HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
CHỌN LỌC DÒNG BC3F1 TRIỂN VỌNG MANG QTL9 LIÊN QUAN ĐẾN
CẤU TRÚC BÔNG LÚA, NĂNG SUẤT CAO, CHẤT LƢỢNG TỐT

Sinh viên thực hiện
Họ và tên: Trần Đặng Việt Dũng
Lớp: K63CNSHA
Mã sinh viên: 637018
Giáo viên hƣớng dẫn
TS. Khổng Ngân Giang
Ths. Tống Văn Hải

HÀ NỘI – 2022
1


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi và nhóm tác giả. Các
kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và
chưa từng được sử dụng để bảo vệ bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được
cảm ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Tác giả luận văn

Trần Đặng Việt Dũng

2


LỜI CÁM ƠN
Tôi xin trân trọng cảm ơn: Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, Khoa Công
nghệ sinh học, Bộ môn Sinh học phân tử, Phịng thí nghiện trọng điểm Cơng nghệ
tế bào thực vật, Phịng thí nghiệm liên kết Việt Pháp (LMI RICE 2) – Viện Di
truyền Nông nghiệp, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn tốt
nghiệp.
Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Khổng Ngân Giang và
Ths. Tống Văn Hải đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong
quá trình học tập, nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn.
Tơi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị đang làm việc tại
Phịng thí nghiệm Việt Pháp LMI RICE 2. Đặc biệt là chị Lê Thị Như và các anh
chị khác trong nhóm “Cấu trúc bơng lúa” đã chỉ dẫn tơi từ những bước đi đầu tiên
cho đến những bước cuối cùng để tơi có thể hồn thành tốt bài luận văn.
Hồn thành luận văn cịn có sự động viên khuyến khích giúp đỡ của bạn bè
và thành viên trong gia đình của tơi. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm q báu
là nguồn động lực lớn giúp tơi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên

Trần Đặng Việt Dũng

3


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................2

LỜI CÁM ƠN ...........................................................................................................3
MỤC LỤC .................................................................................................................4
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................7
DANH MỤC HÌNH..................................................................................................8
PHẦN 1: MỞ ĐẦU ..................................................................................................9
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................9
1.2. Mục đích và yêu cầu .....................................................................................10
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................11
2.1. Giới thiệu về cây lúa .....................................................................................11
2.2. Giới thiệu về QTL9 .......................................................................................15
2.3. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại (MABC) ................18
2.4. Chỉ thị phân tử CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) ...........19
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......21
3.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................21
3.2. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................24
3.3. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................25
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................30
4.1. Chọn lọc cây lai BC2F1, BC3F1 mang QTL9 bằng chỉ thị phân tử CAPS ....30
4


4.2. Phân tích cấu trúc bơng lúa và một số tính trạng nơng học liên quan đến
năng suất của các dịng BC3F1 ............................................................................39
4.3. Đánh giá một số tính trạng liên quan đến chất lượng gạo của các dòng
BC3F1....................................................................................................................50
4.4. Chọn lọc các vật liệu tiềm năng mang QTL9 có hình thái và chất lượng
tương đương giống mẹ .........................................................................................54
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................56
5.1. Kết luận .........................................................................................................56
5.2. Kiến nghị .......................................................................................................56

PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................57

5


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ đầy đủ và nghĩa tiếng Việt

Từ viết tắt
QTL
GWAS

Quantitative Trait Loci ( Tính trạng số lượng)
Genome Wide Association Study ( Phương pháp phân tích
liên kết tồn hệ gen)

CAPS

Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (Đa hình đoạn
cắt giới hạn)

SNP

Single Nucleotide Polymorphic (Đa hình đơn Nucleotide)

Cs

Cộng sự

ADN


Axit Deoxyribonucleic

Bp

Base pair

NGS

Next generation sequencing (Giải trình tự thế hệ mới)

MABC

Marker-assisted backcrossing (Chọn giống bằng chỉ thị
phân tử kết hợp lai trở lại)

CTPT

Chỉ thị phân tử

PCR

Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase

NPT5

New plant type 5

QK10


Quý Khôi 10

BC3F1

Backcross ở thế hệ thứ 3 với con lai F1

6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu ..................................................21
Bảng 3.2. Chỉ thị phân tử CAPS và enzyme cắt giới hạn tương ứng ......................23
Bảng 3.3. Thang điểm đánh giá độ hoá hồ (IRRI, 2013).........................................28
Bảng 3.4. Thang điểm đánh giá độ bền gel (IRRI, 2013) ........................................30
Bảng 4.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch ADN bằng máy Nanodrop

31

Bảng 4.2. Tổng hợp các cặp lai và con lai BC2F1 ....................................................37
Bảng 4.3. Một số đặc điểm hình thái của các dòng BC3F1 ......................................40
Bảng 4.4. Kết quả đánh giá một số tính trạng có liên quan đến cấu trúc bơng của
các dịng BC3F1 và hai gống bố mẹ..........................................................................43
Bảng 4.5. Kết quả đánh giá một số tính trạng có liên quan đến năng suất của các
dòng BC3F1 và hai giống bố mẹ ...............................................................................47
Bảng 4.6. Kết quả đánh giá một số tính trạng liên quan đến chất lượng của các
dịng lai BC3F1 và hai giống bố mẹ BT7, NPT5 ......................................................51
Bảng 4.7. Danh sách 15 dòng BC3F1 tiềm năng được chọn lọc...............................55

7



DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cấu trúc bơng lúa (A) và sự thay đổi qua q trình thuần hóa (B) ...........12
Hình 2. Các giai đoạn hình thành bơng lúa non quan sát dưới kình hiển vi ...........13
Hình 3 . Phân tích GWAS tính trạng số hạt/bơng (SpN) và số gié thứ cấp/bơng
(SBN) của tập đồn lúa bản địa Việt Nam. .............................................................16
Hình 4. Quá trình thực hiện CAPS ..........................................................................21
Hình 5. Hình minh họa băng DNA của 3 CTPT CAPS trên gel agarose ................24
Hình 6. Hình ảnh bơng lúa của hai giống bố mẹ BT7, NPT5 và hai dịng lai BC3F1
..................................................................................................................................27
Hình 7. Chuẩn bị vật liệu cho các thí nghiệm đánh giá chất lượng hạt gạo của các
dịng BC3F1...............................................................................................................27
Hình 8. Hình ảnh dịng chảy gel của các dịng BC3F1 .............................................30
Hình 9. Thí nghiệm đánh giá mùi thơm của gạo của các dòng BC3F1 ....................31
Hình 10. Kết quả điện di ADN tổng số của một số dịng đánh giá .........................35
Hình 11. Kết quả kiểm tra một số cây BC2F1 (BT7KBL x NB01) bằng chỉ thị phân
tử CAPS ...................................................................................................................36
Hình 12. Kết quả kiểm tra một số cây BC2F1 (BT7 x QK10) bằng chỉ thị phân tử
CAPS ........................................................................................................................37
Hình 13. Kết quả kiểm tra một số cây BC3F1 (BT7 x NPT5) bằng chỉ thị phân tử
CAPS ........................................................................................................................38

8


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan trọng nhất
đối với hơn một nửa dân số thế giới. Do quá trình đơ thị hóa nhanh chóng, diện
tích đất để trồng lúa đang giảm nghiêm trọng, do đó, tăng năng suất lúa gạo trên

một đơn vị diện tích đất là cách duy nhất để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng
tăng trên toàn cầu. Các chuyên gia dự báo rằng sẽ cần thêm khoảng 70% thực
phẩm sơ cấp vào năm 2050. Năng suất lúa được xác định bởi bốn thành phần
chính, bao gồm số bơng trên một đơn vị diện tích, số hạt trên bơng, tỷ lệ hạt chắc
và trọng lượng hạt. Về mặt lý thuyết, việc cải thiện năng suất hạt gạo có thể đạt
được bằng cách tăng một thành phần năng suất đơn lẻ hoặc bất kỳ sự kết hợp nào
của cả bốn.
Cùng với sự phát triển của cơng nghệ giải trình tự thế hệ mới, bộ gen của
hàng trăm giống lúa đã được giải trình tự hồn toàn hoặc một phần, tạo điều kiện
thuận lợi cho sự phát triển của chỉ thị phân tử và xác định các locus tính trạng số
lượng (QTLs) (Chen và cs., 2014; Xu và cs., 2011). Trong những thập kỷ qua,
nhiều QTL lúa năng suất cao đã được xác định (Miura và cs., 2011; Wing và cs.,
2018; Xing và Zhang, 2010), chẳng hạn như GN1a (Ashikari và cs., 2005), GhD7 (
Xue và cs., 2008), SPIKE (Fujita và cs., 2013) và TGW6 (Ishimaru và cs., 2013).
Gần đây, phương pháp phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS, Genome-Wide
Association Study) ra đời đã trở thành một công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu sự đa
dạng của quần thể và phát hiện thêm nhiều loci quan trọng, đặc biệt là các loci liên
kết với các tính trạng nơng học phức tạp như tính trạng năng suất. Nhóm «Cấu
trúc bơng lúa», Viện Di truyền nơng nghiệp đã nghiên cứu GWAS các tính trạng
9


liên quan đến năng suất trên tập đoàn lúa địa phương Việt Nam và đã xác định
được một QTL (Quantitative Trait Loci) mới đặt tên là QTL9 liên kết với cả 2 tính
trạng số gié thứ cấp/bơng và số hạt/bơng (Ta và cs., 2018). Chức năng của QTL9
sau đó đã được khẳng định thơng qua phân tích các quần thể lai tái tổ hợp từ cặp
lai bố mẹ thuộc 2 haplotype đối lập về cấu trúc bông (bông nhỏ và bông to)
(Khong và cs., 2021), các chỉ thị phân tử CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic
Sequences) cũng được phát triển để phân biệt các giống lúa mang QTL9 ở 2
haplotype tương phản (Pham và cs., 2020), từ đó mở ra cơ hội nghiên cứu ứng

dụng QTL9 trong các chương trình chọn tạo giống lúa cao sản.
Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu tiềm năng “Nghiên cứu khai thác QTL9
liên quan đến cấu trúc bông để cải thiện năng suất của một số giống lúa chất
lượng” do Bộ Nông nghiệp và phát triển nơng thơn tài trợ, nhóm nghiên cứu của
Khổng Ngân Giang đã tiến hành lai thành công cặp lai BC3F1 (giữa các giống chất
lượng thuộc haplotype 1 (cây mẹ) và các giống năng suất cao thuộc haplotype 2
(cây bố) và chọn lọc con lai bằng chỉ thị phân tử CAPS. Nhằm mục đích chọn lọc
và đánh giá các dịng BC3F1 triển vọng để tiếp tục phát triển thành quần thể BC3F2
và hướng đến chọn tạo giống mới, chúng tôi tiến hành đề tài “Chọn lọc dòng
BC3F1 triển vọng mang QTL9 liên quan đến cấu trúc bông lúa, năng suất cao,
chất lượng tốt”
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Chọn được 1-2 dịng BC3F1 triển vọng mang QTL9 có năng suất cao hơn
10-15% so với cây mẹ, chất lượng gần tương đương với cây mẹ.
1.2.2. Yêu cầu
- Chọn lọc được 50 dòng BC3F1 mang QTL9 bằng chỉ thị phân tử CAPS
- Chọn lọc được 3-5 dịng BC3F1 triển vọng có cấu trúc bông to hơn so với cây mẹ.
10


- Chọn lọc được 1-2 dịng BC3F1BC3F1 có năng suất cao hơn 10-15% so với cây
mẹ, chất lượng gần tương đương với cây mẹ.
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây lúa
2.1.1. Nguồn gốc của cây lúa
Theo công bố của Chang và cs. (1984), O. sativa xuất hiện đầu tiên ở dãy
Himalaya, Miến Điện, Lào, Việt Nam và Trung Quốc. Từ các trung tâm trên lúa
Indica phát tán đến lưu vực sơng Hồng Hà và sơng Dương Tử rồi sang Nhật Bản,
Triều Tiên và từ đó biến thành chủng Japonica. Lúa được hình thành ở Indonesia

và là sản phẩm của quá trình chọn lọc từ Indica.
Ở Việt Nam, theo kết quả khảo sát nguồn gen cây lúa những năm gần đây
tìm thấy các lồi lúa dại mọc nhiều ở vùng Tây Bắc, Nam Trung bộ, đồng bằng
sông Cửu Long, Tây Nguyên là các loài O. granulata, O. nivara, O. ridleyi, O.
rufipogon. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng có thể là cái nơi hình
thành cây lúa nước. Từ lâu, cây lúa đã trở thành cây lương thực chủ yếu có ý nghĩa
quan trọng trong nền kinh tế và xã hội của nước ta. Lúa trồng hiện nay có nguồn
gốc từ lúa dại. Việc xác định trực tiếp tổ tiên của cây lúa trồng ở Châu Á (Oryza
sativa) vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau.
2.1.2. Cấu trúc bơng lúa, tính trạng quan trọng quyết định năng suất lúa
Cấu trúc bơng lúa là một trong những tính trạng hình thái quan trọng quyết
định tiềm năng năng suất, được chọn lọc qua q trình thuần hóa. Bơng lúa có cấu
trúc dạng nhánh, bao gồm một trục chính, các gié sơ cấp mọc ra từ trục chính, sau
đó là các gié bậc cao hơn (gié thứ cấp, gié tam cấp, gié tứ cấp) và cuối cùng là hoa
mọc trực tiếp từ các gié, số lượng hoa quyết định số lượng hạt trên bơng (Hình
1.A). Q trình phân nhánh của bông lúa phụ thuộc vào hoạt động của các tế bào
11


mơ phân sinh chồi nách trong suốt giai đoạn hình thành và phát triển sớm của
bông. Cấu trúc bông lúa rất đa dạng, khơng chỉ trong cùng lồi (giữa giống thuần
chủng và giống hoang dại) mà cịn giữa các lồi khác nhau (lúa châu Á và lúa châu
Phi). Cấu trúc bơng lúa ở các lồi thuần chủng thay đổi từ dạng nhỏ, chỉ có một vài
gié sơ cấp và gié thứ cấp, mang ít hạt đến dạng bơng to, phân nhánh nhiều và mang
hạt hơn với lồi tổ tiên (Hình 1.B).

Hình 1. Cấu trúc bơng lúa (A) và sự thay đổi qua q trình thuần hóa (B)
(Yoshida và cs., 2011)
Bơng lúa là kết quả của quá trình hoạt động của mơ phân sinh, chúng được
hình thành và biệt hóa liên tục trong quá trình phát triển của cây. Sự hình thành

bông lúa non được chia thành 2 giai đoạn: Giai đoạn sớm là sự hình thành và kéo
dài của mơ phân sinh trục (Hình 2.A), hình thành các mơ phân sinh gié sơ cấp
(Hình 2.B), kéo dài các mơ phân sinh gié sơ cấp, hình thành các mơ phân sinh gié
cấp cao hơn (Hình 2.C). Giai đoạn muộn là sự hình thành mơ phân sinh hoa (Hình
2.D), sự biệt hóa tạo thành các bộ phận của hoa và sự phát triển của chúng cũng
được quan sát ở giai đoạn này (Hình 2.E).
12


Hình 2. Các giai đoạn hình thành bơng lúa non quan sát dƣới kình hiển vi (Ta
và cs., 2017)
A: Giai đoạn phát sinh mơ phân sinh trục bơng, B: Hình thành và kéo dài mô phân
sinh gié sơ cấp, C: Kéo dài gié sơ cấp và hình thành gié thứ cấp, D: Hình thành
hoa, E: Sự biệt hóa các cơ quan sinh sản của hoa. RM: mô phân sinh trục, PBm:
mô phân sinh gié sơ cấp, AM: mô phân sinh gié thứ cấp, PB: gié sơ cấp, Sp:
spinkelet (cụm hoa), Fl: hoa.
2.1.3. Yếu tố cấu thành năng suất của cây lúa
Năng suất lúa là 1 tính trạng số lượng phức tạp được tạo thành bởi các yếu
tố: số bông/đơn vị diện tích, số hạt/bơng, tỷ lệ hạt chắc/bơng và khối lượng 1000
hạt.
Số bơng trên một đơn vị diện tích: hình thành bởi 3 yếu tố: số nhánh hữu
hiệu, điều kiện ngoại cảnh và biện pháp kỹ thuật (mật độ cấy, tưới nước, bón
phân...). Theo Nguyễn Hữu Tề và cs. (1997), để khai thác số nhánh đẻ tối đa, tăng
số bông trên đơn vị diện tích cần có biện pháp kỹ thuật tốt tác động vào giai đoạn
đẻ nhánh và sinh trưởng thân lá. Các giống lúa thấp cây, lá đứng khỏe, chịu đạm có
thể cấy dày để tăng số bơng trên đơn vị diện tích. Số bơng có thể đóng góp 74%
năng suất, trong khi đó số hạt và khối lượng hạt đóng góp 26%. Các giống lúa mới
thấp cây, lá đứng, đẻ khỏe, chịu đạm có thể gieo cấy dày để tăng số bông trên đơn
13



vị diện tích. Trên ruộng lúa cấy, số bơng/m2 phụ thuộc nhiều vào năng lực đẻ
nhánh, chỉ tiêu này xác định chủ yếu vào khoảng 10 ngày sau khi đẻ nhánh tối đa.
Ở ruộng lúa gieo thẳng số bông/m2 phụ thuộc nhiều vào lượng hạt gieo và tỷ lệ
mọc mầm.
Số hạt trên bơng: Số hạt trên bơng nhiều hay ít tuỳ thuộc vào số gié, số hoa
phân hoá, số hoa thối hố. Tồn bộ q trình này nằm trong thời kỳ sinh trưởng
sinh thực (từ làm đòng đến trỗ). Điều kiện nhiệt độ và cường độ ánh sáng quá thấp
ở giai đoạn này sẽ làm tăng số hạt lép và làm giảm năng suất hạt. Tổng số hạt trên
bông do tổng số hoa phân hoá và số hoa thoái hoá quyết định. Số hoa phân hoá
càng nhiều, số hoa thoái hố càng ít thì tổng số hạt trên bơng sẽ nhiều. Tỷ lệ hoa
phân hố có liên quan chặt chẽ với chế độ chăm sóc. Số gié cấp 1, đặc biệt là số gié
cấp 2 nhiều thì số hoa trên bông cũng nhiều. Số hoa trên bông nhiều là điều kiện
cần thiết để đảm bảo cho tổng số hạt trên bông lớn.
Tỷ lệ hạt chắc trên bông: Được quyết định ở thời kỳ sau trỗ, nếu gặp điều
kiện bất thuận ở thời kỳ này tỷ lệ hạt lép sẽ rất cao. Tỷ lệ hạt chắc có ảnh hưởng
đến năng suất lúa rõ rệt, ngồi ra tỷ lệ hạt chắc cịn phụ thuộc vào lượng tinh bột
được tích luỹ trên cây và đặc điểm giải phẫu của cây. Theo Nguyễn văn Hoan
(2006), trước khi trỗ bông, nếu cây lúa sinh trưởng tốt, quang hợp thuận lợi thì
hàm lượng tinh bột được tích luỹ và vận chuyển lên hạt nhiều, làm cho tỷ lệ hạt
chắc cao. Mạch dẫn vận chuyển tốt thì q trình vận chuyển tinh bột tích
luỹ trong cây đến hạt được tốt làm tỷ lệ hạt chắc sẽ cao. Tỷ lệ hạt chắc cịn chịu
ảnh hưởng của q trình quang hợp sau khi trỗ bông. Sau khi trỗ bông, quang hợp
ảnh hưởng trực tiếp đến q trình tích luỹ tinh bột trong phôi nhũ; ở giai đoạn này,
nếu điều kiện khí hậu khơng thuận lợi cho q trình quang hợp thì tỷ lệ hạt chắc
giảm rõ rệt.
Khối lượng 1.000 hạt: yếu tố này biến động không nhiều do điều kiện dinh
dưỡng và ngoại cảnh mà chủ yếu phụ thuộc vào yếu tố giống. Khối lượng 1.000
14



hạt được cấu thành bởi 2 yếu tố: khối lượng vỏ trấu (thường chiếm khoảng 20%)
và khối lượng hạt gạo (thường chiếm khoảng 80%). Vì vậy muốn khối lượng hạt
gạo cao, phải tác động vào cả 2 yếu tố này. Khối lượng nghìn hạt được xác định
phần lớn do kích thước hạt, được quy định bởi ba yếu tố: Chiều dài, chiều rộng và
độ dày. Để tăng khối lượng hạt, trước lúc trỗ bơng, cần bón ni địng để làm tăng
kích thước vỏ trấu. Sau khi trỗ bơng cần tạo điều kiện cho cây sinh trưởng tốt để
quang hợp được tiến hành mạnh mẽ, tích lũy được nhiều tinh bột, khối lượng hạt sẽ
cao.
2.2. Giới thiệu về QTL9
Cùng với sự phát triển của cơng nghệ giải trình tự thế hệ mới, phương pháp
nghiên cứu liên kết trên toàn hệ gen (Genome Wide Association Study-GWAS) ra
đời đã trở thành công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu đa dạng tự nhiên và xác định các
locus quan trọng, đặc biệt là đối với các tính trạng nơng học phức tạp như tính
trạng năng suất (Huang và cs., 2010; Zhao và cs., 2011). Nguyên tắc cơ bản của
GWAS là đánh giá mối tương quan giữa mỗi chỉ thị di truyền với tính trạng quan
tâm trong một quần thể cùng loài. GWAS cung cấp cái nhìn sâu sắc về đặc tính di
truyền của các tính trạng trên, cho phép lựa chọn các cặp bố mẹ tốt nhất để phân
tích QTL, cũng như các gen tiềm năng quy định tính trạng quan tâm. Tại Việt
Nam, từ năm 2014-2017, nhóm nghiên cứu “Cấu trúc bơng lúa” thuộc phịng Thí
nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nơng nghiệp đã
tiến hành phân tích GWAS tính trạng năng suất, đặc biệt là cấu trúc bơng trên tập
đoàn gồm 159 giống lúa bản địa của Việt Nam nhằm xác định đa dạng hình thái và
di truyền của cấu trúc bông. Kết quả đã xác định được 29 QTL tiềm năng liên quan
đến cấu trúc bông, trong đó đáng chú ý là QTL9 liên kết với cả hai tính trạng số gié
thứ cấp/bơng và số hoa/bơng (Ta và cs., 2018). Đây là một QTL hoàn toàn mới,
hơn 130 gen tìm thấy trong vùng QTL9 nhưng chưa có gen nào được nghiên cứu
15



chức năng. Phân tích GWAS cũng chỉ ra được các nhóm giống khác nhau cùng
mang 1 QTL nhưng khác nhau về một vài allen (SNPs) trong vùng QTL đó và có
cấu trúc bơng tương phản (gọi là các haplotype).

Hình 3 . Phân tích GWAS tính trạng số hạt/bơng (SpN) và số gié thứ cấp/bơng
(SBN) của tập đồn lúa bản địa Việt Nam. Từ trên xuống dƣới QQ plot,
Manhattan plot của 12 NST cho 2 tính trạng số hạt/bơng (SpN), số gié thứ
cấp/bông (SBN) và liên kết mất cân bằng (Linkage Disequilibrium (LD)
heatmap) xung quanh vùng QTL9 (Ta và cs., 2018)
Do QTL9 là một QTL hoàn toàn mới, chưa từng được cơng bố trước đây.
Mặt khác, kết quả phân tích GWAS dựa trên các mơ hình phân tích thống kê, các
QTLs thu được từ phương pháp này vẫn cần phải đánh giá trong quần thể con lai
trước khi được ứng dụng vào các chương trình lai tạo giống mới. Vì vậy, từ năm
2017-2020, nghiên cứu sinh Phạm Thị Mai đã thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu
chức năng của QTL9 liên quan đến cấu trúc bông phục vụ công tác chọn tạo giống
lúa năng suất cao ở Việt Nam” để đánh giá sự đóng góp của QTL9 đến cấu trúc
bơng, đặc biệt là số gié thứ cấp/bông (SBN) và số hạt/bông (SpN). Hai giống lúa
16


G6 và G189 nằm trong tập đoàn nghiên cứu GWAS thuộc hai Haplotype khác
nhau cùng mang QTL9 nhưng khác biệt về 9 SNPs trong vùng QTL9 và có cấu
trúc bơng trái ngược nhau (G6, bông nhỏ và G189, bông to) đã được sử dụng làm
bố mẹ để tạo quần thể lai nhằm nghiên cứu chức năng của QTL9. Giống G6
(haplotype 1) được sử dụng làm cây mẹ, G189 (haplotype 2) được sử dụng làm cây
bố. Ứng dụng công nghệ Gene Capture kết hợp với giải trình tự thế hệ mới (Next
generation sequencing - NGS) để phân tích đa dạng di truyền của QTL9 giữa 2
haplotype đã tìm thấy hơn 1000 SNPs trong vùng QTL9. Mười hai chỉ thị CAPS
đã được xây dựng dựa vào các SNPs nằm trong vị trí cắt của các enzyme giới hạn
để phục vụ việc đánh giá kiểu gen của quần thể lai F2 (Juannic và cs., 2019).

Trong đó 3 chỉ thị CAPS (CAPS#1; CAPS#5, CAPS#11) nằm bao phủ vùng QTL9
cho phép phân biệt kiểu gen của QTL9 ở 2 haplotype (QTL9_H1 và QTL9_H2)
dựa vào các đột biến (SNPs) trong vị trí cắt của các enzyme giới hạn tương ứng
SacI, EcoRV và DraI. Phân tích kiểu hình cấu trúc bơng của quần thể F3 đã cho
thấy QTL9 thực sự liên quan đến số gié thứ cấp/bông và số hạt/bông (Khong và
cs., 2021). Và như vậy, QTL9 là một QTL tiềm năng có thể sử dụng trong các
chương trình lai cải tạo năng suất lúa.
Nhằm mục đích nghiên cứu khai thác QTL9 như một công cụ mới cho các
chương trình chọn tạo giống lúa cao sản, TS. Khổng Ngân Giang và các cộng sự đã
tiến hành đánh giá kiểu gen QTL9 và kiểu hình cấu trúc bơng của một bộ vật liệu
giống lúa thương mại năng suất cao, chất lượng tốt. Phân tích bằng các CTPT
CAPS xác định được 12 giống thuộc haplotype 1 (Bắc Thơm 7, Thiên Ưu 8, BC15,
VD3, Hà Phát 3, Bắc Thơm 7 kháng bạc lá 3, Q5, Bắc Thơm 7 kháng bạc lá,
Khang Dân 18, CNC11, Hương Việt 3, ST24) và 5 giống thuộc haplotype 2
(NPT5, ĐH12, NB01, QK10, QK6). Kết hợp với phân tích cấu trúc bơng, 6 giống
lúa chất lượng, cấu trúc bông nhỏ của haplotype 1 (Bắc Thơm 7, Bắc Thơm 7
kháng bạc lá, Hà Phát 3, CNC11, Hương Việt 3, Q5) được chọn làm cây mẹ và 4
17


giống lúa có cấu trúc bơng to thuộc haplotype 2 (NPT5, DDH12, QK10, QK6)
được chọn làm cây bố để lai tạo quần thể F1 (dữ liệu chưa cơng bố). Nhóm tác giả
đã lai tạo thành công một số cặp lai: BT7 x NPT5 (BC3F1), BT7/KBL x NPT5
(BC2F1), BT7/KBL x Q6 (F1)… Cây lai sẽ tiếp tục được chọn lọc bằng chỉ thị
phân tử CAPS, sau đó lai trở lại với cây mẹ để tạo quần thể BC3F1 và BC3F2, từ đó
chọn lọc các dịng triển vọng năng suất cao, chất lượng tốt.
2.3. Chọn giống bằng chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại (MABC)
Trong những năm gần đây, phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết
hợp với lai trở lại (MABC - Marker-assisted backcrossing) được ứng dụng khá phổ
biến tại Việt Nam, trong chọn tạo giống lúa năng suất chất lượng cao, chống chịu

sâu bệnh, hạn, mặn, ngập úng…. Mục đích của MABC là chuyển một hoặc vài
gen/QTL quan tâm từ một nguồn vật liệu di truyền vào các dịng/giống ưu tú để cải
tiến tính trạng mục tiêu. MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc
chuyển locus quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống mới
và đã đạt được những thành công nhất định. Một số thành công của phương pháp
này trong chọn tạo giống lúa tại Việt Nam như tích hợp gen Saltol chịu mặn vào
giống lúa Bắc Thơm 7 bằng việc lai giữa giống FL478 mang gen Saltol chịu mặn
(giống cho gen) với giống BT7 (giống nhận gen), sau đó tiến hành lai trở lại 3 thế
hệ và chọn lọc cây đồng hợp tử gen Saltol ở thế hệ BC3F2 bằng chỉ thị phân tử, từ
đó đánh giá và chọn lọc các dòng triển vọng ở các thế hệ tự thụ tiếp theo. Đến thế
hệ BC3F4 đã chọn được 3 dịng BT7-Saltol có chất lượng tương đương với BT7 đối
chứng và có khả năng chịu mặn.
Đối với các QTL/gen liên quan đến năng suất lúa, nhờ ứng dụng MABC, đã
lai chuyển thành cơng QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt/bơng từ dịng cho
gen (KC25) vào giống nhận gen (Khang dân 18). Sử dụng 61 chỉ thị phân tử SSR ở
thế hệ BC1F1 đã chọn được 32 cá thể trong quần thể BC1F1 mang QTL/gen tăng số
18


hạt trên bơng, trong đó cá thể số 74 mang gen có nền di truyền cao nhất giống cây
nhận gen đạt 83,4% (Nguyễn Thị Thúy Anh và cs., 2017)
2.4. Chỉ thị phân tử CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)
Phần lớn các chỉ thị phân tử sử dụng trong di truyền chọn giống dựa vào kỹ
thuật PCR và sự lặp lại ngẫu nhiên của một số nucleotide trong hệ genome sinh vật
nên tính đặc hiệu khơng cao. Cùng với sự phát triển của cơng nghệ giải trình tự,
nhất là sự ra đời của các cơng nghệ giải trình tự thế hệ mới đã cho phép tiến hành
hàng loạt dự án giải trình tự giống lúa khác nhau trên thế giới. Từ việc phân tích
kết quả giải trình tự, hàng triệu điểm đột biến đa hình đơn nucletotide (SNPs) đã
được phát hiện và được lập bản đồ phục vụ cho các nghiên cứu trên tồn hệ gen.
Một trong những tính ứng dụng thực tiễn của SNP là dùng để xây dựng chỉ thị

CAPS nhằm phục vụ cho việc phân biệt các giống khác nhau. Nguyên tắc của chỉ
thị phân tử CAPS dựa trên sự thay đổi của 1 nucletotide (SNP) trong vị trí cắt của
enzyme giới hạn. Từ đó các mồi sẽ được thiết kế nhằm nhân đoạn ADN chứa SNP,
sau đó chạy phản ứng PCR với mồi CAPS và cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới
hạn thành 2 đoạn có chiều dài khác nhau. Những giống mà vị trí cắt của enzyme
giới hạn khơng bị đột biến thì sản phẩm PCR sẽ bị cắt thành 2 mảnh. Ngược lại đối
với giống mang SNP trong vùng cắt của enzyme giới hạn thì enzym khơng nhận
biết được vị trí cắt đặc thù của nó dẫn đến sản phẩm PCR không bị cắt. Nhờ vào kỹ
thuật điện di trên gel agarose sẽ dễ dàng phân biệt được các giống khác nhau dựa
vào đa hình chiều dài của sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn.
Chỉ thị phân tử CAPS đại diện cho một nhóm chỉ thị đặc hiệu đã được ứng
dụng thành công, đặc biệt là trong lĩnh vực sinh học thực vật. Nguyên tắc của
CAPS rất đơn giản và dựa trên ba bước: (1) PCR với mồi đặc hiệu; (2) cắt sản
phẩm PCR với enzyme giới hạn; và (3) Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose.

19


Thiết kế mồi cho chỉ thị CAPS có thể dựa trên trình tự nucleotide từ các cơ sở dữ
liệu sẵn có hoặc giải trình tự vùng cần khuếch đại.

Hình 4. Quá trình thực hiện CAPS
( />Bước đầu tiên của CAPS thực ra là một PCR thông thường. Ứng dụng
enzyme cắt giới hạn là bước thứ hai và ở đây xác suất đa hình di truyền giữa các
mẫu DNA đóng vai trị trung tâm. Khác biệt di truyền trong DNA chủ yếu ở dạng
đa hình đơn Nucleotide (SNP), hoặc chèn xóa (InDel) (Jehan & Lakhanpaul, 2006;
Khlestkina và Salina, 2006; Hazarika và Shukla, 2014; Jang và cs., 2018). Những
thay đổi di truyền trong các vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn là những điểm
quan trọng để phát triển và ứng dụng của các chỉ thị CAPS. Một đoạn khuếch đại
với một vị trí nhận diện chính xác của một enzyme giới hạn sẽ bị cắt thành hai

phân đoạn bằng enzyme giới hạn. Ngược lại, chỉ có một đoạn duy nhất có thể được
quan sát thấy khi vị trí cắt của enzyme giới hạn đã bị đột biến và thay đổi khiến
cho đoạn khuếch đại không bị cắt.
20


Chỉ thị CAPS có nhiều ưu điểm. Tính di truyền đồng trội của CAPS là ưu
điểm quan trọng giúp phân biệt cá thể đồng hợp tử và dị hợp trong quá trình đánh
giá kiểu gene. Một ưu điểm quan trọng khác của CAPS là thiết bị đơn giản và
tương đối rẻ. Các kết quả của CAPS gồm chỉ một hoặc một vài đoạn DNA sau cắt
bằng enzyme giới hạn là một lợi thế tích cực cho phương pháp này.
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu:
- 177 hạt lai BC3F1 của cặp lai BT7 x NPT5
- 30 hạt lai BC2F1 của mỗi cặp lai BT7KBL x NB01, BT7 x QK10
Bảng 3.1 Các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu
ST
T

1

Kí

Tên

hiệu

mẫu


giống

giống

G6

G189

Viện Di

Giai

truyền

Hưng

Nông

Yên

nghiệp

Nam
Rinh

3

BT7

thu thập


Sớm

Khẩu
2

Nguồn gốc

Viện Di
truyền
Nông
nghiệp

Bắc

Lương Tài,

Thơm 7

Bắc Ninh

Một số đặc điểm mẫu giống thu thập

Nằm trong tập đoàn nghiên cứu GWAS,
thuộc nhóm lúa có cấu trúc bơng nhỏ
mang QTL9_Haplotype 1
Nằm trong tập đồn nghiên cứu GWAS,
thuộc nhóm lúa có cấu trúc bông to mang
QTL9_Haplotye 2
-Thời gian sinh trưởng: vụ xuân130 - 135

ngày, vụ mùa 105 -110 ngày
- Cây cao từ 90-100 cm, đẻ nhánh khá,
21


hạt thon nhỏ, màu vàng sẫm. Phẩm chất
gạo ngon, cơm thơm, mềm
-Thời gian sinh trưởng: vụ Xuân 130-135
ngày, vụ Mùa 105-110 ngày. Chiều cao
cây 115-125 cm, dạng khóm chụm, bộ lá
4

NPT5

NPT5

Do tác giả

đứng màu xanh, đứng lòng mo, đẻ nhánh

cung cấp

khỏe, cứng cây.
-Chất lượng gạo tốt, cơm thơm nhẹ. Năng
suất trung bình 8-9 tấn/ha, thâm canh tốt
có thể đạt 9,5-10 tấn/ha.

5

QK10


QK10

Do tác giả
cung cấp

Dòng triển vọng năng suất cao, hạt nâu

Bắc
6

BT7-

Thơm 7

KBL

kháng

Nam Định

Năng suất, chất lượng tương đương với
BT7, kháng bạc lá

bạc lá
- Thời gian sinh trưởng: vụ xuân muộn
130-135 ngày, vụ mùa sớm 105-107
ngày, chiều cao cây từ 115-118 cm. Bông
to, đẻ nhánh khỏe, chống đổ và chống
7


NB01

NB01

Do tác giả

chịu sâu bệnh, chịu hạn tốt.

cung cấp

- Giống có khả năng kháng bệnh đạo ôn
cao, hạn chế bạc lá và rầy nâu. Khối
lượng 1000 hạt từ 21-22 gram.
- Chất lượng gạo ngon, tương đương với
gạo Bắc thơm 7, cơm mềm và có mùi
22


thơm nhẹ. Năng suất cao trung bình đạt từ
60-75 tạ/ha, thâm canh tốt có thể đạt trên
80 tạ/ha.
* Chỉ thị phân tử CAPS
Ba chỉ thị phân tử CAPS#1, CAPS#5, CAPS#11 được phát triển dựa trên các SNPs
nằm trong vị trí cắt của các enzyme giới hạn SacI (G/A), EcoRV (A/T), DraI (T/A)
trong vùng QTL9 để phân biệt kiểu gen của QTL9 ở 2 haplotype. Dự kiến vệt băng
thu được ở các trạng thái allen khác nhau ở 2 haplotype được minh họa trong hình
dưới đây
Bảng 3.Error! Bookmark not defined.. Chỉ thị phân tử CAPS và enzyme cắt giới
hạn tƣơng ứng

Tên chỉ thị
CAPS 1

CAPS 5

CAPS 11

Trình tự mồi
F: CTCCACCATGAATAACCTGCA
R: CTCCAGCATCTCACCCTCTC
F: GGATTAGCTCCCTACCACGC
R: GGCAGCATCAGCAAGCATAC
F: ATGCATTGAGAGGGACCTTG
R: TGGATTGCATGGTTTAGCTG

23

Enzyme cắt giới hạn
SacI

EcoRV

DraI


Hình 5. Hình minh họa băng DNA của 3 CTPT CAPS trên gel agarose
- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm:
 Dụng cụ: Khay nhựa, tấm xốp, ống falcon loại 15 ml và 50 ml, ống
eppendorf và một số dụng cụ khác.
 Hóa chất: 3 loại enzyme giới hạn: DraI, EcoRV, SacI và các hóa chất phục

vụ tách chiết DNA, PCR...
 Thiết bị thí nghiệm: Máy chạy PCR, máy điện di, máy đo nồng độ, máy ly
tâm, máy nghiền mẫu, bể ổn nhiệt, ...
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Chọn lọc dòng BC3F1 mang QTL9 bằng CTPT CAPS
- Sử dụng 3 chỉ thị phân tử CAPS (CAPS#1, CAPS#5, CAPS#11) đã xác định nằm
trong vùng QTL9 để phân biệt các cây tự thụ và cây dị hợp tử.
- Chọn lọc cặp lai mang gen dị hợp tử.
3.2.2. Đánh giá một số đặc điểm hình thái nơng sinh học, cấu trúc bơng của các
dịng BC3F1
-Phân tích cấu trúc bơng lúa sử dụng phần mềm PTRAP (Tam và cs., 2013)
3.2.3. Đánh giá năng suất, chất lượng của các dòng BC3F1.
24


-Đánh giá một số tính trạng có liên quan đến năng suất:
+Số hạt/bơng
+Khối lượng 1000 hạt
+Số bơng hữu hiệu/khóm
+Tỷ lệ bông hữu hiệu
+Tỷ lệ hạt chắc
-Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng:
+Độ bền gel
+Đánh giá mùi thơm của gạo
+Độ hóa hồ
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Chọn lọc cây lai BC2F1, BC3F1 mang QTL9 bằng chỉ thị phân tử CAPS
Tách chiết DNA: DNA tổng số được tách chiết từ lá lúa 20-25 ngày tuổi theo
phương pháp CTAB của Doyle (1991) có cải tiến. Đo nồng độ và kiểm tra độ tinh
sạch của DNA bằng máy Nanodrop 8000. Kiểm tra chất lượng DNA bằng cách

điện di trên gel Agarose 1% (100 V; 0,5 × TBE, 30 phút), sử dụng thang chuẩn
DNA Gene Ruler 1kb (#SM1163, Fermentas).
Phản ứng PCR với cặp mồi CAPS: phản ứng PCR được thực hiện trong 10 µl,
gồm 20 ng DNA, 0,2 µl dNTPs 10X (#R0182, Fermentas), 0,5 µl mồi CAPS xuôi
và ngược, 0,8 µl MgCl2, 2 µl GoTaq Buffer 10X (#R0971, Fermentas), 0,05 µl
GoTaq DNA polymerase 5 u/µl (#EP0702, Fermentas) và 5,2 µl nước Milli Q khử
trùng. Chu trình nhiệt: 95°C trong 2 phút, 35 chu kỳ (95°C - 30 giây, 57°C - 30
giây, 72°C - 1 phút) và giữ 7 phút ở 72°C. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện
di trên gel agarose 2,5%, rồi được soi trong buồng UV (Uvltec, Cambridge), phần
mềm Fire Reader. Các thí nghiệm điện di sử dụng thang chuẩn DNA Low Gene
Ruler 100 bp (#SM1163, Fermentas).
25