HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
--------------۞۞۞--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỖ THỊ THU HÀ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG TÍNH KHÁNG
KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHẤT GÂY
TỔN THƢƠNG OXI HÓA Ở DẠNG KẾT HỢP VỚI
ION KIM LOẠI

Hà Nội – 2021


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
--------------۞۞۞--------------

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ
KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHẤT GÂY TỔN THƢƠNG
OXI HÓA Ở DẠNG KẾT HỢP VỚI ION KIM LOẠI
Họ và tên sinh viên

: Đỗ Thị Thu Hà

MSV

: 620843

Lớp

: K62CNTPB

Khóa

: 62

Giảng viên hƣớng dẫn 1

: PGS.TS. Nguyễn Thị Mai Phƣơng

Giảng viên hƣớng dẫn 2

: GVC.TS. Nguyễn Thị Lâm Đoàn

Địa điểm thực hiện :

: Phịng Sinh Hóa thực vật - Viện Cơng nghệ sinh học - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hà Nội – 2021


THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN THỰC HIỆN KHĨA LUẬN

1. Họ và tên sinh viên

: Đỗ Thị Thu Hà


MSV

: 620843

Số điện thoại

: 0523414491

Email

:

2. Chuyên ngành

: Công nghệ thực phẩm

3. Lớp

: K62CNTPB

4. Khóa

: 62

5. Giảng viên hƣớng dẫn 1

: PGS. TS. Nguyễn Thị Mai Phƣơng

Giảng viên hƣớng dẫn 2
6. Địa điểm thực hiện :


: GVC. TS. Nguyễn Thị Lâm Đồn
: Phịng Sinh Hóa thực vật - Viện Cơng nghệ sinh học
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hà Nội, ngày

tháng

Giảng viên hƣớng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)

Sinh viên thực hiện
(Ký và ghi rõ họ tên)

PGS. TS. Nguyễn Thịn Mai Phƣơng

Đỗ Thị Thu Hà

năm 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong báo cáo khóa luận này
là trung thực và chƣa hề đƣợc sử dụng.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thự hiện khóa luận này đã đƣợc
cảm ơn và các thơng tin đƣợc trích dẫn trong khóa luận này đều đƣợc ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày


tháng

năm 2021

Sinh viên thực hiện

Đỗ Thị Thu Hà

i


LỜI CẢM ƠN
Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Mai Phƣơng,
Phịng Sinh hóa thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam và GVC.TS. Nguyễn Thị Lâm Đồn, khoa Cơng nghệ thực phẩm, Học
viện Nơng nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất cũng nhƣ đã hƣớng dẫn
tận tình cho em trong suốt thời gian qua.
Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới các các thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ
thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và các thầy, cô, anh, chị của Viện công
nghệ Sinh học đã tạo các điều kiện để em có thể hồn thành đề tài khóa luận của mình.
Cuối cùng, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, các anh, chị và
bạn bè đã đồng hành với em trong cả thời gian tiến hành đề tài khóa luận cùng tồn bộ
thời gian học tập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2021


Sinh viên thực hiện

Đỗ Thị Thu Hà

ii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh

Chữ viết đầy đủ tiếng Việt

CKK

Chất kháng khuẩn

CKN

Chất kháng nấm
Nồng độ ức chế tối thiểu

MIC

Minimal inhibitory concentration

H2O2

Peroxit hydro


E. coli

Escherichia coli

ROS

Reactive oxygen species

8HQ

8-Hydroxyquinoline

IC50

The half maximal inhibitory

Nồng độ ức chế 50% sự phát

concentration

triển

Các gốc tự do

S. mutans

Streptococcus mutans

S. aureus


Staphylococcus aureus

C. albicans

Candida albicans

T. rubrum

Trichophyton rubrum

WHO

World Health Organization

Tổ chức y tế thế giới

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng khuếch đại gene

ITS

Internal transcribed spacer

iii



MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. 1
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iii
MỤC LỤC ....................................................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ vii
PHẦN I : PHẦN MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích và yêu cầu ................................................................................................. 2
PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4
2.1. Chất kháng khuẩn ..................................................................................................... 4
2.2. Chất kháng nấm ........................................................................................................ 5
2.3. Các chất gây tổn thƣơng oxi hóa .............................................................................. 6
2.3.1. Tác động của ROS lên ADN ................................................................................. 7
2.3.2. Tác động của các ROS lên protein ........................................................................ 7
2.3.3. Tác động của các ROS lên lipid ............................................................................ 8
2.4. Một số ứng dụng của các chất kháng khuẩn ............................................................. 9
2.4.1. Ứng dụng trong cơng nghệ đóng gói thực phẩm ................................................... 9
2.4.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh nhiễm trùng ........................................................... 10
2.5. Peroxit hydro (H2O2) .............................................................................................. 11
2.6. 8-Hydroxyquinoline (8HQ) .................................................................................... 12
2.7. Vi khuẩn Streptococcus mutans.............................................................................. 14
2.8. Bệnh nấm da ........................................................................................................... 15
2.8.1. Tổng quan về bệnh nấm da ở ngƣời .................................................................... 15
2.8.2. Nấm Trichophyton rubrum .................................................................................. 16
PHẦN III : VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 18
3.1. Nguyên liệu, thiết bị và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 18
3.1.1. Nguyên liệu .......................................................................................................... 18
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................ 19

3.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................... 19
iv


3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 20
3.3.1. Đánh giá tác dụng diệt khuẩn Streptococcus mutans .......................................... 20
3.3.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ...................................... 20
3.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cơng thức lựa chọn trên đĩa thạch .............. 21
3.3.4. Phƣơng pháp phân lập và định danh nấm ........................................................... 21
PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 26
4.1. Đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn mơ hình Streptoccocus mutans của H2O2 dạng
đơn lẻ và của H2O2 phối hợp với các ion kim loại .......................................................... 26
4.2. Đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn mô hình Streptoccocus mutans của 8HQ dạng
đơn lẻ và của 8HQ phối hợp với các ion kim loại .......................................................... 28
4.3. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của H2O2 và 8HQ khi kết hợp với ion kim loại
trên một số chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) ........................................................ 30
4.3.1. Xác định giá trị MIC của các thành phần công thức ........................................... 30
4.3.2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn và nấm Candida albicans sử dụng các công
thức kháng khuẩn tiềm năng ................................................................................... 32
4.4. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của H2O2 và 8HQ khi kết hợp với ion kim loại
trên nấm gây bệnh ngoài da ngƣời Trichophyton rubrum .............................................. 33
4.4.1. Phân lập nấm gây bệnh ngoài da Trichophyton rubrum trên bệnh nhân ............. 33
4.4.2. Định danh chủng Trichophyton sp phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp giải trình
tự vùng vùng ITS1-4 của rDNA ..................................................................................... 35
4.4.2.1. Kết quả thu nhận DNA từ sinh khối nấm Trichophyton................................... 35
4.4.2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại................................................................... 37
4.4.2.5. Đánh giá hoạt tính kháng nấm Trichophyton rubrum sử dụng tổ hợp chứa
chất gây tổn thƣơng oxi hóa với các ion kim loại Fe 2+, Cu2+, Zn2+ .............................. 38
PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 40
5.1. Kết luận ................................................................................................................... 40

5.2. Kiến nghị................................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 41
Tài liệu tiếng Việt ........................................................................................................... 41
Tài liệu tiếng Anh ........................................................................................................... 41

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 2.1: Các dạng oxi phản ứng

7

Bảng 3.1: Công thức pha môi trƣờng nuôi cấy

18

Bảng 4.1: Tác dụng gây chết tế bào vi khuẩn S. mutans ở dạng huyền dịch
và biofilm của H2O2 kết hợp với các ion kim loại có khả năng

27

chuyển tiếp
Bảng 4.2: Tác dụng tăng cƣờng gây chết vi khuẩn S. mutans ở dạng huyền
dịch và biofilm của 8HQ kết hợp với các ion kim loại có khả


29

năng chuyển tiếp và H2O2.
Bảng 4.3: Các tổ hợp cơng thức đánh giá hoạt tính tăng cƣờng tổn thƣơng
oxi hóa

30

Bảng 4.4: Giá trị MIC của các thành phần công thức

31

Bảng 4.5: Tác dụng kháng khuẩn của các công thức kháng khuẩn tiềm năng

32

Bảng 4.6: So sánh trình tự nucleotide vùng gene ITS1-4 của chủng nấm
Derma 001 VN với các trình tự tham khảo bằng phân mềm Blast
Viewer 1.20.0

vi

37


DANH MỤC HÌNH
Hình

Trang


Hình 2.1: Một số ví dụ về các chất kháng khuẩn

4

Hình 2.2: Cấu trúc của một số chất kháng nấm phổ biến hiện nay

6

Hình 2.3: Một số cơ chế gây tổn thƣơng lên tế bào thông qua cảm ứng tạo
ROS

8

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của H2O2

11

Hình 2.5: Cơng thức cấu tạo của quinoline và 8HQ

13

Hình 2.6: Vi khuẩn Streptococcus mutans

14

Hình 2.7: Một số bệnh do nấm thƣờng gặp

16

Hình 2.8: Mẫu nấm T. rubrum trên đĩa thạch mặt trƣớc (a) và sợi khuẩn ti

(b)
Hình 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ H2O2 đến khả năng tiêu diệt vi khuẩn
S.mutans
Hình 4.2: 8HQ gây chết vi khuẩn S. mutans ở dạng huyền dịch.
Hình 4.3: Mơ da nhiễm nấm Derma 001 VN (A) và hình ảnh sợi nấm
Derma 001 VN trên đĩa thạch SDA sau 7 ngày ni cấy (B)

17

26
28
34

Hình 4.4: Kết quả phân lập lƣu giữ chủng Derma 001 VN.

34

Hình 4.5: Mẫu ADN tổng số tách từ nấm Derma 001 VN đã phân lập.

35

Hình 4.6: Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch trƣớc khi đọc trình tự ADN

36

Hình 4.7: Trình tự nucleotit vùng gen ITS1-4 của chủng nấm Trychophyton
sp
Hình 4.8: Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm Trichophyton rubrum

36

37

Hình 4.9: Tác dụng kháng nấm T. rubrum phân lập tự bệnh nhân da liễu
Việt Nam của tổ hợp các chất có khả năng tăng cƣờng tổn
thƣơng oxi hóa.

vii

39


PHẦN I : PHẦN MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sử dụng chất kháng khuẩn hay kháng nấm trong điều trị bệnh, làm chất khử
trùng hay bảo quản thực phẩm đƣợc xem là một trong những biện pháp hiệu quả. Các
chất này có thể kháng lại vi sinh vật gây bệnh bằng cách tiêu diệt hoặc làm giảm hoạt
động trao đổi chất của chúng. Các chất có phân tử nhỏ thƣờng đƣợc sử dụng nhiều trong
xử lý lĩnh vực này. Trong số này, kháng sinh trên thực tế đã mang lại những kết quả lớn
trong điều trị các bệnh liên quan đến vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, do tính kháng kháng
sinh hiện nay đang ngày càng gia tăng, trở thành một vấn đề cần phải giải quyết trên
toàn thế giới nên việc sử dụng chúng là vấn đề cần đƣợc xem xét hết sức cẩn trọng. Vi
khuẩn Gram (-) có khả năng kháng kháng sinh cao hơn vi khuẩn Gram (+) vì có cấu trúc
màng ngồi khá đặc biệt. Màng ngồi của vi khuẩn Gram (-) thƣờng bị che bởi một lớp
chất nhày gây khó khăn cho việc tiếp xúc của chất kháng khuẩn với tác nhân đích. Vì
thế, việc tìm kiếm các chất kháng khuẩn hiệu quả vi khuẩn Gram (-) cũng rất đƣợc quan
tâm. Do đó, các chiến lƣợc trị liệu kháng khuẩn thay thế kháng sinh, kháng vi khuẩn
Gram (-) hiệu quả đã và đang đƣợc thực hiện rộng rãi (Ullah & Ali. 2017).
Vai trò kháng khuẩn của peroxit hydro (H2O2) đã đƣợc khẳng định. Dung dịch
3% của chất này đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là chất khử trùng và kháng khuẩn. H2O2 là
gốc oxi hoạt động nên đƣợc xếp vào nhóm các chất có khả năng gây tổn thƣơng oxi hoá.

H2O2 là chất oxi hoá khá mạnh và có thể tƣơng tác với nhiều thành phần khác nhau của
tế bào. Các phản ứng này bao gồm sự peroxy hoá lipit màng và sự hydroxyl hoá các
protein và ADN. Các nghiên cứu trƣớc đây của Imlay & cs cho thấy H2O2 ở nồng độ
thấp cũng có thể gây tổn thƣơng ADN, tạo ra đột biến và gây chết vi khuẩn E. coli. Một
trong những cơ chế kháng khuẩn của H2O2 là việc giải phóng ra O2 sau khi bị các
enzyme là catalase phân huỷ. Vì O2 là độc cho các cơ thể kỵ khí nên sự có mặt của O2 là
bất lợi cho chúng. Hiệu quả kháng khuẩn của H2O2 tăng lên khi có mặt của các ion kim
loại dù ở nồng độ rất thấp nhƣ là Fe2+ và Cu+. Các chất này thúc đẩy sự phân huỷ H2O2

1


thành gốc hydroxyl (OH) thông qua phản ứng Fenton. Hiệu quả của việc kết hợp giữa
H2O2 và Fe2+ là làm tăng sự phân huỷ H2O2 cùng với sự hình thành các gốc tự do (ROS).
Nồng độ sử dụng và thời gian tiếp xúc với chất này là những yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu
quả tác dụng của nó (Imlay. 2003).
8-Hydroxyquinolin (8HQ) từ lâu đã đƣợc sử dụng nhƣ là một chất tạo phức càng
cua với các ion kim loại và có tác dụng ức chế mạnh hàng loạt các quá trình sinh hố
khác nhau. Các dẫn xuất của hợp chất này đã đƣợc sử dụng để để xử lý vi khuẩn và
nấm. Một số tác giả cho rằng khả năng gây độc cao của 8HQ là nhờ khả năng tạo phức
càng cua với các ion kim loại dẫn đến sự ức chế hàng loạt các q trình sinh hố của vi
khuẩn/nấm. Các kết quả nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh chất này có khả năng sinh
gốc O2- và đã phát hiện thấy 8HQ có tác dụng gây chết mạnh đối với vi khuẩn
Streptoccocus mutans trên mảng bám răng (Nguyễn Thị Mai Phƣơng & cs. 2004).
Cho đến nay, việc đánh giá tác dụng của các chất này ở dạng kết hợp với ion kim
loại chuyển đổi nhƣ Fe2+ hay Cu2+ trên các đối tƣợng vi khuẩn và nấm khác nhau nhằm
mục đích ứng dụng cịn rất hạn chế. Vì thế, khóa luận này đã chọn vấn đề “Đánh giá
tác dụng tăng tính kháng khuẩn/kháng nấm của các chất gây tổn thương oxi hóa ở
dạng kết hợp với ion kim loại” với mục đích tìm hiểu khả năng tăng cƣờng tác dụng
kháng nấm và kháng khuẩn của các chất này khi kết hợp với các ion kim loại để định

hƣớng ứng dụng trong thực tế làm chất diệt khuẩn hay kháng nấm.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Đánh giá đƣợc tác dụng tăng tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất H2O2 và
8HQ ở dạng kết hợp với ion kim loại có khả năng chuyển đổi.
1.2.2. Yêu cầu
- Đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn mơ hình Streptoccocus mutans của H2O2 dạng
đơn lẻ và của H2O2 phối hợp với các ion kim loại
- Đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn mơ hình Streptoccocus mutans của 8HQ dạng
đơn lẻ và của 8HQ phối hợp với các ion kim loại

2


- Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của H2O2 và 8HQ khi kết hợp với ion kim loại trên
một số chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+)
- Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của H2O2 và 8HQ khi kết hợp với ion kim loại trên
nấm gây bệnh ngoài da ở ngƣời Trichophyton rubrum

3


PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Chất kháng khuẩn
Nhiễm trùng là nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến bệnh tật và gây chết ở ngƣời.
Kể từ khi đƣợc phát hiện, các chất kháng khuẩn (CKK) đóng vai trị sống còn trong việc xử
lý và chống lại bệnh tật liên quan đến nhiễm trùng. Các CKK đƣợc xem là một phân nhóm
của chất kháng sinh. CKK là một tác nhân gây cản trở sự sinh sản và phát triển của vi
khuẩn. Nó thƣờng đƣợc sử dụng để khử trùng bề mặt và loại bỏ vi khuẩn có khả năng gây
hại, và có thể tìm thấy chúng trong các sản phẩm nhƣ xà phịng, chất tẩy rửa, các sản phẩm

chăm sóc da và sức khỏe và chất tẩy rửa gia dụng. Hiện nay chúng đƣợc sắp xếp thành 5
loại chủ yếu, có vai trị quan trọng khác nhau theo các tiêu chí:
i)

Theo cơ chế họat động;

ii)

Theo nguồn thu nhận;

iii)

Theo phổ hoạt động;

iv)

Theo cấu trúc hóa học;

v)

Theo chức năng (nhƣ ức chế sinh tổng hợp thành tế bào; ức chế chức năng
màng, ức chế sinh tổng hợp axit nucleic và ức chế sinh tổng hợp protein).

Trong số này, các nhóm CKK phân loại dựa trên cấu trúc hóa học và chức năng đƣợc
xem là quan trọng nhất. Hình 2.1 đƣa ra một số ví dụ về chất kháng khuẩn

Hình 2.1: Một số ví dụ về các chất kháng khuẩn (Ullah & Ali. 2017).

4



2.2. Chất kháng nấm
Chất kháng nấm là chất có khả năng gây chết hoặc ức chế sựu phát triển của nấm.
Hình 2.2 thể hiện cấu trúc của một số chất kháng nấm phổ biến hiện nay. Các chất này
đƣợc xếp vào 3 nhóm chính dựa trên cơ chế hoạt động là :
i) Azoles là các chất có khả năng ức chế sự sinh tổng hợp ergosterol (một chất
sterol chính do nấm sinh tổng hợp); Azoles là một nhóm các hợp chất dị vịng chứa
vịng 5 carbon có chứa một ngun tử nitơ và ít nhất một nguyên tử phi cacbon khác
nhƣ một phần của vòng. Azoles ức chế chuyển đổi lanosterol thành ergosterol bằng cách
ức chế lanosterol 14α-demethylase.
ii) Polyenes là các chất có khả năng tƣơng tác hóa học với sterol trên màng nấm.
Chúng là các phân tử có nhiều liên kết đôi liên hợp. Thuốc kháng nấm polyene là
polyene vịng lớn có vùng hydroxyl hóa trên vịng đối diện với hệ thống liên hợp. Điều
này làm cho polyene kháng nấm amphiphilic. Polyene liên kết với sterol trong màng tế
bào nấm, chủ yếu là ergosterol. Điều này làm thay đổi nhiệt độ chuyển tiếp (Tg) của
màng tế bào, do đó đặt màng ở trạng thái ít lỏng hơn, nhiều tinh thể hơn. Trong những
trƣờng hợp bình thƣờng, sterol trong màng làm tăng độ chặt của lớp kép phospholipid
làm cho màng sinh chất dày đặc hơn. Kết quả là, sinh chất bên trong của tế bào bao gồm
các ion đơn hóa trị (K +, Na +, H + và Cl−) và các phân tử hữu cơ nhỏ bị rò rỉ, dẫn đến
tế bào chết. Tế bào động vật chứa cholesterol thay vì ergosterol nên chúng ít nhạy cảm
hơn nhiều. Tuy nhiên, ở liều điều trị, một số amphotericin B có thể liên kết với
cholesterol ở màng động vật, làm tăng nguy cơ gây độc cho ngƣời. Amphotericin B gây
độc cho thận khi tiêm tĩnh mạch. Khi chuỗi kỵ nƣớc của polyene đƣợc rút ngắn, hoạt
tính liên kết sterol của nó đƣợc tăng lên. Do đó, việc giảm hơn nữa chuỗi kỵ nƣớc có thể
dẫn đến việc nó liên kết với cholesterol, làm cho nó trở nên độc đối với động vật.
iii) 5-fluorocytosine là các chất có khả năng ức chế sự sinh tổng hợp của các loại đại
phân tử [29]. Nó đƣợc sử dụng đặc biệt để kêt hợp cùng với amphotericin B cho các
trƣờng hợp nhiễm nấm Candida nghiêm trọng và bệnh cryptococcosis. Nó có thể đƣợc
sử dụng một mình hoặc kết hợp với các thuốc chống nấm khác cho bệnh nhiễm sắc tố.


5


Hình 2.2: Cấu trúc của một số chất kháng nấm phổ biến hiện nay
(Thomas Albrecht & cs. 1996)

2.3. Các chất gây tổn thƣơng oxi hóa
Trong số các CKK, các chất có khả năng gây tổn thƣơng oxi hóa gần đây đƣợc
quan tâm nhiều vì có hoạt tính kháng khuẩn cao. Các chất này có thể tƣơng tác để sinh
ra các gốc oxi hoạt động (ROS) và đây là nguyên nhân gây ra những tổn thƣơng oxi hoá
trong tế bào (Thomas & Pera. 1983, Storz & Imlay. 1999). Các ROS có thể gây tổn
thƣơng tế bào thông qua các tác động bao gồm các tác động lên AND, protein và lipid tế
bào.

6


Bảng 2.1. Các dạng oxi phản ứng
(Storz & Imlay. 1999)

Dạng ROS

Cấu tạo

Ký hiệu hoá học

O  O

O2


Oxi đơn trị

O O:

O2

Superoxide

O O:

O2-

Perhydroxyl

O O: H

HO2

H : O O : H

H2 O2

Oxi triplet (trạng thái cơ bản)

Peroxit hydro
Hydroxyl
Nƣớc

H : O
H :O : H


HO
H2 O

2.3.1. Tác động của ROS lên ADN
Các nghiên cứu cho thấy cả H2O2 và O2 đều không thể gây ra sự đứt gãy các
ADN sợi đơn trong điều kiện sinh lý của tế bào. Tác dụng gây tổn thƣơng của chúng với
ADN trong cơ thể sống chủ yếu là do kết quả của phản ứng Fenton với sự xúc tác của
ion kim loại để hình thành gốc •OH. Gốc này có thể tấn cơng và gây ra những biến đổi ở
bất kỳ gốc bazơ nào. Gốc hydroxyl cũng tấn công vào các phân tử đƣờng pentose của
acid nucleic. Vị trí cacbon 4’ là điểm yếu nhất mà ở đó gốc •OH có thể tách ra một
nguyên tử H, dẫn đến làm thay đổi cấu trúc không gian nguyên tử ở vị trí cacbon 3’và
hệ quả là liên kết phosphodiester với nucleotit liền kề bị đứt gãy. Ngoài ra, sự tấn cơng
của gốc hydroxyl cịn có thể gây ra sự liên kết chéo giữa ADN với protein. Mặc dù dạng
này ít gặp nhƣng lại rất nguy hiểm vì hệ thống enzyme sửa chữa không thể nhận ra
những sai hỏng này (Oleinick & cs. 1986).
2.3.2. Tác động của các ROS lên protein
Sự tấn công protein của ROS đƣợc khởi đầu bằng việc gốc •OH tách một nguyên
tử -H của một acid amin trên chuỗi polypeptit để tạo ra gốc hữu cơ. Gốc hữu cơ nhanh
chóng phản ứng với oxi để tạo ra gốc trung gian alkylperoxy, dạng này nhanh chóng
chuyển thành alkylperoxide và tiếp theo là thành gốc alkoxyl. Gốc alkoxyl có thể bị

7


biến đổi thành một hydroxyl protein. Các phản ứng alkylperoxy -> alkylperoxide ->
alkoxyl đƣợc xúc tác bởi




HO 2 , một dạng superoxide đã nhận thêm proton, hay đƣợc

xúc tác bởi Fe2+. Các gốc trung gian (alkylperoxy, alkylperoxide và alkoxyl) còn có thể
phản ứng với các acid amin khác trong cùng một phân tử protein hoặc với các acid amin
của phân tử protein khác để hình thành nên các gốc hữu cơ mới. Các gốc mới đƣợc tạo
ra lại tham gia vào các phản ứng tƣơng tự (Cabiscol & cs. 2000).
2.3.3. Tác động của các ROS lên lipid
Phản ứng của các gốc oxi phản ứng với các acid béo không no khác nhau (cịn
đƣợc gọi là các phản ứng peroxy hố) là không giống nhau mà tuỳ thuộc vào số lƣợng
và vị trí của các nối đơi trên chuỗi acyl. Q trình peroxy hố lipit bao gồm ba bƣớc
riêng biệt : khởi đầu, nhân lên và kết thúc (Kappus. 1985). Bƣớc khởi đầu là phản ứng
xảy ra giữa acid béo không no với gốc hydroxyl, trong đó một nguyên tử H bị tách ra từ
gốc methylvinyl. Ở bƣớc tiếp theo, nhân lên, phân tử oxi có thể gắn vào cacbon tạo ra
gốc peroxy. Gốc peroxy này lại tách một nguyên tử H từ một phân tử acid béo khác
hình thành nên hydroperoxide (ROOH) của lipit và một gốc hữu cơ (R•). Gốc R• tham
gia vào một chuỗi phản ứng mới cịn hydroperoxide khơng bền. Khi có mặt Fe2+ hoặc
các kim loại khác, chất này dễ dàng tham gia vào phản ứng Fenton tạo ra các gốc
alkoxy hoạt hố (RO•). Nhƣ vậy, gốc hydroxyl có tác dụng châm ngịi cho các phản ứng
oxi hố acid béo và khi có mặt Fe2+ thì các phản ứng này diễn ra nhanh và mạnh hơn
nhiều. Các phản ứng của q trình peroxy hố sẽ kết thúc khi các gốc cacbon hoặc
peroxy liên kết chéo với nhau tạo thành sản phẩm khơng cịn điện tử tự do nữa.

Hình 2.3: Một số cơ chế gây tổn thƣơng lên tế bào thông qua cảm ứng tạo ROS
(Damian & cs. 2012).

8


2.4. Một số ứng dụng của các chất kháng khuẩn
2.4.1. Ứng dụng trong cơng nghệ đóng gói thực phẩm

Bao bì đóng gói có một vai trị rất quan trọng trong việc kéo dài thời hạn sử dụng
của nguyên liệu thực phẩm (Patel & cs. 2016). Chế biến và đóng gói vơ trùng (APP)
hiện đang có tầm quan trọng lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm để cung cấp các
sản phẩm thực phẩm an toàn với thời hạn sử dụng kéo dài (ESL) và giảm nhu cầu làm
lạnh. APP là một phƣơng pháp trong đó thực phẩm lỏng đã đƣợc tiệt trùng trƣớc đƣợc
đóng gói và niêm phong trong thùng chứa đã đƣợc khử trùng trƣớc để giữ sản phẩm
trong thời gian dài ở điều kiện mơi trƣờng bình thƣờng. Cơng nghệ này rất hữu ích cho
các nƣớc ơn đới, nơi không phổ biến việc làm lạnh nhƣ một phƣơng tiện để bảo quản
thực phẩm. Ví dụ quan trọng nhất về thực phẩm đƣợc chế biến và đóng gói vơ trùng là
sữa chế biến ở nhiệt độ cực cao (UHT) trải qua quá trình tiệt trùng trong thời gian ngắn
ở nhiệt độ cực cao và niêm phong nhanh chóng vào các thùng chứa đã đƣợc khử trùng
trƣớc (Ansari. 2017, Malhotra & cs. 2015).
Trực khuẩn hình thành bào tử nhƣ hiện diện trên bề mặt thiết bị và vật liệu đóng
gói gây hƣ hỏng các sản phẩm thực phẩm đƣợc đóng gói vơ trùng do đó, việc khử
nhiễm vật liệu đóng gói là cần thiết để ngăn ngừa hƣ hỏng. Tiệt trùng vật liệu đóng gói
thực phẩm là điều kiện tiên quyết để sản xuất thành cơng các sản phẩm đƣợc đóng gói
vơ trùng và nó đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng các phƣơng pháp hóa học và vật lý
khác nhau đƣợc sử dụng trong việc đóng gói vơ trùng các sản phẩm vô trùng. Các chất
khử trùng phổ biến nhất đƣợc sử dụng cho các ứng dụng đóng gói vơ trùng trên toàn thế
giới là hydrogen peroxide (H2O2), bức xạ gamma, khơng khí nóng/hơi nƣớc, đèn UV.
Trong số các chất khử trùng này, H2O2 là chất khử trùng phổ biến nhất trên tồn thế giới
để khử trùng vật liệu đóng gói vì nó khơng để lại dƣ lƣợng độc hại trong thực phẩm
(Smith & Brown. 1980). Theo báo cáo, dấu vết của lƣợng H2O2 còn lại trong thực
phẩm nhỏ hơn 0,25 ppm khơng có bất kỳ tác hại nào khi tiêu thụ. Các dung dịch đậm
đặc của H2O2 ở nhiệt độ cao (60 - 80ºC) thƣờng đƣợc sử dụng để tăng hoạt tính diệt
khuẩn.

9



Nói chung, bào tử vi khuẩn có khả năng chống lại H2O2 mạnh hơn so với tế bào
sinh dƣỡng, và bào tử là mục tiêu chính trong q trình khử trùng bằng H 2O2. Hệ thống
chiết rót vơ trùng thành công đầu tiên của công ty Tetra Pak năm 1961 đã sử dụng sự
kết hợp của H2O2 và nhiệt để khử trùng bề mặt của vật liệu chứa (Burton. 1988). Khử
trùng bằng H2O2 sau đó bằng khơng khí nóng sau đó đã đƣợc sử dụng thƣơng mại làm
chất khử trùng trong dây chuyền cho vật liệu đóng gói (Sung & cs. 2013).
2.4.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh nhiễm trùng
Ngày nay, thuốc kháng khuẩn là loại thuốc mang lại lợi nhuận cao thứ ba cho các
công ty dƣợc phẩm, chỉ sau thuốc điều trị hệ thần kinh trung ƣơng và tim mạch. Thị
trƣờng thuốc kháng khuẩn là từ 26 tỷ đến 45 tỷ đô la mỗi năm (Li & cs. 2020). Liệu
pháp kháng sinh/kháng khuẩn vẫn là nền tảng để điều trị nhiễm trùng. Nhiều nghiên cứu
đã chứng minh rằng liệu pháp kháng sinh ban đầu không đầy đủ hoặc điều trị chậm trễ
có liên quan đến sự gia tăng rõ rệt tỷ lệ tử vong do mọi nguyên nhân và liên quan đến
nhiễm trùng ở những bệnh nhân nhập viện cấp cứu với tình trạng nhiễm trùng đe dọa
tính mạng.
Các CKK/CKN có thể kháng lại vi sinh vật gây bệnh bằng cách tiêu diệt hoặc làm
giảm hoạt động trao đổi chất của chúng. Vi khuẩn Gram (-) có khả năng kháng
CKK/kháng sinh cao hơn vi khuẩn Gram (+) vì có cấu trúc màng ngồi khá đặc biệt.
Màng ngồi của vi khuẩn Gram (-) thƣờng bị che bởi một lớp chất nhày gây khó khăn
cho việc tiếp xúc của chất kháng khuẩn với tác nhân đích.
Số lƣợng các CKK/CKN hữu hiệu hiện có ngày càng hạn chế do sự xuất hiện của
các vi khuẩn gây bệnh Gram (-) và Gram (+) đa kháng thuốc. Một trong những hậu quả
của nhiễm trùng kháng thuốc là tăng khả năng điều trị ban đầu không phù hợp. Li & cs
(2020) nhận thấy rằng liệu pháp kháng sinh ban đầu không hiệu quả là yếu tố tiên lƣợng
xấu trong bệnh viêm phổi mắc phải tại cộng đồng.
Sử dụng CKK hay CKN trong điều trị bệnh có thể giúp khắc phục đƣợc các vấn
đề hạn chế của các kháng sinh nêu trên do tính hiệu quả và đa dạng trong cấu trúc của
chúng. Vì thế, việc tìm kiếm các CKK/CKN hiệu quả, có thể thay thế kháng sinh, và có
thể kháng vi khuẩn Gram (-) hiệu quả đã và vẫn đang đƣợc quan tâm.
10



2.5. Peroxit hydro (H2O2)
Peroxit hydro hay hydrogen peroxide (H2O2) là chất oxi hố khá mạnh và có thể
tƣơng tác với nhiều thành phần khác nhau của tế bào. Các phản ứng này bao gồm sự
peroxy hoá lipit màng và sự hydroxyl hố các protein và ADN. H2O2 đƣợc xếp vào
nhóm các CKK có khả năng gây tổn thƣơng oxi hố. Các nghiên cứu trƣớc đây của
Imlay & cs (2003) cho thấy H2O2 ở nồng độ thấp cũng có thể gây tổn thƣơng đến ADN,
tạo ra đột biến và gây chết vi khuẩn E. coli. Vai trò kháng khuẩn của H2O2 đã đƣợc
khẳng định. Dung dịch 3% chất này đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là chất khử trùng và
kháng khuẩn thƣờng đƣợc gọi là oxi già (Marchall & cs. 1995). Nghiên cứu của Symons
& cs (2001) cho thấy H2O2 có thể tiêu diệt cả các tế bào ung thƣ. Việc đƣa H2O2 vào
khối u đang đƣợc xem là phƣơng pháp hữu hiệu và có nhiều triển vọng diệt tế bào ung
thƣ hơn so với các phƣơng pháp trị liệu cổ truyền.

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của H2O2
Một trong những cơ chế kháng khuẩn của H2O2 là việc giải phóng ra O2 sau khi bị
các enzyme bảo vệ nhƣ là catalase phân huỷ. Vì O2 là độc cho các cơ thể kỵ khí nên sự
có mặt của O2 là bất lợi cho chúng. Hiệu quả kháng khuẩn của H2O2 tăng lên khi có mặt
của các ion kim loại dù ở nồng độ rất thấp nhƣ là Fe2+ và Cu1+ (Henle & Linn. 1997).
Các chất này thúc đẩy sự phân huỷ H2O2 thành gốc hydroxyl (OH) thông qua phản ứng
Fenton:
Fe3+ + OH + H2O

Fe 2+ + H2O2 + H+

11


Hiệu quả của việc kết hợp giữa H2O2 và Fe2+ là làm tăng sự phân huỷ H2O2 cùng

với
sự hình thành ROS nhƣ đã thấy ở phản ứng trên. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng là
O2 và H2O.
2H2O2 + muối-Fe

2H2O + O2

H2O2 cũng có thể tƣơng tác với muối -Cu1+ để tạo ra nhiều sản phẩm OH trung
gian hơn cả với Fe2+. Các phản ứng chuyển hoá H2O2 thành H2O và O2 diễn ra tƣơng
đối nhanh khi có mặt của O2. Nồng độ sử dụng và thời gian tiếp xúc với chất này là
những yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả tác dụng của nó.
Bản thân hệ thống bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật cũng tạo
ra ROS trong đó có H2O2. Cùng với H2O2, O2- cũng đƣợc các tế bào ung thƣ hay các đại
thực bào tiết ra để bảo vệ chúng. O2- có thể phản ứng với H2O2 tạo thành OH, một ROS
có khả năng gây tổn thƣơng oxi hố mạnh lên chính các tế bào này. Tuy nhiên, các tế
bào đã trang bị cho mình những hệ thống bảo vệ hiệu quả để thốt khỏi ảnh hƣởng của
ROS. Ví dụ khi sâu răng, hệ thống peroxidase của nƣớc bọt có tác dụng làm mất tính
độc của H2O2 (Marshall & cs, 1995). Peroxidase cũng có mặt trong các tế bào huyết
tƣơng để ngăn cản tổn thƣơng do ROS gây ra khi chúng xâm nhập vào hệ thống tuần
hoàn. Bên trong tế bào, H2O2 đƣợc chuyển hoá thành H2O và O2 nhờ enzyme
glutathione peroxidase hay catalase.
2.6. 8-Hydroxyquinoline (8HQ)
8-Hydroxyquinoline (8HQ) là một trong những chất kháng khuẩn lâu đời nhất với
công dụng khử trùng đƣợc ghi nhận từ năm 1895 và công dụng chống nhiễm trùng ở
ngƣời có từ trƣớc thời đại của thuốc kháng sinh hiện đại (Srisung, 2013). 8HQ là một
CKK tổng hợp thuộc nhóm alcaloid có tên là quinoline (Hình 2.5). Đây là nhóm hợp
chất thứ cấp dị vịng, có chứa nitơ, phổ biến rộng rãi ở thực vật. 8HQ đƣợc tạo thành
nhờ việc gắn thêm một nhóm OH vào vị trí C8 trong vịng benzen của quinoline. Chất
này đƣợc biết đến nhƣ là tác nhân tạo phức càng cua (chelator) với các ion kim loại.


12


Trong trƣờng hợp này, nhóm OH đóng vai trị nhƣ một acid khi bị phân ly thành –O-.
Ion kim loại sẽ liên kết với gốc -O- này và cặp điện tử tự do còn lại của ion kim loại sẽ
liên kết với nguyên tử nitơ trong vòng benzen. Mặt khác, nhóm OH đƣợc thêm vào này
cũng dễ dàng chuyển một điện tử sang các tác nhân oxi hoá nhƣ clorua sắt, kali
fericianua hay H2O2 để hình thành gốc tự do có tính hoạt động cao là mesomeric
phenolate (-O-). Do tính chất này mà 8HQ là một trong số ít dẫn xuất của quinoline biểu
hiện khả năng kháng khuẩn cao.

Quinoline
N

8-Hydroxyquinoline
N
OH

N
O-

Hình 2.5: Công thức cấu tạo của quinoline và 8HQ
(Shen & cs. 1999)

8HQ khi kết hợp với các ion kim loại ở dạng phức càng cua có đặc tính kháng
khuẩn rất mạnh, kháng lại nhiều loại vi khuẩn gây bệnh ở nồng độ cực thấp (Shah & cs.
2018). Tác dụng của việc tạo phức càng cua của 1,10-Ophenanthroline (một chất có tác
dụng tƣơng tự 8HQ) có tác dụng ngăn cản sự bẻ gãy sợi ADN đơn do Fe2+ bị loại bỏ bởi
các chất tạo phức nên không thể tham gia vào phản ứng Fenton tạo gốc OH. Nhƣng mặt
khác, việc tạo phức của 1,10-Ophenanthroline cũng gây ra những tác động nguy hiểm

đến tế bào. Tổ hợp này có khả năng cắt đứt liên kết của chuỗi poly (dA-dT), làm phân
huỷ ADN, gây tổn thƣơng các bazơ và ức chế sự phiên mã (Almeida & cs. 1999) còn
phát hiện thấy khả năng gây chết vi khuẩn E. coli cao của phức càng cua của 1,10Ophenanthroline khi kết hợp với H2O2 và cho rằng chất này có thể đóng vai trị nhƣ chất

13


vận chuyển Fe2+ đến gần ADN, ở đó Fe2+ sẽ tác dụng với H2O2 để tạo gốc OH, gây tổn
thƣơng ADN. Ở E. coli, tác dụng gây chết vi khuẩn của 1,10-Ophenanthroline đƣợc gia
tăng khi kết hợp chất này với các ion kim loại có khả năng chuyển đổi.
Bên cạnh đó, Shen & cs (1999) phát hiện thấy 8HQ có tác dụng ức chế các
enzyme sinh tổng hợp ARN trong nấm men, làm thay đổi các thành phần màng tế bào,
trong đó có các thành phần polysaccharide, vì vậy làm tăng độ nhạy của màng tế bào
với các tác nhân kháng khuẩn. Tác dụng kháng khuẩn của 8HQ chỉ do khả năng tạo
phức càng cua của nó hay cịn có những cơ chế nào khác cùng tham gia là câu hỏi vẫn
chƣa đƣợc giải đáp.

2.7. Vi khuẩn Streptococcus mutans
S. mutans lần đầu tiên đƣợc mô tả năm 1924, sau khi phân lập từ vùng răng tổn
thƣơng. Nhƣng phải đến thập kỷ 60 của thế kỷ hai mƣơi, vi khuẩn này mới đƣợc chú ý
khi các nhà khoa học tập trung nghiên cứu bệnh sâu răng từ giai đoạn sớm [28].

Hình 2.6: Vi khuẩn Streptococcus mutans
S. mutans là vi khuẩn Gram (+), hiếu khí và tồn tại ở dạng liên cầu khuẩn. Nhiều
nghiên cứu đã khẳng định S. mutans là nguyên nhân chính của bệnh sâu răng do vi
khuẩn này ln đƣợc phát hiện trong nƣớc bọt, mảng bám răng của ngƣời và có số
lƣợng rất cao ở những vùng răng bị sâu. Đặc trƣng gây sâu răng của S. mutans chính là
khả năng sinh axit mạnh và chịu axit tốt của vi khuẩn này, cho nên trong mơi trƣờng có
đƣờng, S. mutans tạo ra axit làm tan men răng dẫn đến sâu răng. Về mặt trao đổi chất thì
14



S. mutans đƣợc xếp vào nhóm vi khuẩn sinh axit lactic do chúng có khả năng lên men
lactic. S. mutans có thể sử dụng các loại đƣờng làm nguồn cacbon và tạo ra sản phẩm là
axit lactic, đồng thời chúng cịn có khả năng chống chịu đƣợc pH rất thấp của mơi
trƣờng. Hơn nữa S. mutans cũng có các đặc điểm để chống chịu các stress về oxy hóa,
để tồn tại và phát triển. Các vi khuẩn đƣờng miệng sinh axit lactic thiếu các
cytochrome, các protein chứa nhân hem và enzyme catalase nhƣng vẫn có thể sinh
trƣởng trong mơi trƣờng có chứa các gốc oxy tự do vì chúng có hệ thống các enzyme
bảo vệ nhƣ NADH oxidase, superoxide dismutase... (Higuchi 1992. 1999). Ngồi ra,
trình tự genome của chủng vi khuẩn S. mutans cũng đã đƣợc cơng bố. Vì thế, vi khuẩn
này là đối tƣợng và đƣợc xem nhƣ chủng vi khuẩn mơ hình của nhiều nghiên cứu về sâu
răng trên thế giới (Nguyễn Thị Mai Phƣơng. 2005)
2.8. Bệnh nấm da
2.8.1. Tổng quan về bệnh nấm da ở ngƣời
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khảo sát về sự xuất hiện của bệnh nấm da, có
đến 20% ngƣời trên thế giới bị các bệnh nấm về da (Marques & cs. 2000). Bệnh nấm da
bao gồm một nhóm các nấm gây bênh chun biệt trên các mơ sừng hóa (da, móng, tóc)
của ngƣời và động vật, gây nên các bệnh nấm da liễu. Có 40 lồi đã biết và 10 lồi
thƣờng gây bệnh đƣợc tìm thấy. Về mặt phân loại, nấm bệnh da chủ yếu thuộc 3 chi
chính : Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton (Emmons & cs. 1977, Gurgel &
cs. 2005). Tác nhân chính gây bệnh nấm da là do chi Trichophyton tiếp theo là
Epidermophyton và Microsporum. Trong số các nấm gây bệnh, Trichophyton rubrum là
nguyên nhân gây ra 69,5% các ca nhiễm trùng da (Chen & Friedlander. 2001, Coloe &
Baird. 2010).

15