TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÙI THỊ THU GIANG

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ
(PYRRHOSIA LINGUA (THUNB.) FARWELL) HỌ
DƢƠNG XỈ (POLYPODIACEAE) TRÊN ĐỊA BÀN
TỈNH PHÚ THỌ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sƣ phạm Hóa học

Phú Thọ, 2016


TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÙI THỊ THU GIANG

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
DỊCH CHIẾT ETHYL ACETATE CÂY THẠCH VĨ
(PYRRHOSIA LINGUA (THUNB.) FARWELL)HỌ
DƢƠNG XỈ (POLYPODIACEAE) TRÊN ĐỊA BÀN
TỈNH PHÚ THỌ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sƣ phạm Hóa học

NGƢỜI HƢỚNG DẪN: ThS. Nguyễn Thị Bình Yên
Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng

Phú Thọ, 2016


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn Thầy hƣớng dẫn
khoa học: ThS. Nguyễn Thị Bình Yên -Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã chỉ
ra hƣớng nghiên cứu và tận tình hƣớng dẫn em trong suốt q trình thực hiện
khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cô, các nhà khoa học Trƣờng
Đại học Hùng Vƣơng đã giảng dạy và hƣớng dẫn em thực hiện các thực
nghiệm hóa học.
Nhân dịp này em xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo
Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Khoa Khoa học Tự nhiên - Trƣờng Đại học
Hùng Vƣơng đã tạo cho em một môi trƣờng học tập khoa học, nghiêm túc.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân và các bạn
sinh viên K10. ĐHSP Hóa học-Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã hỗ trợ, động
viên em trong suốt quá trình học tập và thực hiện Đề tài.
Phú Thọ, ngày 18 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Bùi Thị Thu Giang


- i-

MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Lý do lựa chọn đề tài ......................................................................................... 1
Mục tiêu của đề tài ............................................................................................ 2
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .......................................................... 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia ......................................................................... 3
1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ ................................................................. 4
1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Pyrrhosia ........................................... 5
1.4 Sơ lƣợc về lớp chất steroid .......................................................................... 5
CHƢƠNG 2. Đ ỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN C ỨU .............................................................................................. 9
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu.................................................................................. 9
2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị .......................................................................... 9
2.2.1 Nguyên vật liệu ........................................................................................ 9
2.2.1.1 Mẫu nghiên cứu..................................................................................... 9
2.2.1.2 Hóa chất................................................................................................. 9
2.2.2 Thiết bị nghiên cứu .................................................................................. 9
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 12
2.3.1 Phƣơng pháp ngâm chiết ........................................................................ 12
2.3.2 Phƣơng pháp sắc ký ............................................................................... 13
2.3.2.1 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng ............................................................ 13
2.3.2.2 Phƣơng pháp sắc ký cột ...................................................................... 13
2.3.3 Phƣơng pháp kết tinh ............................................................................. 14
2.3.4 Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân(NMR) ................................ 15
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 18



- ii-

3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết EtOAc cây Thạch vĩ ............................ 18
3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc cây Thạch vĩ ................ 19
3.1.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung mơi............................ 19
3.2.1 Q trình phân lập các chất .................................................................... 21
3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc ................................................ 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 37
Kết luận ........................................................................................................... 37
Kiến nghị ......................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 38


- iii-

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Các phƣơng pháp sắc ký
TLC

Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng

CC

Column Chromatography: Sắc ký cột

Các phƣơng pháp phổ
1

H-NMR


Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy:
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton

s: singlet
d: doublet
m: multiplet
 Các chữ viết tắt khác
TMS Tetramethyl silan
Tên của các hợp chất đƣợc viết theo nguyên bản Tiếng Anh


- iv-

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây Thạch vĩ ...................................................................... 4
Hình 1.2. Cấu tạo khung steroid ....................................................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc khung steroid ...................................................................... 7
Hình 1.4. Cấu dạng của steroid ......................................................................... 7
Hình 2.1. Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao) ............................................................ 9
Hình 2.2.Máy cất quay chân khơng ................................................................ 10
Hình 2.3. Cột sắc ký với kích thƣớc khác nhau .............................................. 10
Hình 2.4. Bộ chƣng cất dung mơi ................................................................... 11
Hình 2.5. Máy soi UV ..................................................................................... 11
Hình 2.6. Sơ đồ chung của phƣơng pháp ngâm chiết ..................................... 12
Hình 2.7. Minh họa sắc ký lớp mỏng .............................................................. 13
Hình 2.8. Minh họa sắc ký cột ........................................................................ 14
Hình 2.9. Độ chuyển dịch hóa học của proton ................................................ 15
Hình 2.10. Sự tách vạch phổ ........................................................................... 16
Hình 2.11. Ví dụ minh họa về sự tách vạch phổ ............................................. 16

Hình 2.12. Một số ví dụ về 2J, 3J ..................................................................... 17
Hình 3.1. Quá trình lọc dung dịch ................................................................... 18
Hình 3.2. Cặn EtOAc Thạch vĩ ....................................................................... 19
Hình 3.3. Kết quả khảo sát TLC cặn chiết EtOAc Thạch vĩ........................... 20
Hình 3.4. TLC cặn EtOAc Thạch vĩ với hệ dung môi (III) ............................ 21
Hình 3.5. Cột tổng silica gel cặn EtOAc ......................................................... 22
Hình 3.6. Hình ảnh TLC các lọ từ 55 – 81 của phân đoạn F4 ........................ 23
Hình 3.7. Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F7 .............................................. 26
Hình 3.8. Cột phân đoạn F4 ............................................................................ 27
Hình 3.9. Hình ảnh TLC các lọ từ 228 – 251 của phân đoạn F4.6 ................. 30
Hình 3.10. Sơ đồ phân lập dịch chiết EtOAc câyThạch vĩ ............................. 31
Hình 3.11. Hình ảnh chất PLEA2 và sắc ký đồ TLC ...................................... 32


- v-

Hình 3.12. TLC so sánh PLEA2 với hỗn hợp -Sitosterol+Stigmasterol ...... 32
Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của hợp chất PLEA2 .............................................. 33
Hình 3.14. Phổ 1H-NMR giãn rộng 1 của hợp chất PLEA2 ........................... 34
Hình 3.15. Phổ 1H-NMR giãn rộng 2 của PLEA2 .......................................... 35
Hình 3.16. Cấu trúc của hợp chất PLEA2....................................................... 36


- vi-

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng .......................... 21
Bảng 3.2. Kết quả các phân đoạn thu đƣợc từ cột tổng EtOAc ...................... 24
Bảng 3.3. Kết quả các phân đoạn thu đƣợc từ phân đoạn F4 ......................... 27



-1-

MỞ ĐẦU
Lý do lựa chọn đề tài:
Sức khỏe là tài sản quý giá nhất của con ngƣời, là sức sống, là niềm tin
và là sức mạnh mà khơng gì có thể so sánh bằng. Con ngƣời ai cũng có nhiều
mơ ƣớc nhƣng khi ốm đau, bệnh tật thì chỉ cịn một điều ƣớc duy nhất đó là
có sức khỏe. Nhận thức đƣợc tầm quan trọng của sức khỏe, ngay từ xa xƣa cổ
đại, ông cha ta đã nghĩ đến việc chăm lo và bảo vệ sức khỏe, sử dụng các loại
cây có sẵn trong tự nhiên để bồi bổ cũng nhƣ chữa trị bệnh, làm mỹ phẩm,
hoặc sử dụng trong sản xuất nơng nghiệp,…
Ngày nay, việc dùng các lồi thuốc có nguồn gốc tự nhiên ngày càng
đƣợc ƣa chuộng và các cơng trình nghiên cứu về chúng cũng ngày càng phát
triển để có thể khám phá, tiếp cận và tìm ra nhiều hơn nữa công dụng của các
loại cây trong y học một cách nghiêm túc, chi tiết và rõ ràng.Cùng với sự
phát triển của cơng nghệ tổng hợp hóa dƣợc tạo ra các biệt dƣợc, các nhà
khoa học vẫn đang cố gắng tìm hiểu, khám phá các hoạt tính sinh học khác
nhau của các hợp chất có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật khác nhau.
Việt Nam là đƣờng giao lƣu hai chiều giữa thực vật chúng phong phú
của miền Nam Trung Quốc, của Malaysia, của Inđônêxia. Nƣớc ta nằm trong
vùng nhiệt đới, khơng có sa mạc, khơng bao giờ chìm ngập dƣới biển và
khơng bị giá băng phủ xua đuổi các loài nên rất thuận lợi cho sự sinh sôi, nảy
nở của cây cỏ [2]. Với những đặc thù về khí hậu thiên nhiên nhƣ vậy, Việt
Nam có một hệ thực vật phong phú và đa dạng với trên 12.000 lồi, trong đó
có trên 3.200 lồi thực vật đƣợc sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian; mở
ra tiềm năng nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên từ các loài thực vật của Việt
Nam [3].
Chi Pyrrhosia ở Việt Nam có 17 lồi và các lồi này đã đƣợc sử dụng

trong y học cổ truyền [1] mở ra tiềm năng nghiên cứu hóa thực vật về các loài
này.


-2-

Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy đến nay vẫn chƣa có cơng trình
khoa học nào cơng bố về thành phần hóa học của cây Thạch vĩ. Nhằm mục
tiêu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên từ các lồi thực vật của Việt Nam, tơi
lựa chọn đề tài“Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết ethyl
acetate cây Thạch vĩ (Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell) họ Dương xỉ
(Polypodiaceae) trên địa bàn Tỉnh Phú Thọ”.
Mục tiêu của đề tài:
- Điều chế cặn dịch chiết EtOAc (ethyl acetate) của cây Thạch vĩ.
- Khảo sát thành phần hóa học định tính cặn dịch chiết EtOAc của cây
Thạch vĩ bằng sắc ký lớp mỏng.
- Phân lập chất sạch từ các phân đoạn của dịch chiết EtOAc cây Thạch
vĩ.
- Xác định cấu trúc chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Ý nghĩa khoa học:
+Kết quả của đề tài đóng góp thơng tin cho lĩnh vực nghiên cứu hóa học
hữu cơ.
+ Cho biết thành phần hóa học của các loài thực vật.
+Cung cấp dữ liệu về phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của một số hợp chất
thiên nhiên từ thực vật.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Bƣớc đầu định hƣớng cơ sở hóa học trong việc sử dụng cây Thạch vĩ
trong thực tiễn cuộc sống.

+ Góp phần nâng cao kiến thức về kỹ thuật chiết tách, phân lập hợp chất
thiên nhiên, về phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cho sinh viên.
+ Đề tài còn là tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành hóa học và cán bộ
nghiên cứu hóa học hữu cơ.


-3-

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về chi Pyrrhosia
Pyrrhosia Mirb, họ Ráng – Polypodiaceae [Từ chữ Hy Lạp pyros; lửa; ổ
túi bào tử phủ kín mặt dƣới phiến lá, nhìn xa nom nhƣ màu lửa] – Ráng tai
chuột, Thạch Vĩ.
Ổ túi bào tử trịn hoặc thn và xếp thành nhiều hàng, chéo gốc với gân
giữa và gần sát vào nhau, phủ gần kín mặt dƣới của phiến lá. Có hai loại lơng
hình sao, đều có cuống dài.
Gồm khoảng 100 lồi, chủ yếu ở vùng ơn đới và nhiệt đới, một số ít lồi
mọc ở châu Phi và Ơxtrâylia. Ở Việt Nam có 17 lồi [1].
Pyrrhosia clavata (Baker) Ching - Ráng tai chuột. Lồi này có ở Trung
Quốc, Lào và Việt Nam.
Pyrrosia lanceolata(L.) Farw. [P. adnascens (Sw.) Ching] – Ráng tai
chuột thƣờng, Lƣỡi mèo tai chuột. Phân bố Nam Trung Quốc và các nƣớc
nhiệt đới châu Á. Ở nƣớc ta, cây mọc phổ biến ở các miền núi, trung du và
đồng bằng.
Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell. – Thạch vĩ, Ráng tai chuột lƣỡi
dao.Phân bố ở Nhật Bản, Đài Loan, Nam Trung Quốc và Việt Nam. Ở nƣớc
ta, gặp nhiều nơi từ Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Phú Thọ, Hà Tây, đến
Thừa Thiên – Huế và Lâm Đồng.
Pyrrhosia mollis (G. Kunze) Ching – Ráng tai chuột mềm, Thạch vĩ
lông mềm. Phân bố ở Trung Quốc và nhiều nƣớc nhiệt đới châu Á: Ấn Độ,

Mianma, Lào, Việt Nam, Inđônêxia, Phillipin. Ở nƣớc ta, có gặp tại Lào Cai
(Sa Pa), Lâm Đồng (Đà Lạt).
Pyrrhosia petiolosa (Christ) Ching – Ráng tai chuột cuống, Thạch vĩ lá
có cuống. Lồi này có ở Trung Quốc và Việt Nam. Ở nƣớc ta có gặp tại rừng
Vĩnh Phúc (Tam Đảo).
Pyrrhosia piloselloides (L.) M. G. Price [Drymoglossum piloselloides
(L.) C. Presl] – Ráng tai chuột vẩy ốc. Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái


-4-

Lan, Việt Nam, Inđônêxia, Phillippin và Iran. Ở nƣớc ta có gặp từ Lạng Sơn,
Lào Cai, Quảng Bình, Quảng Nam, Bình Định tới Khánh Hịa và Lâm Đồng.
Pyrrhosia porosa (C. Presl) Hovenkamp var. tonkinensis (Giesenh.)
Hovenkamp [P.tonkinensis (Giesenh.) Ching] – Ráng tai chuột Bắc, Thạch vĩ
Bắc Bộ. Loài của Bắc Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở nƣớc ta có gặp tại
Hà Tây (Ba Vì), Lào Cai (Sa Pa) và Ninh Bình (Cúc Phƣơng).
Pyrrhosia sheareri (Baker) Ching – Ráng tai chuột Sheare, Thạch vĩ cụt.
Loài của Trung Quốc và Bắc Việt Nam. Ở nƣớc ta có gặp tại Lai Châu, Lào
Cai, Ninh Bình.
Theo tác giả Võ Văn Chi, một lồi thuộc chi Pyrrhosia của Việt Nam
đƣợc sử dụng làm thuốc trong y học dân giân nhƣ cây Thạch vĩ đƣợc dùng để
làm thuốc lợi tiểu, chữa ung nhọt,…
1.2 Đặc điểm thực vật loài Thạch vĩ
Cây Thạch vĩ (Pyrrhosia lingua (Thunb.) Farwell.) có dạng cây thảo
sống nhiều năm, cao 10 – 30cm, có thân rễ bị dài mang vẩy thon, mép gợn
sóng. Cuống 2 – 10 cm, mảnh, có đốt ở gốc; phiến hơi đa dạng, tròn dài, nhỏ
hay hẹp thon, dài 8 – 18cm, rộng 2 – 5cm, dai, gân phụ rõ, mặt trên gần nhƣ
khơng lơng, mặt dƣới có lơng hình sao vàng hoe.


Hình 1.1. Hình ảnh cây Thạch vĩ


-5-

Ổ bào tử phủ kín mặt dƣới, màu đỏ đậm; bào tử xoan, nâu nhạt.
Cây phụ sinh trên thân cây và bám trên đá trong rừng ở độ cao 100 –
1800m. Có nơi cây mọc thành những đám rất lớn [1].
1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Pyrrhosia
Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy đến nay vẫn chƣa có cơng trình
khoa học nào cơng bố chi tiết về thành phần hóa học của cây Thạch vĩ.
Theo Từ điển thực vật thông dụng của tác giả Võ Văn Chi chỉ ra cho
thấy cây Thạch vĩ có chứa steroid nhƣ β – sitosterol (1) [1].

1.4 Sơ lƣợc về lớp chất steroid
Steroid là nhóm hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi trong giới động vật
và

thực

vật,

với

cấu

trúc

tổng


quát

là

hệ

thống

vòng

cyclopentanohydrophenanthrene [9] hoặc trong một vài trƣờng hợp hiếm gặp
là dạng biến đổi của vịng nói trên.

Hình 1.2. Cấu tạo khung steroid
Một trong các steroid đƣợc biết đến sớm nhất là cholesterol (2). Hợp
chất này đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1770 nhƣng mãi đến tận những
năm 1920 mới xác định đƣợc cấu trúc của nó [9].


-6-

(2)
Nhiều hợp chất steroid trong thiên nhiên là các hormone nhƣ hormone
giới tính nam testosterone (3), hormone giới tính nữ estradiol (4) [9].

(3)

(4)

Trong các phân tử steroid các vòng A và B nối với nhau theo kiểu cis

hoặc trans tƣơng tự cis/trans-Decalin (5), (6).

(5)

(6)
Phần lớn các steroid trong thiên nhiên có dạng lập thể của các vịng
A/B-H9/C10-B/C-C/D ở dạng trans-anti-trans-trans hoặc cis-anti-trans-trans.


-7-

Hình 1.3. Cấu trúc khung steroid
Về mặt cấu dạng, các steroid thƣờng có các vịng A, B, C ở dạng ghế
(Hình 1.4.) tƣơng tự cấu dạng của cis/trans-Decalin [9].

Dạng 5

Dạng 5

Hình 1.4. Cấu dạng của steroid


-8-

Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp giống nhƣ triterpene với chất liệu cơ
bản là pharnesyl pyrophotphat.
Quá trình sinh tổng hợp để tạo thành các steroid hoặc các triterpen năm
vòng đƣợc trình bày nhƣ sau: giai đoạn đầu tiên của sự sinh tổng hợp là do
enzyme monooxygenase oxid hóa hợp chất squalene tạo thành 2,3–
epoxysqualene, tiếp theo là sự đóng vòng. Tùy theo việc các phân tử squalen

gấp khúc, xếp nếp, với cấu hình trong khơng gian theo kiểu dạng ghế hoặc
dạng tàu mà khi đóng vịng, sẽ tạo ra sản phẩm có dạng khác nhau. Khi phân
tử squalene gấp khúc để bố trí các vịng ABCD theo kiểu ghế – tàu – tàu –
ghế sẽ tạo cycloartenol, từ đó có thể biến đổi thành phytosterol và các dẫn
xuất steroid. Còn khi phân tử squalen gấp khúc các vòng ABCD theo kiểu ghế
– ghế – tàu – tàu sẽ tạo ra triterpen năm vòng.
Các phytosterol là đặc trƣng của giới thực vật. Ở giới động vật, “sự đóng
vịng” theo kiểu khác để tạo thành lanosterol rồi thành cholesterol.
Trong quá trình sinh tổng hợp các phytosterol, cịn có thêm sự hiđrogen
hóa một phần, sự tạo ra thêm các chức alcol, sự mất đi ba nhóm metyl (giai
đoạn chung của tất cả các sterol), “sự ankyl hóa” để gắn thêm nhánh hở ở
cuối mạch, tại carbon C–24, một nhánh nhỏ metyl hoặc etyl. Nhánh nhỏ này
giúp phân biệt các loại phytosterol với các sterol động vật. Ở các loại nấm,
“sự đóng vịng” theo kiểu để tạo thành lanosterol, cũng đƣợc ankyl hóa tại C–
24 giống nhƣ phytosterol nhƣng vẫn giữ khung sƣờn của lanosterol.
Các phytosterol đƣợc gặp nhiều nhất trong tự nhiên là stigmasterol, các
β- và γ-sitosterol.
Trong giới thực vật, có loại phytosterol mang thêm những vòng phụ: các
sapogenin steroid của họ Khoai ngọt (Dioscoreaceae), các alkaloid steroid họ
Cà

(Solanaceae),

phần

(Scrophulariaceae)[5].

genin

trợ


tim

của

họ

Hoa

mõm

chó


-9-

CHƢƠNG 2 . ĐỐI TƢỢNG, VẬT LI ỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Cây Thạch vĩ đƣợc thu hái tại Thị trấn Lâm Thao – Huyện Lâm Thao –
Tỉnh Phú Thọ vào tháng 6/2015.

Hình 2.1. Cây Thạch vĩ (tại Lâm Thao)
2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị
2.2.1 Nguyên vật liệu
2.2.1.1 Mẫu nghiên cứu
Dịch chiết EtOAc của cây Thạch vĩ.
2.2.1.2 Hóa chất
Dung mơi đƣợc sử dụng nhƣ n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, acetone
đều là các hóa chất kỹ thuật của Việt Nam, Hàn Quốc đƣợc chƣng cất lại

trƣớc khi sử dụng.
2.2.2 Thiết bị nghiên cứu
Quá trình ngâm chiết đƣợc thực hiện trong các bình thủy tinh có dung
tích 5 lít. Sau q trình ngâm chiết, dung mơi đƣợc thu hồi bằng máy cất quay
chân khơng IKA®RV 10 của Anh.


-10-

Hình 2.2.Máy cất quay chân khơng
Việc tinh chế các hỗn hợp sản phẩm đƣợc thực hiện bằng sắc ký cột siica
gel và sắc ký lớp mỏng. Với sắc ký cột silica gel thì tùy vào lƣợng mẫu chất ta
sử dụng các cột sắc ký có kích cỡ khác nhau: 1; 2; 2,5; 4; 10. Chất nhồi
cột sắc ký là silica gel 60 (0,063 – 0,200 mm) (70 – 230 mesh astm) đều là
của Merck còn sắc ký lớp mỏng sử dụng bình sắc ký lớp mỏng Camag của
Đức và bản mỏng sắc ký tráng silicagel 60 F254 trên tấm nhôm 20 × 20 cm của
Đức.

Hình 2.3. Cột sắc ký với kích thước khác nhau


-11-

Dung môi đƣợc chƣng cất trƣớc khi sử dụng bằng bộ chƣng cất dung
mơi của hãng IKA.

Hình 2.4. Bộ chưng cất dung mơi
Hiện màu dƣới bƣớc sóng UV 254, 366 nm đƣợc thực hiện trên hệ thống
đèn UV CAMAG.


Hình 2.5. Máy soi UV


-12-

2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết
Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thƣờng là những chất liệu đại phân
tử tƣơng đối trơ, khơng hịa tan trong dung môi hữu cơ nên việc khảo sát hợp
chất tự nhiên chính là việc chiết lấy và khảo sát các chất thứ cấp có trọng
lƣợng phân tử nhỏ. Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình
phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc
tính của chất thứ cấp có trong cây mà ngƣời khảo sát mong muốn tách cơ lập:
cấu trúc hóa học đa dạng, tính chất phân cực khác biệt, … Muốn chiết hợp
chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung mơi phù hợp có độ phân cực tăng dần (nhexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, …), sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp
bằng cách ngâm dầm rồi lọc. Sau khi lọc, phần bã cây hoặc sinh khối cịn lại
đƣợc lọc bỏ. Dung mơi qua lọc đƣợc thu hồi bằng máy cô quay chân không ở
nhiệt độ thấp khoảng 30-45oC vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hƣ hại
một vài hợp chất kém bền nhiệt [5].

Hình 2.6.Sơ đồ chung của phương pháp ngâm chiết


-13-

2.3.2 Phương pháp sắc ký
2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

M: Hỗn hợp chất ban đầu
A, B: Các vệt chất đƣợc phân tách

Hình 2.7. Minh họa sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều
chế đều đƣợc thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254
của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung mơi triển khai là 1 hoặc hỗn hợp
một số dung môi thông dụng nhƣ n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, acetone, MeOH.
Thuốc thử hiện màu đƣợc sử dụng là ceri sulfate.
Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký silica gel nói chung là dựa trên
khả năng hấp phụ khác nhau của các chất trên silica gel (pha tĩnh) sẽ đƣợc
dung môi rửa giải (pha động) khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải
hấp) ở các vị trí khác nhau trên đƣờng đi của dung mơi. Chất có độ phân cực
kém hơn sẽ đi lên nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn [8].
Độ linh động của chất đƣợc đánh giá thông qua hệ số Rf.
Rf =

ã
ã

đ
đ

Trong trƣờng hợp minh họa ở hình vẽ trên: Rf(A) =

ơ

; Rf(B) = .

Hai chất A, B đƣợc coi là tách riêng khỏi nhau khi triển khai sắc ký
TLC, Rf(A) ≠ Rf(B). Từ hệ dung môi khi khảo sát TLC làm cơ sở để lựa chọn
hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel.
2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột



-14-

Hình 2.8. Minh họa sắc ký cột
Sắc ký cột thƣờng, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200 mm
(70- 230 mesh astm) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ
dung môi nhƣ n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/acetone,
CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp.
Nguyên lý của phƣơng pháp sắc ký cột silica gel cũng tƣơng tự phƣơng
pháp sắc ký lớp mỏng ở trên; chỉ khác là trong sắc ký cột silica gel dung môi
đƣợc di chuyển từ trên đỉnh cột đi xuống và hệ dung môi đƣợc lựa chọn từ
TLC sẽ đƣợc tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung mơi duy nhất.
Chất có độ phân cực kém hơn sẽ đƣợc rửa giải trƣớc rồi đến chất có độ phân
cực cao hơn.
Kích cỡ của cột sắc ký tùy thuộc vào lƣợng mẫu chất cần phân tích.
2.3.3 Phương pháp kết tinh
Kết tinh là phƣơng pháp đơn giản nhƣng rất hiệu quả để tinh chế các
chất hữu cơ ở thể rắn.
Nguyên tắc là dựa vào sự khác nhau về độ tan của các chất (chủ yếu là
các chất rắn) trong một dung mơi thích hợp, và sự khác nhau về độ tan ở nhiệt
độ khác nhau của một số chất trong dung mơi đó. Việc lựa chọn dung môi rất


-15-

quan trọng, sao cho chất hữu cơ cần tinh chế tan nhiều khi đun nóng và ít tan
khi để nguội, cịn tạp chất thì hoặc là tan tốt hơn sản phẩm chính hoặc là tách
ra từ dung dịch trƣớc hoặc sau hẳn sản phẩm chính. Thƣờng thƣờng phải kết
tinh lại nhiều lần và sử dụng những dung môi khác nhau [6].

2.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)
Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân dựa trên
tƣơng tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trƣờng ngoài [7].
Phổ cộng hƣởng từ nhân proton (1H-NMR):
- Số lƣợng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học,
H) xác nhận các loại proton khác nhau và môi trƣờng bao quanh mỗi proton
trong phân tử.
- Vị trí của tín hiệu cho biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc
một, bậc hai, bậc ba,… Các proton khác nhau này có các mơi trƣờng electron
bao quanh khác nhau, và chính mơi trƣờng electron bao quanh xác định
proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ.
Trên phổ 1H-NMR tín hiệu các proton đƣợc ghi nhận thơng qua độ
chuyển dịch hóa học  ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nội
chuẩn TMS đƣợc gán  = 0 ppm.

Hình 2.9. Độ chuyển dịch hóa học của proton


-16-

- Cƣờng độ tín hiệu cho biết số proton cùng loại.
- Sự tƣơng tác (tách vạch phổ) và hằng số tƣơng tác spin – spin (J) cho
biết proton nào tƣơng tác với proton nào.
+ Sự tách vạch phổ gây nên bởi sự tƣơng tác tƣơng tác J. Sự tách vạch
phản ánh môi trƣờng bao quanh của các proton đang hấp thụ không phải đối
với các electron mà đối với các proton khác ở gần bên cạnh. Số vạch phổ
đƣợc tách theo qui tắc n+1 với n là số proton có tƣơng tác. Cƣờng độ các vạch
phổ đƣợc tách tỉ lệ theo qui tắc tam giá Pascal.

Hình 2.10. Sự tách vạch phổ

+ Hằng số tƣơng tác J cho biết một cách chính xác loại thơng tin về cấu
trúc phân tử. Hằng số J không phụ thuộc vào từ trƣờng cảm ứng. Giá trị hằng
số J đƣợc đo bằng Hz luôn bằng nhau dù từ trƣờng ngoài thế nào. Độ lớn của
hằng số tƣơng tác phụ thuộc vào mối liên quan cấu trúc giữa các proton có
tƣơng tác.

Hình 2.11. Ví dụ minh họa về sự tách vạch phổ