HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------  -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME XYLANASE
CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SP.

HÀ NỘI- 2023


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------  -------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME XYLANASE
CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SP.
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Kiều Anh

Mã sinh viên

: 642426

Lớp

: K64CNSHA

Giảng viên hƣớng dẫn : PGS.TS. Nguyễn Văn Giang
Bộ môn

: Công nghệ vi sinh

Hà Nội - 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là
trung thực và chƣa hề đƣợc sử dụng trong bất kỳ công bố nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận đã đƣợc
cám ơn và các thơng tin trích dẫn đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 13 tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Kiều Anh

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận này tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học,
cùng các thầy cơ giáo đã tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy trong suốt quá trình

học tập, nghiên cứu và rèn luyện ở Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp, tơi xin bày tỏ lòng biết
ơn sâu sắc tới Thầy giáo hƣớng dẫn PGS.TS. Nguyễn Văn Giang, ngƣời đã
định hƣớng và giúp đỡ cũng nhƣ hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tơi xin cảm ơn thầy PGS.TS. Nguyễn Xuân Cảnh, cô ThS. Trần Thị
Hồng Hạnh, cô ThS. Nguyễn Thanh Huyền, cô ThS. Trần Thị Đào, nghiên
cứu viên Dƣơng Văn Hoàn, Nguyễn Thị Thu, Tạ Hà Trang đã tận tình, chu
đáo, chỉ bảo và hƣớng dẫn tơi hoàn thành đề tài này một cách tốt nhất.
Đồng thời, tơi xin cảm ơn tồn thể các bạn đang thực tập và nghiên cứu
tại phịng thí nghiệm của Bộ mơn Công nghệ vi sinh đã giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Cuối cùng, với tất cả lòng thành kính và biết ơn vơ hạn, tơi xin gửi lời
cảm ơn đến bố mẹ, ngƣời đã sinh thành, nuôi nấng, động viên và tạo động lực
cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 13 tháng 02 năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Kiều Anh

ii


MỤC LỤC

Lời cam đoan ............................................................................................................... i
Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii
Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh mục bảng ......................................................................................................... vi

Danh mục hình ......................................................................................................... vii
Danh mục viết tắt .................................................................................................... viii
Tóm tắt .......................................................................................................................1
PHẦN I. MỞ ĐẦU .....................................................................................................2
1.1.

Đặt vấn đề ......................................................................................................2

1.2.

Mục đích ........................................................................................................3

1.3.

Nội dung nghiên cứu ......................................................................................3

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................4
2.1.

Tổng quan về xylanase ...................................................................................4

2.1.1.

Định nghĩa ......................................................................................................4

2.1.2.

Cấu trúc, phân loại và cơ chế xúc tác của xylanase .......................................4

2.1.3.


Các nguồn enzyme xylanase ..........................................................................8

2.1.4.

Ứng dụng của enzyme xylanase ..................................................................10

2.2.

Tổng quan về Bacillus sp. ............................................................................13

2.2.1.

Định nghĩa ....................................................................................................13

2.2.2.

Phân loại khoa học .......................................................................................14

2.2.3

Cấu trúc và hình thái của Bacillus sp. ..........................................................14

2.3.

Tình hình nghiên cứu các chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp enzyme
trên thế giới và trong nƣớc. ..........................................................................16

2.3.1.


Tình hình nghiên cứu các chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp enzyme tại
Việt Nam. .....................................................................................................16

2.3.2.

Tình hình nghiên cứu các chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp enzyme
trên thế giới. .................................................................................................17

iii


PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................20
3.1.

Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................20

3.1.1

Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................20

3.1.2.

Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................20

3.1.3.

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ....................................................................20

3.1.4.


Mơi trƣờng và hố chất sử dụng trong nghiên cứu ......................................20

3.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................21

3.2.1.

Xác định hoạt tính enzyme xylanase bằng phƣơng pháp khuếch tán
thạch .............................................................................................................21

3.2.2.

Xác định hoạt độ xylanase của các chủng vi khuẩn ....................................22

3.2.3.

Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh
trƣởng và hoạt tính xylanase của các chủng Bacillus ..................................23

3.2.4.

Khảo sát đặc điểm sinh học và phản ứng hóa sinh của các chủng
Bacillus tuyển chọn ......................................................................................25

3.2.5.

Phƣơng pháp nhuộm gram ...........................................................................27

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................29

4.1.

Xác định hoạt tính enzyme xylanase bằng phƣơng pháp khuếch tán
enzyme trên đĩa thạch ..................................................................................29

4.2.

Xác định hoạt độ xylanase ...........................................................................30

4.2.1.

Phƣơng pháp DNS .......................................................................................30

4.2.2.

Xác định hoat độ xylanase ...........................................................................32

4.3.

Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh
trƣởng và hoạt tính xylanase của các chủng Bacillus ..................................34

4.3.1.

Xác định thời gian ni cấy thích hợp .........................................................34

4.3.2.

Ảnh hƣởng của các giá trị pH khác nhau đến hoạt độ xylanase của các
chủng vi khuẩn .............................................................................................36


4.3.3.

Nguồn nitơ khác nhau ..................................................................................39

4.3.4.

Nồng độ cơ chất khác nhau ..........................................................................41

4.4.

Khảo sát đặc điểm sinh học và phản ứng hóa sinh của các chủng
Bacillus tuyển chọn ......................................................................................44

iv


4.4.1.

Khả năng di động .........................................................................................44

4.4.2.

Phản ứng catalase .........................................................................................44

4.4.3.

Phản ứng MR (Methyl red) ..........................................................................45

4.4.4.


Phản ứng VP (Voges-Proskauer) .................................................................46

4.4.5.

Khả năng biến dƣỡng citrate ........................................................................47

4.4.6.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và protease) ...........................48

4.5.

Kết quả nhuộm gram ....................................................................................49

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................51
5.1.

Kết luận ........................................................................................................51

5.2.

Kiến nghị ......................................................................................................51

PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................52
PHỤ LỤC ..................................................................................................................60

v



DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tính chất của enzyme xylanase từ các vi khuẩn (Beg & cs., 2000) ..........9
Bảng 2.2. Các loài nấm sinh tổng hợp enzyme xylanase .........................................10
Bảng 3.1. Thiết bị sử dụng .......................................................................................20
Bảng 4.1. Khả năng phân giải xylan của các chủng vi khuẩn..................................30
Bảng 4.2. Kết quả dựng đƣờng chuẩn xylose ..........................................................31
Bảng 4.3. Hàm lƣợng xylose và hoạt độ xylanase của các chủng vi khuẩn ............33
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới hàm lƣợng xylose của các
chủng vi khuẩn .........................................................................................34
Bảng 4.5. Hoạt độ xylanase của các dòng vi khuẩn theo các mốc thời gian 6h,
12h, 18h, 24h, 30h nuôi. ..........................................................................35
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH tới hàm lƣợng xylose của các chủng vi khuẩn ........37
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt độ xylanase của các chủng vi khuẩn ..........38
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ khác nhau đến hàm lƣợng xylose
của các chủng vi khuẩn ............................................................................39
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ khác nhau đến hoạt độ xylanase của
các chủng vi khuẩn ..................................................................................40
Bảng 4.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ xylan đến hàm lƣợng xylose của
các chủng vi khuẩn ..................................................................................42
Bảng 4.10. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ xylan đến hàm hoạt độ xylanase
của các chủng vi khuẩn ............................................................................43

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của xylan và các enzyme thủy phân xylan (Sunna &
Antranikian, 1997). ....................................................................................5
Hình 2.2. Cấu trúc không gian 3D của enzyme xylanase (Heinen & cs., 2018)
(Huang & cs., 2019)...................................................................................6

Hình 2.3. Hình thái của tế bào Bacillus sp. dƣới kính hiển vi đã đƣợc nhuộm
gram. ........................................................................................................15
Hình 4.1 Hoạt tính enzyme xylanase đƣợc xác định bằng phƣơng pháp
khuếch tán enzyme trên đĩa thạch............................................................29
Hình 4.2. Đồ thị đƣờng chuẩn xác định nồng độ đƣờng xylose. .............................31
Hình 4.3. Hàm lƣợng đƣờng xylose đƣợc giải phóng của các chủng vi khuẩn......32
Hình 4.4. Khả năng di động của 16 chủng Bacillus sp. ...........................................44
Hình 4.5. Khả năng sinh catalase của các chủng vi khuẩn ......................................45
Hình 4.6. Thử nghiệm phản ứng MR với các chủng vi khuẩn tuyển chọn .............45
Hình 4.7. Thử nghiệm phản ứng VP với chủng vi khuẩn tuyển chọn .....................46
Hình 4.8. Khả năng biến dƣỡng citrate của các chủng vi khuẩn .............................47
Hình 4.9. Khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase của các chủng vi khuẩn .....48
Hình 4.10. Khả năng sinh enzyme protase của các chủng vi khuẩn .........................49
Hình 4.11. Nhuộm gram............................................................................................50

vii


DANH MỤC VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Giải nghĩa

kDa

Kilodaltons

µg

Microgram


µl

Microlit

ĐC

Đối chứng

w/v

Weight/volume

mL

Mili lít

MR

Methyl Red

DNS

Axit 3,5-dinitrosalicylic

U/ml

Unit/mili lít

OD


Mật độ quang

viii


TĨM TẮT
Xylan là thành phần chính của hemicellulose, chiếm 20-35% khối
lƣợng chất khô. Hiện nay, enzyme xylanase đƣợc ứng dụng phổ biến trong
nhiều lĩnh vực nhƣ: nghành chăn nuôi, nông nghiệp, cơng nghiệp, sản xuất
giấy và hố chất. Chính vì những ứng dụng có tính cấp thiết hiện tại, đề tài
“Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
xylanase của các chủng vi khuẩn Bacillus sp.” đã đƣợc thực hiện.
Từ 24 chủng vi khuẩn hoạt hóa và sau khảo sát thu đƣợc 16 chủng
Bacillus sp. Có khả năng phân giải xylan, trong nghiên cứu này các chủng vi
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase, hoạt độ xylanase nhiều
nhất ở chủng B1.5 đạt 196 U/ml.
Khảo sát điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh trƣởng và hoạt tính
xylanase của các chủng Bacillus sp. cho thấy điều kiện mơi trƣờng thích hợp:
thời gian ni là 24h, pH bằng 7, môi trƣờng thay đổi nguồn nitơ là peptone
và nồng độ cơ chất xylan bằng 3g/l.
Đánh giá phản ứng hoá sinh cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn tuyển chọn
đều dƣơng tính với các phản ứng sinh hóa nhƣ catalase, MR, biến dƣỡng
citrate, sinh enzyme protease và cellulase và khả năng di động.

1


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Xylan là thành phần chính của hemicellulose, chiếm 20-35% khối lƣợng
chất khơ. Thành phần của xylan bao gồm mạch chính đƣợc cấu tạo bởi đƣờng
D-xylopyranose thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên Oacetyl, α-Larabinofuranosyl, α-D-glucuronosyl. Để thủy phân hoàn toàn xylan cần có sự
tham gia hoạt động của tổ hợp xylanase (Nascimento & cs., 2002). Đến nay,
xylanase từ vi sinh vật đƣợc quan tâm chú ý mạnh mẽ bởi khả năng ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực nhƣ bột giấy, thức ăn chăn ni, chuyển hóa
lignocellulose, cồn sinh học và cơng nghiệp đồ uống (Vũ Văn Lợi & cs.,
2013).
Vi khuẩn có nhiều đặc điểm vƣợt trội hơn so với các sinh vật khác, biểu
hiện ở khả năng sinh sản nhanh, vòng đời ngắn và chi phí nghiên cứu thấp
nên rất phù hợp cho việc nghiên cứu các sản phẩm thứ cấp nói chung và
enzyme xylanase nói riêng. Xylanase đƣợc sinh tổng hợp bởi rất nhiều loài vi
sinh vật khác nhau nhƣ vi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn (Fusarium oxysporum,
Trichoderma reesei, Aspergillus niger,…). Trong đó, xylanase từ xạ khuẩn
đƣợc cơng bố có khả năng chịu nhiệt, chịu kiềm và khơng có hoạt tính
cellulase (Rifaat, 2006).
Hiện nay, enzyme xylanase đƣợc ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực
nhƣ: nghành chăn nuôi, nông nghiệp, công nghiệp, sản xuất giấy và hoá chất. Sử
dụng xylanase trong tẩy trắng bột giấy giúp làm giảm lƣợng chlorine (Cl2) và
hypochlorine (ClO2) dùng trong tẩy trắng, đồng thời giảm lƣợng hóa chất thải ra
môi trƣờng. Xylanase bổ sung vào chế độ ăn dựa trên lúa mạch đen của gà thịt
dẫn đến giảm độ nhớt đƣờng ruột, do đó cải thiện cả tăng trọng của gà con và
hiệu quả chuyển đổi thức ăn của chúng (Bedford & Classen, 1992). Xylanase kết
hợp với cellulase và amylase, dẫn đến năng suất nƣớc trái cây đƣợc cải thiện
bằng phƣơng pháp hóa lỏng trái cây và rau quả, tăng thu hồi hƣơng liệu, tinh

2


dầu, vitamin, muối khoáng, giảm độ nhớt và sự thủy phân của các chất (Bajpai

& Pratima., 2014).
Chính vì những ứng dụng có tính cấp thiết hiện tại, đề tài “Ảnh hƣởng
của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của
các chủng vi khuẩn Bacillus sp.” đƣợc thực hiện.
1.2. Mục đích
- Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của một số
chủng Bacillus sp.
- Đánh giá hoạt tính xylanase sinh tổng hợp từ các chủng Bacillus sp.
- Đặc điểm hình thái và sinh hoá của các chủng Bacillus sp.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát khả năng sinh trƣởng của một số chủng vi khuẩn
- Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp enzyme
xylanse:
 Thời gian nuôi
 Các giá trị pH khác nhau
 Nồng độ cơ chất khác nhau
 Nguồn nitơ khác nhau
 Đặc điểm hình thái, sinh hố

3


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về xylanase
2.1.1. Định nghĩa
Xylanase là một enzym phức tạp, bao gồm endoxylanase (E.C.3.2.1.8),
β-xylosidase

(E.C.3.2.1.37),


α-glucuronidase

(E.C.3.2.1.139),

α-

arabinofuranosidase (E.C.3.2.1.55) và acetylxylan esterase (E.C.3.1.1.72)
(Juturu & Wu, 2012).
Endo-1,4-β-xylanase

(EC

3.2.1.8,

tên

hệ

thống

4-β-D-xylan

xylanohydrolase) là một loại enzyme phân hủy polysacarit xylan tuyến tính
thành xyloza. Enzyme này phá vỡ hemicellulose, một trong những thành phần
chính của thành tế bào thực vật (Contributors, 2022).
Xylanase đóng một vai trò quan trọng đối với vi sinh vật phát triển
mạnh trên các nguồn thực vật để phân hủy chất thực vật thành các chất dinh
dƣỡng có thể sử dụng đƣợc. Xylanase đƣợc tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, nấm
men, tảo biển, động vật nguyên sinh, ốc sên, động vật giáp xác, cơn trùng

(Polizeli & cs., 2005).
Xylanase có khả năng hấp thụ và phân hủy xylan, một loại glucan nằm
trong bột gạo và các sản phẩm gạo. Xylanase có tính chất của lysozyme, giúp
sản xuất bột có độ bền cao, giảm độ pH của bột gạo. Xylanase đƣợc sử dụng
trong sản xuất bột gạo vì nó có thể hấp thụ và phân hủy các loại xylan trong
bột, giảm đƣợc thời gian pha trộn, giảm đƣợc nồng độ pH của bột.
2.1.2. Cấu trúc, phân loại và cơ chế xúc tác của xylanase
2.1.2.1. Cấu trúc và phân bố của xylan
Cơ chất của enzyme xylanase là xylan. Xylan là polysacarit phong phú
thứ hai trong tự nhiên, chiếm khoảng một phần ba lƣợng carbon hữu cơ tái tạo
trên trái đất (Collins & cs., 2005). Xylan chủ yếu hiện diện trong thành tế bào
thứ cấp cùng với cellulose (1,4-β-glucan) và lignin (một hợp chất

4


polyphenolic phức tạp) tạo thành các thành phần polyme chính của thành tế
bào thực vật. Trong cấu trúc thành tế bào, cả ba thành phần tƣơng tác thông
qua các liên kết cộng hóa trị và khơng cộng hóa trị (Motta & cs., 2013).
Dựa trên các nhóm thế phổ biến đƣợc tìm thấy trên bộ khung của phân
tử xylan, xylan đƣợc phân loại thành homoxylan tuyến tính, arabinoxylan,
glucuronoxylan hoặc glucuronoarabinoxylan.

Hình 2.1. Cấu trúc của xylan và các enzyme thủy phân xylan
(Sunna & Antranikian, 1997).
-

Arabinoxylans, chỉ có chuỗi bên của các đơn vị đầu cuối đơn lẻ của

các nhóm thế α-L-arabinofuranosyl. Trong trƣờng hợp cụ thể của ngũ cốc,

arabinoxylan khác nhau về mức độ thay thế arabinosyl, với gốc 2-O- và 3-Ođƣợc thế đơn hoặc kép (2-O-, 3-O-) đƣợc thế xylosyl.
-

Glucuronoxylans, trong đó axit α-D-glucuronic hoặc dẫn xuất 4-O-

metyl ete của nó là nhóm thế duy nhất.
-

Glucuronoarabinoxylan, trong đó axit α-D-glucuronic (và 4-O-

metyl-α-D-glucuronic) và α-L-arabinose đều có mặt.
-

Galactoglucuronoarabinoxylans, đƣợc đặc trƣng bởi sự hiện diện

của gốc β-D-galactopyranosyl cuối cùng trên chuỗi bên oligosacarit phức tạp

5


của xylan và thƣờng đƣợc tìm thấy trong thực vật lâu năm.
Xylan đƣợc phân bố trong một số loại mô và tế bào, hiện diện trong
nhiều loài thực vật đƣợc tìm thấy với số lƣợng lớn trong gỗ cứng từ thực vật
hạt kín (15–30% thành phần vách tế bào) và gỗ mềm từ thực vật hạt trần (7–
10%), cũng nhƣ trong cây hàng năm (<30%). Xylan gỗ tồn tại dƣới dạng Oacetyl-4-O-methylglucuronoxylan

trong

gỗ


cứng

và

arabino-4-O-

methylglucuronoxylan trong gỗ mềm, trong khi xylan trong cỏ và cây hàng
năm thƣờng là arabinoxylan. Xylan không thay thế tuyến tính cũng đã đƣợc
báo cáo trong cỏ esparto, thuốc lá và một số loại tảo biển, với loại sau có chứa
gốc xylopyranosyl đƣợc liên kết bởi cả hai liên kết 1,3-β và 1,4-β (Motta &
cs., 2013).
2.1.2.2. Cấu trúc của enzyme xylanase
Cấu trúc khơng gian của xylanase đƣợc tìm thấy ở nhiều vi khuẩn và
nấm thuộc họ 10 và 11. Có nhiều enzyme của họ 10 đáng chú ý: gồm một
module gắn kết carbohydrate đƣợc gắn bằng một cầu nối linh động. Các
xylanase của họ 11 thƣờng có các domain xúc tác cao từ 180-200 cấu tử gấp
cuộn thành một motif β-sheet đƣợc gọi là gấp β-jelly-roll. Chúng đặc hiệu với
xylan hơn bình thƣờng và khơng có các domain phụ.

Hình 2.2. Cấu trúc không gian 3D của enzyme xylanase (Heinen & cs.,
2018) (Huang & cs., 2019).

6


So với các xylanase khác, các thành viên của họ 11 thể hiện một số tính
chất hấp dẫn, chẳng hạn nhƣ tính chọn lọc cơ chất cao và khả năng xúc tác
cao hiệu quả, kích thƣớc nhỏ và phạm vi pH tối ƣu và các giá trị nhiệt độ, làm
cho chúng phù hợp trong các điều kiện khác nhau và trong nhiều ứng dụng.
Cấu trúc không gian 3D của họ 11 xylanase có hình dạng tổng thể của bàn tay

phải. Nó bao gồm gồm hai tấm gấp nếp b lớn và một chuỗi xoắn đơn tạo
thành một cấu trúc tƣơng tự nhƣ một bàn tay phải (Walia & cs., 2017).
2.1.2.3. Phân loại
Enzyme xylanase là glycoside hydrolase (GH) đƣợc phân loại trên cơ
sở tƣơng đồng trong các yếu tố cấu trúc và nhóm kỵ nƣớc thành một số họ,
tức là 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 26, 30, 43, 44, 51 và 62, có thể thủy phân liên
kết b-1,4 glycosid của xyloside từ đó đƣờng hemiacet và aglycone khơng
đƣờng có nguồn gốc. Các trình tự đƣợc phân loại trong các họ 16, 51 và 62
dƣờng nhƣ là các enzyme nhị phân chứa hai miền xúc tác, không giống nhƣ
các họ 5, 7, 8, 10, 11 và 43, có sự khác biệt thực sự miền xúc tác với hoạt tính
endo-1,4-b-xylanase (Collins & cs., 2005).
Dựa vào cấu trúc phân tử mà xylanase đƣợc phân thành 2 nhóm: nhóm
enzyme có 1 domain và nhóm có nhiều domain. Các domain gắn kết với
cellulose, hầu hết là các domain khơng có chức năng xúc tác ở xylanse, chúng
thúc đẩy việc gắn kết các dạng cellulose crystalline hoặc amorphous khác
nhau và có thể bẻ gãy vì sợi cellulose để cellulase phân giải dễ dàng hơn.
Phân loại dựa theo tính chất lý hố:
- Nhóm có phân tử khối thấp (<30 kDa) và pI (điểm đẳng điện) trung tính.
- Nhóm có phân tử khối cao (>30 kDa) và pI axit
2.1.2.3. Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase
Cơ chế hoạt động của xylanase bao gồm các bƣớc sau
Bƣớc 1: Enzyme xylanase nhận biết xylan và liên kết với nó bằng cách
thay đổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần.

7


Bƣớc 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc
tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian
đồng hóa trị enzyme - cơ chất.

Bƣớc 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nƣớc hoạt động.
Phân tử nƣớc này tách thành ion H+ và OH‒. Ion H+ gắn vào gốc glycosyl vừa
đƣợc tách ra trong khi ion OH‒ gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo ra
theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm đƣợc giải phóng, đồng thời
enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác.
Sơ đồ tóm tắt của quá trình nhƣ sau:
Xylanase + xylan

xylan-xylanase

xylanase + sản

phẩm
Đầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc đƣợc đặt vào vị trí đối diện với khe giữ
Tyr 65 và Tyr 69. Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit
Glutamic 78 là chất cho điện tử (nucleophile). Cơ chất bám vào vị trí
Glutamic 78 tạo thành dạng sản phẩm trung gian và đƣợc giữ vững trong suốt
quá trình phản ứng chuyển glycosylate. Một phân tử nƣớc thay thế vị trí của
chất cho điện tử (nucleophile). Có sự phân tách và phân tán các đƣờng
(xylobiose) cho phép enzyme di chuyển đến một vị trí mới trên cơ chất.
2.1.3. Các nguồn enzyme xylanase
Enzyme xylanase có thể đƣợc lấy từ nhiều nguồn nhƣ: nấm, vi khuẩn,
nấm men, sinh vật biển tảo, hạt, giáp xác, ốc,… nhƣng 2 nguồn chính đó là từ
nấm và vi khuẩn.
2.1.3.1. Nguồn enzyme xylanase từ vi khuẩn
Xylanase đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn và xạ khuẩn (Bacillus sp.,
Pseudomonas sp ., Streptomyces sp.) có hiệu quả ở độ pH rộng hơn phạm vi
5-9, với nhiệt độ tối ƣu cho hoạt tính xylanase trong khoảng 35ºC đến 60ºC.
Các nghiên cứu về Bacillus sp. cho thấy hoạt tính của xylanase cao hơn
ở pH kiềm và nhiệt độ cao. Do đó, xylanase của vi khuẩn đã đƣợc sử dụng


8


trong ứng dụng cơng nghiệp do tính kiềm của khả năng chịu đựng và khả
năng chịu nhiệt (Mandal, 2015).
Bảng 2.1. Tính chất của enzyme xylanase từ các vi khuẩn
(Beg & cs., 2000)

2.1.3.2. Nguồn enzyme xylanase từ nấm
Nấm (Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp.) là những nhà
sản xuất quan trọng của xylanase do năng suất cao và ngoại bào giải phóng
các enzyme. Ngồi ra, xylanase của nấm có hoạt tính cao so với vi khuẩn
hoặc nấm men.
Hầu hết các xylanase hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ dƣới 50ºC và
khoảng pH từ 4-6 (Beg & cs., 2000). Ví dụ, xylanase của nấm không thể đƣợc

9


sử dụng trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy, cần một pH kiềm và nhiệt
độ hơn 60ºC (Mandal, 2015). Các chủng nấm đƣợc nghiên cứu về xylanase
của chúng hoạt động đƣợc thể hiện trong bảng 2.2 (Burlacu & cs., 2016).
Bảng 2.2. Các loài nấm sinh tổng hợp enzyme xylanase
Các loài nấm
Aspergillus niger

T. longibrachiatum

A. foetidus


T. harzianum

A. brasiliensis

T. viride

A. flavus

Schizophyllum commune

A. nidulans

Fusarium oxysporum

A. terreus

Thermomyces lanuginosus

Penicilium sp.

Alternaria sp.

Trichoderma reesei

Talaromyces emersonii

T. atroviride

Piromyces sp.


2.1.4. Ứng dụng của enzyme xylanase
Xylanase đã và đang thu hút đƣợc sự quan tâm lớn bởi những ứng
dụng tiềm năng của chúng trong một số ngành công nghiệp quan trọng hiện
nay. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh
học, việc sử dụng xylan và xylanase đã tăng lên. Xylanase bắt đầu đƣợc sử
dụng vào những năm 1980 (Juturu & Wu., 2012), ban đầu là để chuẩn bị
thức ăn chăn nuôi và sau này trong các ngành cơng nghiệp thực phẩm, dệt
may, giấy và hóa chất.
2.1.4.1. Thức ăn chăn ni
Enzyme đơn dịng xylanase Biotek đƣợc sử dụng rộng rãi trong chăn
nuôi ở Việt Nam với những tác dụng rất hữu ích. Xylanase có tác dụng phân
giải xylan, một thành phần quan trọng của hemicellulose có nhiều trong thức
ăn của vật ni, giải phóng đƣờng xylose và xylooligosaccharide dẫn đến làm

10


giảm độ nhớt của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa và hấp thụ chất dinh
dƣỡng tốt hơn, cải thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi.
Xylanase bổ sung vào thức ăn làm tăng đáng kể khối lƣợng và giảm thiểu
bệnh tật ở vật nuôi.
Xylanase vào chế độ ăn dựa trên lúa mạch đen của gà thịt dẫn đến giảm
độ nhớt đƣờng ruột, do đó cải thiện cả tăng trọng của gà con và hiệu quả
chuyển đổi thức ăn của chúng (Bedford & Classen., 1992).
Xylanase đƣợc sử dụng làm tiền xử lý thức ăn thô cây trồng, cải thiện các
đặc tính dinh dƣỡng trong nơng nghiệp và thức ăn ngũ cốc (Subramaniyan &
Prema., 2002), do đó cải thiện khả năng tiêu hóa của thức ăn gia súc nhai lại và
tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ni phân (Gilbert & Hazlewood., 1993).
2.1.4.2. Cơng nghiệp thực phẩm

Các enzyme xylanase cùng với α-amylaza, amylaza mạch nha, gluco
oxidaza và protease có thể đƣợc sử dụng trong sản xuất bánh mì. Xylanase rất
quan trọng đối với việc làm bánh mì và là một trong những ứng dụng enzyme
làm bánh lâu đời nhất. Một chức năng cơ bản của xylanase là phân hủy
arabinoxylan (một hemicellulose có trong lúa mì) thành arabinoxylan có thể
chiết xuất từ nƣớc. Điều này cho phép phân phối lại nƣớc trong bột nhào, từ
đó cải thiện sự hình thành mạng lƣới gluten trong bột nhào. Kết quả mong
muốn là một khối bột khô đƣợc cân bằng chính xác về độ mềm, khả năng mở
rộng và độ đàn hồi phù hợp (Harris & Ramalingam., 2010).
Xylanase kết hợp với cellulase và amylase, dẫn đến năng suất nƣớc trái
cây đƣợc cải thiện bằng phƣơng pháp hóa lỏng trái cây và rau quả, tăng thu
hồi hƣơng liệu, tinh dầu, vitamin, muối khoáng, giảm độ nhớt; và sự thủy
phân của các chất (Bajpai & Pratima., 2014). Xylanase làm giảm độ nhớt của
chất lỏng pha chế, cải thiện khả năng lọc của nó (Garg & Kumar., 2010).
Một tính chất quan trọng của xylanase đƣợc ứng dụng trong nghành công
nghiệp thực phẩm là tính ổn định và hoạt động tối ƣu ở độ pH thấp. Một loại

11


men rƣợu vang tái tổ hợp đƣợc tạo ra với gen xylanase của Aspergillus industrial
applications of xylanase 87 nidulans, xlnA, tạo ra một loại rƣợu vang có mùi
thơm rõ rệt hơn so với rƣợu vang thông thƣờng (Ganga & cs., 1999).
Quá trình lên men: Một loại β-glucanase từ nấm A. niger đƣợc sử dụng
trong quá trình lên men bia để tránh những khó khăn gặp phải trong q trình
lọc của β-glucans. Xylanase cũng là một trong những thành phần của 'Ultraflo
L' đƣợc sản xuất bởi miếng lót Humicola, một chất ổn định nhiệt β-glucanase
đa hoạt tính có thể đƣợc sử dụng trong quá trình nghiền trong sản xuất bia để
đảm bảo sự phân hủy hiệu quả hoạt tính của β-glucans của xylanase trong
thành phần với α-amylase và gluco-amylase đã đƣợc chọn để đạt đƣợc sản

lƣợng ethanol cao hơn trong sản phẩm chƣng cất, bằng cách giảm nồng độ
metanol, propanol, isobutanol andisoamyl & amyl alcohol (Goswami &
Pathak., 2013).
2.1.4.3. Nông nghiệp
Xử lý tế bào huyền phù thuốc lá (Nicotiana tabacum CV.KY 14)
bằng endoxylanase tinh khiết từ Trichoderma viride làm tăng mức sterol
glycoside acyl hóa và kích thích sự tổng hợp của phytoalexin (Moreau &
Anderson., 1994).
Ngoài ra, một gen xylanase của vi khuẩn bị cắt ngắn từ Clostridium
thermocellum đã đƣợc chứng minh trong quá trình hình thành rễ ở cây thuốc
lá chuyển gen. Một số xylanase cải thiện quá trình ngâm thành tế bào để sản
xuất nguyên sinh chất thực vật (Burlacu & cs., 2016).
2.1.4.4. Nghành sản xuất giấy
Enzyme xylanase đƣợc sử dụng làm chất tẩy trắng bột giấy trong
nghành công nghiệp thực phẩm (Bajpai & Pratima., 2014).
Xylanase tẩy trắng bột giấy hóa học là ứng dụng công nghệ sinh học
đƣợc sử dụng rộng rãi nhất và đƣợc thiết lập tốt nhất trong tẩy trắng bột giấy.
Enzyme chính cần thiết để tăng cƣờng quá trình phân lớp của giấy kraft là

12


endo-β-xylanase. Việc sử dụng enzyme xylanase giúp giảm chi phí tẩy trắng,
đồng thời bảo vệ môi trƣờng so với phƣơng pháp tẩy trắng bằng Clo.
Đến nay, xylanase từ Streptomyces albus và S. chromofuscus đã đƣợc
ứng dụng thành công trong tẩy trắng bột giấy, sử dụng xylanase từ chủng S.
albus giúp độ sáng của bột giấy tăng 4% và xylanase từ S. chromofuscus có
hiệu quả tẩy trắng tăng 9,1% so với không xử lý. Nghiên cứu đặc điểm sinh
học và phân loại của chủng xạ khuẩn CP23X9 sinh xylanase cao nhằm ứng
dụng trong tẩy trắng bột giấy (Vũ Văn Lợi & cs., 2013).

2.1.4.5. Nghành hoá chất
Xylitol đƣợc sản xuất từ xyloza bằng hai giai đoạn. Dung dịch nƣớc
pha thu đƣợc từ q trình tiền xử lý hóa học của lignocelluloses đã đƣợc
chuyển đổi thành xyloza bằng cách sử dụng endo-xylanase cố định và βxylosidase ở 40°C trong 15 giờ, sau đó là q trình hydro hóa xyloza thành
xylitol (Sinner & cs., 1998).
Các xylo-oligomer hình thành trong quá trình tiền xử lý lignocellulose
ức chế quá trình thủy phân cellulose trong quá trình đƣờng hóa. Khi bổ sung
enzyme xylanase nhƣ endo-xylanase hoặc β-xylosidase vào hệ thống sẽ giúp
thủy phân xylo-oligomers. Từ đó, cải thiện quá trình thủy phân cellulose
(Kumar & Wyman., 2010).
Xylan đƣợc chiết xuất từ bột cây dƣơng bằng natri hydroxit. Thủy phân
hỗn hợp bằng Irgazyme 10A-X4, đây là một phức hợp enzyme thƣơng mại bao
gồm cả endo-xylanase và β-xylosidaza. Quá trình thủy phân xylan đƣợc tiến
hành trong điều kiện pH 4,5–5, 45°C trong 22–45 giờ để tạo ra xyloza. Năng
suất tối đa đạt 91% dựa trên chất rắn khô đƣợc sử dụng (Juturu & Wu., 2012).
2.2. Tổng quan về Bacillus sp.
2.2.1. Định nghĩa
Bacillus là tên của một chi gồm các vi khuẩn hình que, hiếu khí thuộc
họ Bacillaceae, nghành Firmicutes. Chúng còn đƣợc gọi là khuẩn que hoặc

13


trực khuẩn.
Bacillus là vi khuẩn gam dƣơng, sử dụng khí oxy làm chất nhận
electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Qua kính hiển vi
Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc
que này có bào tử trong hình oval có khuynh hƣớng phình ra ở một đầu.
Thƣờng thì ngƣời ta quan sát thấy tập đoàn giống sinh vật này rất rộng lớn, có
hình dạng bất định và phát triển lan rộng.

2.2.2. Phân loại khoa học
Bacillus đƣợc phân loại nhƣ sau (Soule, 1932):
Giới:

Bacteria

Ngành: Firmicutes
Lớp:

Bacilli

Bộ:

Bacillates

Họ:

Bacillaceae

Chi:

Bacillus

2.2.3 Cấu trúc và hình thái của Bacillus sp.
Các lồi Bacillus có hình que, hình thành nội bào tử hiếu khí hoặc kỵ
khí tùy tiện. Ở một số lồi ni cấy có thể chuyển sang gram âm theo độ tuổi.
Các nhiều loài thuộc chi thể hiện một loạt các khả năng sinh lý cho phép
chúng sống trong mọi môi trƣờng tự nhiên và có thể sống ở các mơi trƣờng
khắc nhiệt nhƣ: băng tuyết, xa mạc, sâu dƣới đại dƣơng, môi trƣờng bức xạ
hoặc chất khử trùng (Logan & Vos., 2015).


14


Hình 2.3. Hình thái của tế bào Bacillus sp. dƣới kính hiển vi đã đƣợc
nhuộm gram.
Thành tế bào của Bacillus sp. là một cấu trúc ở bên ngoài tế bào tạo
thành rào cản thứ hai giữa vi khuẩn và môi trƣờng, đồng thời duy trì hình
dạng que và chịu đƣợc áp suất do sức trƣơng của tế bào tạo ra. Thành tế bào
gồm có axit teichoic và teichuronic. B. subtilis là vi khuẩn đầu tiên xác định
đƣợc vai trò của khung tế bào giống nhƣ actin trong việc xác định hình dạng
tế bào và tổng hợp peptidoglycan và tồn bộ bộ enzyme tổng hợp
peptidoglycan đã đƣợc bản địa hóa. Vai trị của khung tế bào trong việc tạo và
duy trì hình dạng là rất quan trọng.
Các bào tử của chúng có khả năng chịu lạnh, chịu nhiệt, sấy khơ và khử
trùng. Hầu hết đều là lồi ƣa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ƣu là 30 – 450C,
nhƣng cũng có nhiều lồi ƣa nhiệt với nhiệt độ tối ƣu là 650C. Đa số Bacillus
sinh trƣởng ở pH=7, một số phù hợp với pH (9 - 10) nhƣ Bacillus
alcalophillus, hay có lồi phù hợp với pH (2- 6) nhƣ Bacillus acidocaldrius,
Bacillus có khả năng có định nitơ, phân giải phosphate khó tan, sinh tổng hợp
các chất kích thích sinh trƣởng thực vật, có khả năng đối kháng với các tác
nhân gây bệnh thực vật và sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protase,
cellulase, chitinase). Nhiều chủng đƣợc xem là có tiềm năng thƣơng mại nhƣ
đóng vai trị là một chất kích thích sinh trƣởng thực vật, tác nhân kiểm sốt
sinh học và việc sử dụng chúng trong nông nghiệp đã đƣợc báo cáo gần đây

15