài các thanh nẹp lại rồi dùng hai đòn thượng gác ngang qua thùng
chượp để nén vỉ không bị trồi lên (Trần Xuân Ngạch, 2007).

-

Ủ lên men:

Ủ trong thời gian 2 ngày. Đây là giai đoạn lên men khô, cả khối chượp nóng lên
dần. Lên men khơ yếm khí vừa có tác dụng phân giải tốt, vừa tạo hương vị thơm ngon.
Trong quá trình lên men, theo dõi thường xuyên để bổ sung lượng muối nếu xảy ra
hiện tượng cá đòi muối. Hiện tượng cá đòi muối là hiện tượng bụng cá trương lên do
chứa các khí H2S, NH3, CO2, …và dần dần nổi lên (Trần Xuân Ngạch, 2007).
- Chượp chính: Theo Trần Xn Ngạch (2007), thì có 3 phương pháp chế biến
chượp cổ truyền:
+ Phương pháp đánh khuấy: đây là phương pháp của nước mắm Cát Hải - Hải
Phòng, là phương pháp cho muối nhiều lần đã lợi dụng được khả năng phân giải của
enzyme và vi sinh vật tới mức đô cao, rút ngắn thời gian chế biến chượp. Cho muối
nhiều lần là tạo điều kiện để phòng thối, tiêu diệt các vi khuẩn gây thối thơng thường
và khơng kìm hãm nhiều quá khả năng hoạt động của men. Và cho thêm nước lã là
cung cấp cho môi trường phân giải một lượng vi sinh vật đáng kể, tạo môi trường lỏng
giúp cho men và vi sinh vật hoạt động được dễ dàng, làm cho tế bào thịt cá chóng
được phân giải.
+ Phương pháp gài nén: Cá được trộn đều với muối cho đủ muối ngay từ đầu hoặc
cho muối nhiều lần, sau đó ướp vào thùng hoặc bể rồi gài nén. Dựa vào men trong cá
để phân giải protide của thịt cá, không cho nước lã và không đánh khuấy. Đây là
phương pháp của miền Trung.
+ Phương pháp chế biến hỗ hợp (kết hợp hai phương pháp gài nén và đánh khuấy):
phương pháp này rút kinh nghiệm từ hai phương pháp trên. Lúc đầu, thực hiện phương
pháp gài nén. Và sau đó thực hiện phương pháp đánh khuấy. Sau 6 – 12 tháng, chượp

5



đã chín hồn tồn, có thể chiết rút. Đặc điểm của phương pháp này là chượp chín cá
vẫn cịn ngun con, xương không nát nên thuận lợi cho việc kéo rút.
-

Chiết rút:

Quá trình kéo rút nước mắm là quá trình lọc liên hồn. Nó là q trình rút đạm
trong bã không qua nấu bằng cách dùng lượng nước bổi hoặc nước thuộc ít đạm cho
chuyển lần lượt từ thùng này qua thùng khác để tăng đạm và tăng hương vị (Trần
Xuân Ngạch, 2007).
-

Pha đấu:

Muốn thu được nước mắm có hương vị thơm ngon và có nồng độ đạm như mong
muốn, ta phải pha đấu các loại nước mắm có độ đạm khác nhau, thường pha nước
mắm có độ đạm cao với nước mắm có độ đạm thấp thành loại nước mắm có độ đạm
trung bình. Việc tính tốn thể tích được thực hiện theo quy tắc đường chéo (Trần Xuân
Ngạch, 2007).
2.2. Histamine
2.2.1. Khái niệm, cấu tạo histamine
Histamine là một amine sinh học, có cơng thức phân tử là C5H9N3, danh pháp
hóa học là 2-(3H-imidazol-4-yl) ethanamine. Nó là 1 hợp chất dị vịng, có 2 nhóm
amine (diamines), dạng tinh thể, dễ hút ẩm, nhiệt độ sơi 209,50C, nhiệt độ nóng chảy
83,5 ºC, tan rất ít trong diethyl ether, dễ hịa tan trong nước và ethanol.
Histamine là một hợp chất không mùi và rất khó phát hiện, nó là một chất chịu
nhiệt, thậm chí khi được nấu chín ở nhiệt độ cao histamine vẫn khơng bị phân hủy
(Lutein và cs, 1992).

Hình 2.2. Công thức cấu tạo histamine


6


Hình 2.3. Cấu trúc khơng gian histamine
2.2.2. Sự hình thành của histamine trong thực phẩm
Histamine được hình thành bởi sự tách nhóm α-carboxyl ra khỏi amino acid
histidine (Hình 2.4). Histidine là một trong các amino acid không thay thế mà cơ thể
người không tự tổng hợp, được cung cấp từ thức ăn. Histidine thường được tìm thấy
trong thực phẩm như cá, thịt, trứng và các sản phẩm từ sữa (Wickham, 2011).

Hình 2.4. Sự hình thành histamine từ histidine
Sự tách nhóm α-carboxyl của amino acid diễn ra do hoạt động của enzyme
decarboxylase có trong nguyên liệu hoặc do các vi sinh vật sinh ra (Shalaby, 1996).
Các vi sinh vật này có thể có sẵn trong nguyên liệu hoặc xuất hiện trong quá trình xử
lý nguyên liệu và trong quá trình chế biến thực phẩm. Trong các sản phẩm lên men từ
cá, các amine được hình thành với hàm lượng lớn. Nguyên nhân có thể là do điều kiện
lên men đã đáp ứng các yêu cầu cần thiết cho sự sinh amine như mức độ sẵn có của
các amino acid tự do, sự hiện diện của vi khuẩn sinh enzyme decarboxylase và các
điều kiện cho phép sự phát triển của vi khuẩn này.
Histamine được tạo thành từ amino acid histidine nên thực phẩm chứa nhiều
đạm bảo quản càng lâu thì lượng histamine càng tăng. Thực phẩm tươi hầu như khơng
có hoặc có chứa rất ít histamine. Thịt, cá đặc biệt là các loại cá biển như cá ngừ, cá
nục, cá thu… bị ôi, ươn có hàm lượng histamine cao. So với thịt gia súc gia cầm, thịt
cá có độ bền cơ học kém hơn, vi sinh vật (vi khuẩn Enterobacteriaceae; Morganella

7


morganii...) rất dễ phát triển và sinh ra enzyme chuyển amino acid histidine thành

histamine (Wickham, 2011).
2.2.3. Cơ chế gây độc và tác hại của histamine đối với cơ thể người.
Histamine thể hiện các tác động thông qua 4 thụ thể trên màng tế bào bao gồm:
H1, H2, H3 và H4. Việc kết hợp histamine với các thụ thể này kích thích tạo ra đáp
ứng chức năng như mơ tả chi tiết sau đây:
+ Thụ thể histamine H1 đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng dị ứng và
được phân bố rộng rãi trong toàn bộ hệ thống thần kinh ngoại vi, đặc biệt là cơ trơn,
nơi nó kích hoạt gây co mạch. Kích hoạt thụ thể H1 gây giãn mạch máu, tăng khả năng
thấm của ống, kích thích dây thần kinh cảm giác trong đường thở và co thắt phế quản.
Ngồi ra, kích hoạt thụ thể này thúc đẩy hóa trị của bạch cầu ái toan, có thể dẫn đến
tắc nghẽn mũi, hắt hơi và chảy nước mắt. Khi kích thích trên vỏ não, thụ thể H1 có thể
ức chế kênh kali trong màng tế bào thần kinh, làm mất tính phân cực của các nơ ron
thần kinh và tăng kích thích thần kinh (Robertson, 2019).
+ Các thụ thể H2 được tìm thấy trên các tế bào ở bên trong dạ dày, tim và ở
một mức độ giới hạn, trong tế bào miễn dịch và cơ trơn mạch. Kích hoạt thụ thể H2
kích thích sự giãn mạch và giải phóng axit dạ dày cần thiết cho q trình tiêu hóa.
Kích hoạt kết hợp các thụ thể H1 và H2 gây nên chứng chảy nước mũi và sưng các
đường thở trong mũi (Robertson, 2019).
+ Các thụ thể histamine H3 là một autoreceptor presynaptic tìm thấy trên các tế
bào thần kinh có chứa histamine. Nó được phân bố rộng rãi trong tồn hệ thống thần
kinh trung ương, có biểu hiện lớn nhất ở vỏ não, nhân đuôi, đồi thị, hốc mắt và
hippocampus. Sự phân bố đa dạng của thụ thể H3 trong tồn bộ vỏ não cho thấy thụ
thể này có thể điều chỉnh nhiều chất dẫn truyền thần kinh như dopamine, GABA,
acetylcholine và norepinephrine trong hệ thống thần kinh trung ương và ngoại biên
(Robertson, 2019).
+ Các thụ thể histamine H4 chủ yếu được tìm thấy trên các tế bào miễn dịch và
các mô bao gồm bạch cầu, lá lách, tủy xương và tuyến ức. Nó cũng được tìm thấy
trong đại tràng, phổi, gan và bệnh epicanthus. Kích thích thụ thể này thúc đẩy hóa trị
của bạch cầu ái toan và tăng sự gắn kết các phân tử (Robertson, 2019).
8



Một số tác hại của histamine đối với cơ thể người thể hiện dưới bảng sau:
Bảng 2.1. Tác hại của histamine đối với cơ thể người
Cơ quan
Hệ hô hấp

Ảnh hưởng
Gây sổ mũi, hen suyễn do ảnh hưởng của viêm, phù nề và co thắt
khí quản.

Hệ tiêu hóa

Gây tiết q độ HCl và pepsin dẫn tới tiêu chảy do co thắt ruột,
làm tăng nhu động và bài tiết dịch ruột.

Mắt

Làm tăng bài tiết nước mắt, nước mũi, nước bọt, dịch tụy.
Làm viêm và sưng đỏ kết mạc mắt.

Da

Nổi phát ban, mề đay, chàm, ngứa, sưng phù trên da.

Hệ bài tiết

Tim mạch

Hệ thần kinh


Các cơ trơn

Hạ huyết áp, gây co thắt tim, giãn mạch, tăng co bóp cả tâm nhĩ,
tâm thất, chậm dẫn truyền nhĩ thất và chậm khử cực nút xoang.
Kích thích đầu sợi thần kinh ngoại vi gây cảm giác ngứa và đau.
Trên thần kinh trung ương histamine còn tác động gây ra tình
trạng giảm thân nhiệt, gây mất ngủ, có thể chán ăn, tăng tiết
ADH.
Tăng co bóp cơ trơn tử cung (cơ trơn bàng quang, túi mật,
niệu đạo ít bị ảnh hưởng).

(Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, 2007)
2.2.4. Phương pháp giảm hàm lượng histamine
Theo Renes và cs (2014), để giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm, có rất
nhiều phương pháp được áp dụng theo hai xu hướng chính: phịng ngừa, ngăn chặn sự
hình thành, tích tụ histamine trong thực phẩm. Và khi histamine được hình thành, áp
dụng các phương pháp phân giải nó thành các hợp chất khác. Các phương pháp chủ
yếu được sử dụng bao gồm phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, và phương
pháp vi sinh vật.
-

Phương pháp vật lí:
Một số phương pháp vật lý như sử dụng phương pháp chiếu xạ, áp suất thủy

tĩnh cao hoặc thay đổi thành phần khí trong bao gói sản phẩm đã được nghiên cứu sử
dụng để làm giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm (Naila và cs, 2010).
Phương pháp sử dụng chiếu xạ tia gamma có hiệu quả và độ chắc chắn cao
trong việc tiêu diệt các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme decarboxylase cũng như
9



phân hủy các amine đã được tạo thành. Chính vì khả năng trên mà tia chiếu xạ cũng
đồng thời tiêu diệt cả các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phân giải histamine.
Nguy hiểm hơn là nó tạo ra nhiều gốc tự do trong thành phẩm, gây ảnh hưởng khơng
tốt tới sức khỏe con người. Bên cạnh đó, áp dụng kỹ thuật này cần chi phí lớn. Chính
vì vậy, rất khó để phá hủy histamine có trong thực phẩm bằng phương pháp vật lý.
-

Phương pháp hóa học:

Vai trị của các chất bảo quản (kháng khuẩn) đối với việc hạn chế sự hình thành
histamine trong thực phẩm vẫn cịn chưa rõ ràng. Bên cạnh đó, liều lượng sử dụng các
hóa chất này trong thực phẩm được quy định rất cụ thể, thường có giới hạn nhất định.
Hơn nữa, xu hướng của người tiêu dùng hiện nay là giảm dần việc tiêu thụ thực phẩm
có sử dụng hóa chất bảo quản.
Việc sử dụng các chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên trong thực phẩm đang là xu
thế chung trên thế giới, đặc biệt là ở các nước phát triển. Tuy nhiên, giá thành của các
sản phẩm này thường cao hơn rất nhiều so với chất bảo quản hóa học.
-

Phương pháp vi sinh vật:

Bổ sung các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine. Histamine được
phân giải thông qua quá trình oxy hóa tách nhóm amine (oxidative deamination) được
xúc tác bởi enzyme histamine oxidase hoặc histamine dehydrogenase được sinh ra từ
một số vi sinh vật.
Trong đó, histamine oxidase xúc tác chuyển hóa histamine, với sự có mặt của nước
và oxy, thành imidazole acetaldehyde, ammonia và hydrogen peroxide (Hình 2.5a).
Bên cạnh đó, một số vi khuẩn sử dụng enzyme histamine dehydrogenase để xúc tác

phản ứng oxy hóa tách nhóm amin thành các sản phẩm là imidazole acetaldehyde và
ammonia (Hình 2.5b). Một số vi khuẩn sản sinh ra enzyme này bao gồm Rhizobium
sp., Nocardioides simplex, và Natrinema gari.

10


(a)

(b)
Hình 2.5. Phương trình chuyển hóa histamine bằng enzyme của vi sinh vật
(a) phản ứng xúc tác bởi enzyme diamine oxidase,
(b) phản ứng xúc tác bởi enzyme histamine dehydrogenas

Ưu điểm: việc bổ sung các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải histamine
vào thực phẩm trước quá trình lên men là hướng đi có tính khả thi cao, với tỷ lệ phân
giải histamine đạt khoảng trên 30%. Bên cạnh đó, sử dụng vi sinh vật thường có chi
phí thấp, không cần trang thiết bị đặc biệt.
Nhược điểm: Để áp dụng phương pháp vi sinh vật, cần có các nghiên cứu tỉ mỉ,
cụ thể vì mỗi một loại thực phẩm sẽ có các chủng vi sinh vật khác nhau phù hợp với
thực phẩm đó trong việc phân giải histamine. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phát
triển và phân giải histamine của vi sinh vật cần được xác định chính xác.
2.3 .Vi khuẩn Virgibacillus campisalis
2.3.1. Giới thiệu chung về chi Virgibacillus
Chi vi khuẩn Virgibacillus thuộc họ Bacillaceae, trong ngành Firmicutes. Là
một chi của vi khuẩn gram (+), hình que (trực khuẩn).
Các loài thuộc chi này được phân lập phổ biến ở nhiều hệ sinh thái và các loài
gần đây được mơ tả hầu hết có nguồn gốc từ mơi trường nước mặn. Nó được xác định
đặc điểm hóa học bởi sự có mặt của acid meso-diaminopimelic-một diamino acid điển
hình của chuỗi peptidoglycan.

Các lồi Virgibacillus có thể là các loại vi sinh vật hiếu khí, hoặc vi sinh vật kỵ
khí tùy tiện và có ứng catalase dương tính. Trong điều kiện mơi trường thích hợp, vi
khuẩn có thể tạo ra các nội bào tử hình bầu dục hoặc hình elip ở đầu hoặc đuôi.

11


Chi Virgibacillus được phân loại bởi Heyndrickx và cs (1998) nhờ việc phân
loại lại loài Bacillus pantothenticus. Chi này gồm có 27 lồi với các tên lồi đã được
cơng bố (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Loài Virgibacillus
STT

Tên loài

STT

Tên loài

STT

Tên loài

1

V.alimentairius

10

V.kekensis


19

V.chiguensis

2

V.arcticus

11

V.litoralis

20

V.holophilus

3

V.byunsanensis

12

V.marismortui

21

V.holodenitrificans

4


V.oceani

13

V.necropolis

22

V.holotolerans

5

V.olivae

14

V.salarius

23

V.subterraneus

6

V.campisalis

15

V.salexigens


24

V.xinjiangensis

7

V.pantothenticus

16

V.salinus

25

V.dokdonensis

8

V.carmonensis

17

V.sediminis

26

V.soli

9


V.picturae

18

V.siamensis

27

V.proomii

(Sasnchez-Porro và cs, 2014)
2.3.2. Giới thiệu vi khuẩn Virgibacillus campisalis
Trong nghiên cứu của Lee và cs (2012), vi khuẩn Virgibacillus campisalis là
một chủng vi khuẩn kỵ khí, được phân lập từ một hịn đảo tại vùng biển phía đơng của
Hàn Quốc. Khuẩn lạc trên đĩa thạch GS có hình trịn, lồi, màu trắng đục, hơi bóng, có
rìa răng cưa, kích thước từ 1,5 đến 3,0 mm, không tiết sắc tố ra môi trường; tế bào bắt
màu Gram dương, hình que, kích thước (0,52 0,67) ì (1,21 1,82) àm.
Phõn tớch so sỏnh trình gen 16S rRNA cho thấy rằng chủng vi khuẩn có thể
thuộc chi Virgibacillus với độ tương đồng gen 16S rRNA với các chủng chuẩn của các
loài trong chi này từ 93,4 – 96,6 %. Dựa trên dữ liệu về kiểu hình và phát sinh chủng
loại thì chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis được xem là một loài mới của chi
Virgibacillus (Lee và cs, 2012).
Chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis là loài vi khuẩn có khả năng di
chuyển, phát triển được trong điều kiện nhiệt độ 15 – 400C, pH là 6.0 – 9.0 và nồng độ
NaCl là 2 – 20%, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37 °C, ở pH 7.0 - 8.0 và nồng độ NaCl là
2 – 5% (w/v) (Lee và cs, 2012).

12



Chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis có MK-7 là menaquinone chiếm ưu
thế và peptidoglycan vách tế bào dựa trên axit meso-diaminopimelic. Các axit béo
chính là anteiso-C (15:0) và anteiso-C (17:0) và lipit phân cực chính là
diphosphatidylglycerol, phosphatidylglycerol và hai loại phospholipid không xác
định. Hàm lượng DNA G + C là 39,5 mol. Sự khác biệt về kiểu gen và đặc điểm kiểu
hình khác biệt của chủng vi khuẩn đã chứng minh rằng chủng này có thể được phân
biệt với các lồi được công nhận của chi Virgibacillus ( Lee và cs, 2012).
2.4. Tổng quan về chất mang
2.4.1. Khái niệm của chất mang vi sinh vật
Chất mang được dùng là các hợp chất vô cơ (bột photphorit, bột apatit, bột
xương, bột vỏ sò…) hay các chất hữu cơ (than bùn, bã nấm, phế thải nông nghiệp, rác
thải...). Chất mang được ủ yếm khí hoặc hiếu khí nhằm tiêu diệt một phần vi sinh vật
tạp và trứng sâu bọ, bay hơi các hợp chất dễ bay hơi và phân giải phần nhỏ các chất
hữu cơ khó tan (Chu Thị Thơm và cs, 2006).
2.4.2. Đặc điểm của chất mang vi sinh vật
Chất mang có các đặc điểm sau: Khả năng hút nước cao 150-200%, hàm lượng
carbon hữu cơ cao tốt nhất > 60%, không chứa các chất độc hại đối với vi sinh vật
tuyển chọn, hàm lượng muối khống khơng vượt q 1%, kích thước hạt phù hợp với
đối tượng sử dụng (Chu Thị Thơm và cộng sự, 2006).
2.4.3. Các loại chất mang
2.4.3.1. Chất mang celite
Celite 545 được mô tả theo Khare and Makajma (2000):
Celite 545 là một loại bột có màu trắng được xử lý bằng natri cacbonat, rửa
acid, nung chảy từ đất tảo cát, pH tối thiểu 8.5, độ hòa tan trong nước 0.0037g/l
(20℃), gồm các thành phần sau:
Bảng 2.3. Thành phần của celite
Thành phần
Al2O3
CaO

Fe2O3
Na2O3 + K2O
SiO2

%
1
6.73
0.46
1.88
89
13


Celite bao gồm các hạt tảo cát có độ xốp cao bao gồm silica (SiO2) và một số oxit
vô cơ khác, có thể cho phép các tế bào vi khuẩn bám vào bề mặt. Do tính trơ về mặt
hóa học và cấu trúc lỗ xốp liên kết độc đáo, celite thích hợp cho q trình hấp phụ vật
lý (Chang và cs, 2007).

Hình 2.6. Chất mang celite được chụp qua kính hiển vi
2.4.3.2. Chất mang chitosan
Chitosan được mô tả theo H.M.Ibrahim and E.M.R.El-Zairy (2015):
Chitosan là một chất đồng trùng hợp của amin N-acetyl-D-glucose và
D-glucose amin như trong hình 2.7, một polyme mạch thẳng và bán tinh thể, chitosan
có mức độ acetyl hóa ít nhất 60% dư lượng glucose amin (tương ứng với mức độ khử
âm là 60). Trọng lượng phân tử của nó thường từ 300-1000 kDa tùy thuộc vào nguồn
chitin. Q trình deacetyl hóa chitin được tiến hành bằng cách thủy phân hóa học trong
kiềm hoặc bằng cách thủy phân bằng enzym với sự có mặt của các enzym cụ thể, trong
số đó là chitin deacetylase.
Các nguồn chính của Chitin và Chitosan là: Cơn trùng (ví dụ: lớp biểu bì, Ovipositors
và kén bọ hung), Giáp xác, (ví dụ: vỏ cua và vỏ tơm), Mực ( ví dụ: bút Ommastrephes

và thành dạ dày Loligo), Centric Diatoms (ví dụ: Thalassiosira fluviatilis và Algae) và
Fungi (ví dụ: Mucor rouxi và Aspergillis nidulans).

Hình 2.7. Công thức cấu tạo của chitosan
14


Hình 2.8. Chitosan dạng mảnh

Hình 2.9. Cấu trúc nano của chitosan

Hình 2.10. Chất mang chitosan được chụp qua kính hiển vi
Hệ thống mạng lưới sợi nano có diện tích bề mặt cao, kích thước lỗ chân lơng
nhỏ. Vì có cấu trúc dạng sợi không gian ba chiều và khả năng liên kết với các điện tích
âm ở bề mặt tế bào vi khuẩn nên chitosan được ứng dụng trong cố định tế bào vi
khuẩn.
2.4.3.3. Chất mang pigbone
Pigbone là một sản phẩm phụ của q trình giết mổ gia súc. Thơng thường
xương được tách ra khỏi thịt trong quá trình chế biến. Phần xương này sau đó có thể
được chuyển thành bột xương bằng cách sử dụng những phương pháp khác nhau.
Pigbone có đặc tính cơ học mạnh, cấu trúc dạng xốp và không gây độc hại. Pigbone
15


cấu tạo bao gồm khoảng 60% các chất hữu cơ và 40% các chất vơ cơ. Trong đó thành
phần vơ cơ của nó có nhiều hydroxyapatite (Ca5(PO4)3(OH)) - một chất có tính thích
ứng sinh học cao (Bechtol và cs, 1977). Do có các tính chất trên, nên pigbone được
ứng dụng vào quá trình cố định vi khuẩn.

Hình 2.11. Chất mang pigbone được chụp qua kính hiển vi

2.4.3.4. Chất mang eggshell
Cấu trúc vỏ trứng được mô tả theo Nys Y., Gautron J. (2007):
Từ trong ra ngồi có sáu lớp khác nhau. Nhiều nhất các lớp bên trong là các
màng vỏ. Màng vỏ bên trong (khoảng 20 µm) tiếp xúc trực tiếp với albumin. Màng
ngồi dày khoảng 50 µm và nằm giữa màng trong và phần bị vơi hóa của vỏ. Cả màng
trong và màng ngoài đều được tạo thành từ các sợi hữu cơ nằm song song với bề mặt
trứng và dễ dàng nhìn thấy bằng cách sử dụng điện tử qt kính hiển vi.

Hình 2.12. Cấu trúc vỏ trứng qua mặt cắt ngang

16