HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------  ----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA
CHỦNG LACTOBACILLUS L18

HÀ NỘI – 2023


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------  ----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA
CHỦNG LACTOBACILLUS L18

Người thực hiện

: NGUYỄN THỊ YẾN

Mã sinh viên

: 646561

Khóa

: 64

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn

: TS. HỒ TÚ CƯỜNG
: PGS.TS. NGUYỄN XUÂN CẢNH

HÀ NỘI – 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
trung thực và chưa từng được bất kì ai cơng bố trong các nghiên cứu nào khác.
Các tài liệu được trích dẫn trong khoá luận đã được nêu trong mục tài liệu
tham khảo.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về những số liệu trong khoá luận này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Yến

i



LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Bộ môn Công nghệ vi sinh, được sự
giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cơ giáo, các cán bộ tại phịng thí nghiệm
Bộ mơn, cùng sự cố gắng và nỗ lực học tập của bản thân, tơi đã hồn thành khóa
luận tốt nghiệp của mình.
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Học viện,
Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng tồn thể các thầy cơ giáo đã giảng
dạy, hướng dẫn và tạo điều kiện để tơi có thể hồn thành khố luận tốt nghiệp.
Tơi xin bày tỏ sự kính trọng và lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS.
Nguyễn Xuân Cảnh và TS. Hồ Tú Cường đã định hướng đề tài và tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt q trình làm khóa luận.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ tại phịng thí nghiệm Bộ
mơn Cơng nghệ vi sinh thầy PGS.TS. Nguyễn Văn Giang, cô Th.S Trần Thị Hồng
Hạnh, cô Th.S Nguyễn Thanh Huyền, cô Th.S Trần Thị Đào và anh, chị nghiên
cứu viên Dương Văn Hoàn, Nguyễn Thị Thu đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tơi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã
động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
đề tài này.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2023

Sinh viên


Nguyễn Thị Yến

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... vii
TĨM TẮT ......................................................................................................... viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu ............................................................................2
1.2.1. Mục đích nghiên cứu .............................................................................................2
1.2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................2

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
2.1. Tổng quan về Lactobacillus spp. ..............................................................................4
2.1.1. Đặc điểm chung của Lactobacillus spp. ................................................................4
2.1.2. Vai trò ....................................................................................................................4
2.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum ...................................................................6
2.2.1. Đặc điểm chung của Lactobacillus fermentum .....................................................6
2.2.2. Vai trò của Lactobacillus fermentum ....................................................................6
2.3. Tổng quan về Lactobacillus fermentum L18 ............................................................8
2.3.1. Đặc điểm sinh học .................................................................................................8
2.3.2. Khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn....................................................................9
2.4. Tổng quan về vi khuẩn kiểm định (VKKĐ) ...........................................................10
2.4.1. Tổng quan về Staphylococcus aureus .................................................................10

2.4.2. Tổng quan về Aeromonas hydrophila .................................................................11
2.5. Một số hợp chất kháng khuẩn được tổng hợp bởi LAB .........................................13
2.5.1. Axit hữu cơ ..........................................................................................................13
2.5.2. Diacetyl ................................................................................................................14
2.5.3. Hydrogen peroxide ..............................................................................................15
2.5.4. Reuterin ...............................................................................................................15

iii


2.5.5. Bacteriocin ...........................................................................................................16
2.6. Tình hình nghiên cứu hợp chất kháng khuẩn từ Lactobacillus ..............................17
2.6.1. Các nghiên cứu trên thế giới................................................................................17
2.6.2. Các nghiên cứu trong nước..................................................................................18

PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 20
3.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................20
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................20
3.1.2. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................20
3.1.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ...............................................................................20
3.1.4. Mơi trường sử dụng trong nghiên cứu .................................................................20
3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................21
3.2.1. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch...............................................................21
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn
Lactobacillus fermentum L18 ........................................................................................21
3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ..................................................................................22
3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl .............................................................................22
3.2.5. Ảnh hưởng của pH...............................................................................................22
3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ ......................................................................................23
3.2.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ......................................................................23

3.2.8. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lạnh ..............................................................23

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 24
4.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn
Lactobacillus fermentum L18 ........................................................................................24
4.1.1. Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau ......................................................24
4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ glucose .........................................................................25
4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .....................................................................................26
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men ................................................................26
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ peptone .........................................................................27
4.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl ................................................................................28
4.4. Ảnh hưởng của pH..................................................................................................29

iv


4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ .........................................................................................30
4.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .........................................................................31
4.7. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lạnh .................................................................33

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 35
5.1. Kết luận...................................................................................................................35
5.2. Kiến nghị ................................................................................................................35

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 36
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 43

v



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Chữ viết tắt
FAO

Food and Agriculture Organization (Tổ chức
Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

MRS

De Man, Rogosa and Sharpe

LAB

Lactic acid bacteria ( Vi khuẩn lactic)

LB

Luria Bertani

µl

Microliter

ml

Milliliter

mm


Millimeter

NB

Nutrient Broth

VKKĐ

Vi khuẩn kiểm định

vi


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Kết quả nhuộm gram (A) và hình thái khuẩn lạc (B) của chủng vi
khuẩn Lactobacillus fermentum L18 .................................................... 9
Hình 4.1. Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau đến khả năng kháng
khuẩn của chủng Lactobacillus fermentum L18 ................................ 24
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến khả năng kháng khuẩn của
chủng Lactobacillus fermentum L18 ................................................. 25
Hình 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng kháng khuẩn
của chủng Lactobacillus fermentum L18 ........................................... 26
Hình 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến khả năng kháng khuẩn của
chủng Lactobacillus fermentum L18 ................................................. 27
Hình 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus fermentum L18............................................................. 28
Hình 4.6. Ảnh hưởng của pH đến khả năng kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus fermentum L18............................................................. 29

Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus fermentum L18............................................................. 31
Hình 4.8. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng kháng khuẩn của
chủng Lactobacillus fermentum L18 ................................................. 32
Hình 4.9. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian bảo quản lạnh đến khả
năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus fermentum L18 ............. 33

vii


TĨM TẮT
Với mục đích tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng
kháng khuẩn của chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum L18 kháng lại 2 chủng
vi khuẩn gây bệnh là Aeromonas hydrophila và Staphylococcus aureus, tôi tiến
hành các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như thành
phần môi trường, điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và thời gian bảo quản
lạnh đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn L. fermentum L18. Kết quả
cho thấy, trong số các nguồn carbon được thử nghiệm, glucose là nguồn carbon
phù hợp nhất để chủng L. fermentum L18 sinh hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính
cao. Trong mơi trường MRS lỏng có bổ sung 3% glucose, thu nhận hoạt tính
kháng khuẩn cao nhất, cho đường kính vịng kháng khuẩn là 15.00 mm đối với
A.hydrophila và 14.67 ± 0.58 mm đối với S.aureus. Đối với nguồn nitơ được thử
nghiệm, hoạt tính kháng khuẩn cao nhất khi nuôi chủng L. fermentum L18 trong
môi trường MRS lỏng bổ sung cao nấm men 1% và peptone 2%. Tuy nhiên, khi
bổ sung NaCl vào môi trường ni cấy chỉ làm giảm hoạt tính kháng khuẩn. Các
yếu tố như pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và thời gian bảo quản có ảnh hưởng
đáng kể đến hoạt tính kháng khuẩn. Sau 2 ngày ni cấy ở điều kiện 30C tại pH
6.5, hoạt tính kháng khuẩn đạt cực đại. Ngồi ra, thời gian bảo quản càng lâu thì
hoạt tính kháng khuẩn càng giảm, với đường kính vịng kháng khuẩn lần lượt là
9.67 ± 0.58 mm và 8.67 ± 0.58 mm đối với A.hydrophila và S. aureus tương ứng

sau 20 ngày bảo quản ở 4C.

viii


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn,
nền nhiệt độ và độ ẩm khơng khí cao là điều kiện hết sức thuận lợi cho vi sinh vật
phát triển trong đó có cả các lồi vi sinh vật gây bệnh. Chúng có thể gây bệnh trên
người, động vật và thực vật, theo ghi nhận hằng năm gây thiệt hại lớn cho các
ngành công nghiệp thực phẩm và sản xuất nông – lâm – ngư nghiệp. Trong công
tác kiểm soát dịch bệnh do vi sinh vật gây ra hiện nay, sử dụng các chất bảo vệ
hóa học là phương pháp điều trị phổ biến, tuy hiệu quả nhanh và tức thời song hệ
lụy của nó để lại là khơng hề nhỏ. Các chất độc hóa học khó tan, lắng đọng, gây
ơ nhiễm nguồn nước, khơng khí, đất, ảnh hưởng xấu tới cuộc sống con người và
sinh vật.
Tại Hội nghị tư vấn khu vực Châu Á Thái Bình Dương của FAO năm 1992
đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch
hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phá hoại
của vi sinh vật gây bệnh. Một trong những hướng giải quyết tương đối khả thi là
sử dụng các hợp chất sinh học chiết xuất từ vi sinh vật. Trong đó, vi khuẩn lactic
là một trong các nhóm vi sinh vật có lợi được quan tâm hàng đầu, bởi khả năng
sinh các hợp chất ức chế với hàm lượng lớn, đa dạng và hoạt tính cao.
Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) là nhóm vi khuẩn lên men chua
đã được con người sử dụng từ rất lâu. LAB có khả năng sản xuất ra các hợp chất
kháng khuẩn như axit hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl và các chất có khối lượng
phân tử cao như bacteriocin (Fugaban & cs., 2022). Các hợp chất kháng khuẩn hoạt
động như hệ thống phòng thủ đối kháng, ức chế các vi sinh vật gây hư hỏng. Ngoài ra,
khác với hầu hết các kháng sinh, chúng không gây tác dụng phụ, không gây ra phản

ứng dị ứng trong cơ thể người và các vấn đề về sức khỏe (Ng & cs., 2020).

1


Lactobacillus fermentum là một trong những chủng vi khuẩn axit lactic phổ
biến trong thực phẩm và sản phẩm thức ăn chăn ni. Các đặc tính và lợi ích sức
khỏe của L. fermentum làm cho chúng trở thành lợi khuẩn đầy triển vọng.
L.fermentum được đánh giá là ứng cử viên tiềm năng trong việc sinh tổng hợp các
hợp chất kháng khuẩn có khả năng tiêu diệt các tác nhân gây bệnh như
Staphylococcus

aureus,

Listeria

monocytogenes,

Escherichia

coli

và

Pseudomonas aeruginosa (Zhao & cs., 2019).
Chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum L18 được phân lập từ mẫu cá thu
thập tại tỉnh Bắc Giang đã được chứng minh là có khả năng kháng vi khuẩn
Staphylococus aureus, cho đường kính vịng kháng khuẩn là 20 ± 1 mm. Bên cạnh
đó, hợp chất kháng khuẩn từ chủng Lactobacillus fermentum L18 cũng được
chứng minh có bản chất là bacteriocin (một loại hợp chất kháng khuẩn có bản chất

là protein) (Nguyễn Hồng Thảo Minh, 2022).
Chính vì vậy, nhằm góp phần tạo tiền đề cho những nghiên cứu về thu nhận,
ứng dụng trong thực tế của các hợp chất kháng khuẩn sinh tổng hợp từ LAB, tôi
tiến hành thực hiện đề tài “Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả
năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus L18”
1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục đích nghiên cứu
Tối ưu hóa một số điều kiện ni cấy ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn
của chủng Lactobacillus fermentum L18 nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu về
sản xuất, thu hồi và tinh khiết các hợp chất kháng khuẩn.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn
Lactobacillus fermentum L18.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus fermentum L18.

2


Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus fermentum L18.
Ảnh hưởng của pH đến khả năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus
fermentum L18.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus
fermentum L18.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus fermentum L18.
Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lạnh đến khả năng kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus fermentum L18.


3


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về Lactobacillus spp.
2.1.1. Đặc điểm chung của Lactobacillus spp.
Lactobacillus (Lactobacilli) là vi khuẩn acid lactic, thuộc họ Lactobacillaceae.
Chúng là những trực khuẩn Gram dương, hình que và khơng tạo bào tử (Purkayastha
& cs., 2020). Chúng đều âm tính với oxidase và catalase, đồng thời có thể lên men
carbohydrate cũng như thủy phân esculin (Bratcher, 2018).
Lactobacillus có thể phát triển ở nhiệt độ từ 2°C đến 53°C với tốc độ phát
triển tốt nhất trong khoảng từ 30°C đến 40°C và trong khoảng pH từ 3 đến 8 ở
điều kiện hiếu khí và kỵ khí (Holzapfel & Wood, 2014). Chúng có khả năng lên
men, với q trình chuyển hóa lên men đồng hình hoặc dị hình (Giraffa & cs.,
2010). Lactobacillus được phân lập chủ yếu từ các sản phẩm sữa, các sản phẩm
thịt lên men và các sản phẩm thực vật lên men như bột chua, bia, rượu, thức ăn ủ
chua, dưa cải bắp…(Feng & cs., 2018). Lactobacillus có liên quan đến các bề mặt
niêm mạc, đặc biệt là đường tiêu hóa, khoang miệng, sinh dục của người và động
vật (Bratcher, 2018).
2.1.2. Vai trò
2.1.2.1. Đối với ngành cơng nghiệp thực phẩm
Lactobacillus có liên quan đến sản xuất thực phẩm vì tác dụng bảo quản do
q trình axit hóa, nâng cao hương vị, kết cấu và dinh dưỡng. Lactobacillus được
sử dụng làm chất khởi động hoặc nuôi cấy bổ sung cho một số loại phô mai, thực
phẩm thực vật lên men, thịt lên men, trong sản xuất rượu, bia, bánh mì bột chua
và thức ăn ủ chua. Chúng làm giảm độ pH nhanh chóng trong nguyên liệu thô
thông qua việc sản xuất axit lactic là sản phẩm dị hóa chính. Ngồi ra, hoạt động
phân giải protein và sản xuất các hợp chất thơm, bacteriocin và exopolysacarit có
liên quan đến chất lượng và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm cuối cùng và mở


4


rộng phạm vi ứng dụng công nghệ sinh học của nhóm LAB quan trọng này (Kong
& cs., 2020).
Sản xuất Bacteriocin và exopolysacarit là hai ví dụ có ý nghĩa về các ứng
dụng chức năng của Lactobacillus trong ngành công nghiệp thực phẩm. Trong hai
thập kỷ qua, một số nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của bacteriocin trong
việc kiểm soát sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh trong các sản phẩm thực
phẩm. Lactobacillus sản xuất bacteriocin đã được đề xuất như là môi trường nuôi
cấy bảo vệ trong thịt lên men, ô liu lên men và các sản phẩm từ sữa. Polysacarit
thực vật hoặc vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực
phẩm. Chúng được biết là làm tăng độ nhớt và độ cứng, cải thiện kết cấu và góp
phần tạo nên hương vị của các sản phẩm ít chất béo (Kong & cs., 2020).
2.1.2.2. Probiotics
Lactobacillus là loại men vi sinh được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất
trong LAB. Hầu hết các chủng Lactobacillus thuộc nhóm L. acidophilus. L.
(para)casei, L. plantarum, L. reuteri và L. salaryrius, L. fermentum đại diện cho
các nhóm phát sinh gen tương ứng, được biết là có chứa các chủng lợi khuẩn.
Nhiều loại sản phẩm sữa có chứa lợi khuẩn ở các thị trường khác nhau; ví dụ điển
hình bao gồm sữa tiệt trùng, kem, sữa lên men, pho mát và sữa bột cho bé ăn dặm
Các yêu cầu về chức năng của men vi sinh bao gồm khả năng dung nạp dịch
dạ dày và mật của con người, bám dính vào bề mặt biểu mơ, tồn tại trong đường
tiêu hóa của con người, kích thích miễn dịch, hoạt động đối kháng với mầm bệnh
đường ruột (như Helicobacter pylori, Salmonella spp., Listeria monocytogenes và
Clostridium difficile), và khả năng ổn định và điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột
(Mattila-Sandholm & cs., 2002).
2.1.2.3. Đối với sức khỏe con người
Lactobacillus giúp phòng tránh và ngăn chặn chứng rối loạn tiêu hóa, cân

bằng hệ vi sinh đường ruột; khơi phục và cân bằng vi khuẩn tự nhiên trong cơ thể;
đồng thời chuyển hóa lactose thành acid lactic giúp hạn chế tình trạng dị ứng do
5


cơ thể không dung nạp lactose. Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng Lactobacillus
có khả năng sản xuất các vitamin thiết yếu cho con người, chẳng hạn như vitamin
B2, B9 (folate) và B12. Gần đây người ta cũng đang tập trung vào sự phát triển
của Lactobacillus như một phương tiện tiềm năng để cung cấp các phân tử điều
trị và dự phòng, chẳng hạn như kháng nguyên vắc-xin ở người (Seegers, 2002;
Wells & Mercenier, 2008).
2.2. Tổng quan về Lactobacillus fermentum
2.2.1. Đặc điểm chung của Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum thuộc họ Lactobacillaceae chi Lactobacillus, được
tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật. Chúng là những vi
khuẩn ưa ẩm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, thường
lên men tạo acid từ D-Ribose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose, 11 DMaltose, D-Lactose, D-Melibiose, D-Sucrose, D-Trehalose, D-Raffinose (Lehri
& cs., 2017). Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng chịu các tác động
không nhỏ bởi các yếu tố vật lý như pH, nhiệt độ, thời gian và các yếu tố hóa học
như nguồn carbon, nitrogen…
L. fermentum là vi khuẩn Gram dương, có hình que, thích thước thường thay
đổi, thường là ngắn, đôi khi xếp thành các cặp hoặc chuỗi. Khuẩn lạc của
L.fermentum có màu trắng xám với đường kính khoảng lµm. Hình dạng khuẩn lạc
có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn. Đặc điểm nổi bật của khuẩn lạc
L.fermentum là có cấu trúc vịng tròn đồng tâm ở trung tâm khi được quan sát
dưới kính hiển vi. Chúng khơng có khả năng sinh bào tử và khơng di động (Zhou
& Li, 2021).
2.2.2. Vai trị của Lactobacillus fermentum
L. fermentum được coi là một chủng lợi khuẩn an tồn. Nó hầu như
khơng có tác dụng phụ, được đưa vào danh sách Giả định an toàn đủ điều

kiện (QPS) của Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) năm 2009
(Lara-Villoslada & cs., 2009). L. fermentum tham gia tích cực vào các q trình
6


trao đổi chất và điều hòa, đồng thời được sử dụng để phát triển các sản phẩm thực
phẩm và chế phẩm sinh học. Các đặc tính chính của L. fermentum là khả năng đối
kháng rõ rệt với các vi sinh vật gây bệnh, khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi
khuẩn của các loài và chủng khác, khả năng chống lại phổ tác nhân kháng khuẩn
và tham gia trực tiếp vào việc duy trì cân bằng nội mơi ở người và động vật
(Pelton, 2022).
2.2.2.1. Đối với sức khỏe con người
L. fermentum liên kết với cholesterol trong chế độ ăn uống và giúp phá vỡ
nó. Do sự đồng hóa với các tế bào bề mặt và kết hợp với màng tế bào, nó thúc đẩy
việc loại bỏ cholesterol trong ống nghiệm. L. fermentum có tác dụng trực tiếp lên
mạch máu: do tác dụng chống oxy hóa nên được dùng làm thuốc chữa xơ vữa
động mạch (Voloshyna & cs., 2019; Zhang Lihong & cs., 2022).
L. fermentum đã được chứng minh là tương tác với các tế bào miễn dịch của
con người và điều chỉnh các con đường cụ thể liên quan đến khả năng miễn dịch
bẩm sinh và thích nghi trong các bệnh viêm nhiễm khác nhau. Có dữ liệu về tác dụng
tích cực của nó đối với hệ thống miễn dịch và quá trình trao đổi chất của cơ thể. L.
fermentum tổng hợp axit amin, enzym, globulin miễn dịch, kích thích hoạt động thực
bào của bạch cầu trung tính, đại thực bào, interferon, interleukin và yếu tố hoại tử
khối u trên hệ thống miễn dịch. L. fermentum có khả năng kháng lysozyme và tạo ra
lysozyme, kết hợp với lysozyme của niêm mạc ruột góp phần vào khả năng chống
lại hệ vi sinh vật gây bệnh (Voloshyna & cs., 2019; Zhao & cs., 2019). Chức năng
của lồi này là mơ hình hóa sự hình thành của cytokine IL-10 chống viêm và giảm
mức độ của các chất trung gian gây viêm IL-2, -5, -6, cũng như yếu tố hoại tử khối
u TNF-α (Maldonado & cs., 2012; Zhang Lihong & cs., 2022).
2.2.2.2. Đối với ngành công nghiệp thực phẩm

L. fermentum được sử dụng trong sản xuất thực phẩm như một môi trường
nuôi cấy bổ sung để làm giàu sản phẩm với hệ vi sinh vật có lợi và điều chỉnh các
q trình vi sinh. Trong sản xuất pho mát và làm bánh, vi khuẩn L. fermentum
7


được sử dụng để duy trì các đặc tính cảm quan cao. L. fermentum cũng được sử dụng
để sản xuất thức ăn ủ chua chất lượng cao. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng L.
fermentum có thể lên men chất xơ và giải phóng axit béo chuỗi ngắn, bao gồm axit
propionic, butyric, axetic và axit lactic trong ruột. Sử dụng L.fermentum bằng đường
uống có thể cải thiện quá trình chuyển hóa glucose và điều chỉnh việc tạo ra các tế
bào miễn dịch bẩm sinh và thích nghi (Zhao & cs., 2019).
L. fermentum có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều vi sinh vật, chẳng hạn
như Listeria monocytogenes, Acinetobacter baumannii, Candida, Salmonella…
Dịch nuôi cấy L. fermentum với pH thấp được biết là có khả năng kháng khuẩn
cao hơn đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli
và Pseudomonas aeruginosa (Zhao & cs., 2019). Các chủng L. fermentum nhạy
cảm với các loại kháng sinh như gentamicin, cefazine, penicillin, trimethoprim,
sulfamethoxazole, ampicillin, carbenicillin nhưng kháng lại tetracycline và
eromycin (Voloshyna & cs., 2019).
2.3. Tổng quan về Lactobacillus fermentum L18
2.3.1. Đặc điểm sinh học
Chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum L18 được phân lập từ mẫu cá thu
thập tại tỉnh Bắc Giang và được lưu giữ tại phịng thí nghiệm của bộ mơn Cơng
nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Chủng vi khuẩn L. fermentum L18 là trực khuẩn gram dương, có khả năng
phân giải CaCO3, sinh acid, catalase âm tính, có khả năng di động và khả năng
khử nitrate.
Chủng vi khuẩn L. fermentum L18 có khả năng chịu muối mật trong dải nồng
độ từ 0% - 0,4% và khả năng chịu muối mật kém từ dải nồng độ 0,6% - 0,8%. Tại

12 - 48 giờ nuôi cấy, khả năng chịu muối mật của chủng L18 tăng dần từ dải nồng
độ 0,1% - 0,3%. Tại nồng độ 0,5% chủng L. fermentum L18 có thể phát triển từ
12 - 24 giờ nhưng tại thời điểm 48 giờ có dấu hiệu giảm.

8


Chủng vi khuẩn L. fermentum L18 có khả năng chịu acid cao, khả năng sống
sót trong dạ dày tốt. Ở pH=4, chủng L18 phát triển tốt nhất (Nguyễn Hoàng Thảo
Minh, 2022).

A

B

Hình 2.1. Kết quả nhuộm gram (A) và hình thái khuẩn lạc (B) của chủng vi
khuẩn Lactobacillus fermentum L18
2.3.2. Khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn
Chủng vi khuẩn L. fermentum L18 có khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn.
Đối với chủng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus, hợp chất kháng khuẩn
do L18 sinh ra cho đường kính vịng kháng khuẩn là 20 ± 1mm (Nguyễn Hoàng
Thảo Minh, 2022).
Các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi chủng vi khuẩn L. fermentum L18
có độ bền nhiệt ở nhiệt độ 100˚C, và bị mất hoạt tính hồn tồn ở 121˚C. Ngồi ra,
các hợp chất kháng khuẩn này cũng bị mất hoạt tính khi bị xử lý bằng enzym phân
giải proteinase-K. Vì vậy, các chất kháng khuẩn do chủng L18 sinh ra có bản chất là
protein và có thể là bacteriocin (Nguyễn Hồng Thảo Minh, 2022).

9



2.4. Tổng quan về vi khuẩn kiểm định (VKKĐ)
2.4.1. Tổng quan về Staphylococcus aureus
2.4.1.1. Đặc điểm chung
Staphylococcus aureus thuộc họ Staphylococcus. S. aureus là những vi
khuẩn hình cầu, khơng di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp
thành hình chùm nho, khơng di động. Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy
với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu. S. aureus
cho phản ứng đơng huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase.
Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của S. aureus thay đổi tùy thuộc vào
từng dòng. S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 748C, với nhiệt độ cực thuận là 30-45C; khoảng pH 4.2-9.3, với độ pH cực thuận
là 7-7.5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl. Tụ cầu bền vững khi có nồng
độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%. Ngồi ra, chúng cịn có khả
năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính
kháng của tụ cầu với sự sấy khơ và lọc thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp
S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và
mũi của người và động vật máu nóng. S. aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh
có thể sống tốt bên ngồi kí chủ. Vi khuẩn này cịn có mặt trong khơng khí, bụi
và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và
chất diệt khuẩn (Bremer & cs., 2004; Todar, 2005).
2.4.1.2. Khả năng gây bệnh của Staphylococcus aureus
S. aureus thường ký sinh ở da và mũi họng. Vi khuẩn này gây bệnh cho
những người bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực (Lê Huy
Chính, 2001).
Nhiễm khuẩn da
S. aureus có thể xâm nhập qua lỗ chân lơng, chân tóc hoặc các tuyến dưới
da. Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu
bối.. Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch
10



Nhiễm khuẩn huyết
S. aureus là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn đường huyết nhất. Do chúng
gây nên nhiễm khuẩn ngoài da, từ đây xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn
đường huyết. Ðây là một nhiễm trùng rất nặng. Từ nhiễm khuẩn đường huyết tụ
cầu đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc
viêm nội tâm mạc. Có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch. Một số nhiễm trùng
khu trú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương.
Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp
Ngộ độc thức ăn do S.aureus có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu,
hoặc do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế. Triệu chứng của ngộ độc thức
ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính. Sau ăn phải thức ăn nhiễm phải độc tố tụ
cầu 2-8 giờ, bệnh nhân nơn và đi ngồi dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân
và chất nôn chủ yếu là nước
Hội chứng sốc nhiễm độc (toxic shock syndrome)
Hội chứng này thường gặp ở phụ nữ sử dụng bông gạc khơng sạch khi có
kinh nguyệt. Bệnh khư trú ở âm đạo và căn nguyên là S.aureus. Các dấu hiệu lâm
sàng và vi khuẩn cho thấy rằng cơ chế của bệnh là sự nhiễm độc ngoại độc tố sinh
mủ. Năm 1980, ở Mỹ có 940 trường hợp bị hội chứng này, trong đó có tới 99% là
phụ nữ và 98% có liên quan đến việc sử dụng bơng gạc khơng sạch khi có kinh.
2.4.2. Tổng quan về Aeromonas hydrophila
2.4.2.1. Đặc điểm chung
Aeromonas hydrophila thuộc họ Aeromonadaceae, là vi khuẩn Gram âm, kỵ
khí tùy ý, khơng sinh bào tử, hình que. A. hydrophila có khả năng di động nhờ
một roi đơn cực, dương tính với catalase, dương tính với oxidase, lên men glucose.
Chúng không chịu được muối ( <5%) cũng như axit (pH tối thiểu 6.0) và phát
triển tối ưu ở 28C. Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ lạnh, ở một số lồi
có thể phát triển ở -0.1C (Daskalov, 2006). A. hydrophila chứa một số yếu tố độc
lực và độc tố, bao gồm độc tố ruột, độc tố tế bào và độc tố có hoạt tính tán huyết,
góp phần vào quá trình sinh bệnh học của vi khuẩn (Dong & cs., 2021).


11


A. hydrophila được tìm thấy hầu hết từ mơi trường nước như nước uống,
thậm chí cả nước thải và nhiều sản phẩm thực phẩm (hải sản, động vật có vỏ, thực
phẩm sống có nguồn gốc động vật như thịt gia cầm, thịt xay, sữa tươi và rau sống
(Janda & Abbott, 2010).
2.4.2.2. Khả năng gây bệnh của Aeromonas hydrophila
Bệnh ở người
Phần lớn các chủng A. hydrophila tạo ra các đặc tính ngoại độc tố
(enterotoxin, hemolysin và cytotoxins). Sự bám dính và xâm chiếm niêm mạc, sau
đó là sự tích tụ chất lỏng, hoặc thay đổi biểu mô, là những sự kiện có khả năng
dẫn đến bệnh tật ở người. Chúng là mầm bệnh có thể gây ra một số bệnh nhiễm
trùng ngoài đường ruột nghiêm trọng bao gồm nhiễm khuẩn huyết, viêm màng
não, phổi và nhiễm trùng vết thương.
Các trường hợp mắc bệnh liên quan đến A. hydrophila đã được báo cáo.
Krovacek và cộng sự (1989) đã báo cáo về trường hợp tiêu chảy kéo dài của một
đứa trẻ 1.5 tuổi do uống nước bị ô nhiễm. Tất cả các chủng A. hydrophila phân
lập từ các mẫu nước đều là những loài sinh độc tố ruột (Krovacek & cs., 1989).
Krovacek và cộng sự (1995) đã báo cáo ở Thụy Điển một trường hợp bị bệnh sau
khi ăn cá và các sản phẩm từ thịt có chứa số lượng lớn tế bào A. hydrophila (106
–107 CFU/g mẫu thực phẩm) (Krovacek & cs., 1995).
Bệnh ở cá và động vật lưỡng cư
A. hydrophila thường là mầm bệnh vi khuẩn cơ hội phổ biến trong môi
trường nước ngọt và là nguyên nhân gây bệnh ở các lồi khác nhau, bao gồm
lưỡng cư, bị sát, cá và động vật có vú. Nhiễm trùng máu Motile Aeromonas
(MAS) do A. hydrophila mesophilic gây ra ảnh hưởng đến nhiều loài cá nước ngọt
chủ yếu, bao gồm cá chép, cá rô phi, cá rô, cá trê và cá hồi. Khi
nhiễm A.hydrophila, cá bị lở loét, thối đuôi, thối vây và xuất huyết. Nhiễm trùng

huyết xuất huyết gây ra các tổn thương dẫn đến bong vảy, xuất huyết ở mang và
vùng hậu môn, loét, lồi mắt và sưng bụng (Dong & cs., 2021).
12


Kháng kháng sinh
Các nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn
A.hydrophila phân lập cho thấy có nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh có khả năng
kháng cao với một số loại kháng sinh ứng dụng trong lâm sàng; có thể trở thành
bệnh khó chữa do A. hydrophila.
Vivekanandhan và cộng sự (2002) đã báo cáo về khả năng kháng nhiều loại
kháng sinh của 319 chủng A. hydrophila phân lập từ cá và tôm. Tất cả các chủng
đều kháng methicillin và rifampicin, sau đó là bacitracin và novobiocin, nhưng
nhạy cảm với chloramphenicol (Vivekanandhan & cs., 2002).
2.5. Một số hợp chất kháng khuẩn được tổng hợp bởi LAB
LAB có thể tạo ra các hợp chất kháng khuẩn khác nhau, có thể được phân
loại là các hợp chất có khối lượng phân tử thấp như hydro peroxide, carbon
dioxide, diacetyl, các hợp chất khơng bị biến tính và các hợp chất có khối lượng
phân tử cao như bacteriocin (Omemu & Faniran, 2011).
2.5.1. Axit hữu cơ
Trong quá trình trao đổi chất, vi khuẩn axit lactic có thể tổng hợp nhiều loại
axit hữu cơ bao gồm cả axit lactic. Axit lactic là một hợp chất nền tảng sinh học
quan trọng, có thể được chia thành axit D-lactic và axit L-lactic theo vòng quay
quang học của nó. Axit L-lactic được ưa chuộng hơn cho các ứng dụng thực phẩm
và dược phẩm và là nguyên liệu ban đầu trong sản xuất polyme sinh học, trong khi
axit D-lactic độc hại đối với con người. Do đó, các nghiên cứu kỹ thuật trao đổi chất
đã tập trung vào việc sản xuất axit L-lactic tinh khiết bằng LAB lên men đồng thể.
Ngoài ra, các đồng phân lập thể của axit lactic cũng khác nhau về hoạt tính kháng
khuẩn, axit L-lactic có khả năng ức chế mạnh hơn so với đồng phân D (Papagianni,
2012). Axit lactic thường được cho là có tác dụng kháng khuẩn bằng cách can thiệp

vào việc duy trì điện thế màng tế bào, ức chế sự vận chuyển tích cực, giảm pH nội bào
và ức chế nhiều chức năng trao đổi chất (Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn,
2010). Việc sản xuất axit lactic và giảm độ pH phụ thuộc vào loài hoặc chủng, thành
13


phần nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng (Olaoye & Onilude, 2011). Chúng có
phương thức hoạt động rất rộng và ức chế cả vi khuẩn gram dương và gram âm
cũng như nấm men và nấm mốc (Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn 2010).
Ở pH thấp, một lượng lớn axit lactic ở dạng không phân ly và nó gây độc cho
nhiều loại vi khuẩn, nấm và nấm men. Tuy nhiên, các vi sinh vật khác nhau khác
nhau đáng kể về độ nhạy cảm với axit lactic. Ở pH 5,0 axit lactic ức chế vi khuẩn
hình thành bào tử nhưng khơng hiệu quả đối với nấm men và nấm mốc (Yang En
& cs., 2012).
Ngoài việc chủ yếu sản xuất axit lactic, vi khuẩn axit lactic còn sản xuất axit
axetic, propionic, 3-hydroxypropionate, formate và succinate. Trong đó, axit
axetic và propionic là các axit hữu cơ điển hình được tạo ra bởi các chủng LAB
thơng qua con đường lên men dị thể, có thể tương tác với màng tế bào và gây ra
q trình axit hóa nội bào và biến tính protein. Chúng có hiệu quả kháng khuẩn
hơn axit lactic do giá trị pKa cao hơn (axit lactic 3,08, axit axetic 4,75 và axit
propionic 4,87) và tỷ lệ axit không phân ly cao hơn axit lactic ở độ pH nhất định.
Axit axetic ức chế nhiều hơn axit lactic và axit xitric đối với Listeria
monocytogenes, và đối với sự phát triển và nảy mầm của Bacillus cereus. Axit
axetic còn tác dụng hiệp đồng với axit lactic; axit lactic làm giảm độ pH của mơi
trường, do đó làm tăng độc tính của axit axetic (Yang Zhennai, 2000).
2.5.2. Diacetyl
Một trong những sản phẩm cuối cùng có thể được tạo ra là diacetly, một hợp
chất hương vị quan trọng trong các sản phẩm sữa. Nó được sản xuất từ citrate
trong quá trình lên men đồng chuyển hóa với lactose (Kleerebezemab & cs.,
2000). Diacetyl có thể được tổng hợp bằng con đường chuyển hóa đường đồng

thể hoặc dị thể. LAB sử dụng citrate tạo ra diacetly trong quá trình lên men sữa
để sản xuất bơ, sữa tách bơ và một số loại pho mát đồng thời diacetly tạo ra mùi
thơm bơ đặc trưng trong các sản phẩm này. Do giá trị của nó như một hợp chất
thơm nên việc sản xuất hiệu quả diacetly từ lactoza thay vì citrate là mục tiêu của
14


một số chiến lược kỹ thuật trao đổi chất (Papagianni, 2012). Nó ức chế sự phát
triển của gram âm bằng cách phản ứng với protein liên kết với arginine, do đó ảnh
hưởng đến việc sử dụng arginine. Vi khuẩn gram âm nhạy cảm với diacetly hơn
vi khuẩn gram dương. Diacetly ở mức 344 µg/ml ức chế các chủng Listeria,
Salmonella, Yersinia, Esherichia coli và Aeromonas (Ammor & cs., 2006).
2.5.3. Hydrogen peroxide
Hydrogen peroxide (H2O2) được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm,
dược phẩm, sản phẩm nha khoa, dệt may, bảo vệ mơi trường và nó cũng tham gia
vào các q trình oxy hóa nâng cao và các q trình sinh hóa khác nhau. H 2O2
cũng được tạo ra bởi LAB với sự có mặt của oxy. Tác dụng kháng khuẩn của H2O2
có thể là kết quả của q trình oxy hóa các nhóm sulfhydryl gây biến tính một số
enzym và từ q trình peroxy hóa lipid màng do đó làm tăng tính thấm của màng
và cũng là tiền chất để sản xuất các gốc tự do diệt khuẩn như superoxide (Các gốc
O-2) và hydroxyl (OH-) có thể làm hỏng DNA. H2O2 có thể có tác dụng oxy hóa
mạnh màng lipid và protein tế bào và được sản xuất bằng cách sử dụng các enzym
như flavo protein oxidoreductase, NADH peroxidase, NADH oxidase v glycerophosphate oxidase (anlbaba & Gỹỗer, 2015).
2.5.4. Reuterin
Hp cht kháng khuẩn có nguồn gốc từ glycerol reuterin đã được chứng minh
là được sản xuất bởi một số lactobacilli. Reuterin được sản xuất trong điều kiện
yếm khí và q trình sản xuất được tăng cường khi có sự hiện diện của glycerol.
Reuterin có thể ức chế sự phát triển của Aspergillus và Fusarium, do đó nó có thể
đóng vai trị ngăn ngừa sự hình thành độc tố nấm mốc trong thực phẩm lên men.
Nó cũng hoạt động chống lại vi khuẩn gram dương và gram âm, bao gồm mầm

bệnh đường ruột, nấm men, nấm, động vật nguyên sinh và vi rút. Các sinh vật gây
hư hỏng nhạy cảm với reuterin bao gồm các loài Salmonella, Shigella,
Clostridium, Staphylococcus, Listeria, Candida và Trypanosoma (anlbaba &
Gỹỗer, 2015).
15