BÀI THU HOẠCH
Tetracycline
1. Đại cương
(*) Tetracyclin được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1953 bằng phương pháp khử
clo của clotetracyclin. Sau này người ta tìm thấy chủng xạ khuẩn Str. Viridifaciens
có khả năng sinh tổng hợp ra tetracyclin nhưng thực tế trong sản xuất sử dụng
Str. Aureofaciens trong điều kiện ni cấy đặc biệt có bổ sung thêm các chất ức
chế clo hóa.
(*) Cơ chế tác dụng :
● Tetracyclin là một kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn do ức chế
quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Cơ chế tác dụng của tetracyclin
là do khả năng gắn vào và ức chế chức năng ribosom của vi khuẩn, đặc
biệt là gắn vào đơn vị 30S của ribosom. Do vậy, tetracyclin ngăn cản quá
trình gắn aminoacyl t - RNA dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp protein.
● Khi vi khuẩn kháng tetracyclin, vị trí gắn tetracyclin trên ribosom bị biến
đổi. Vì vậy, tetracyclin khơng gắn được vào ribosom của vi khuẩn và mất
tác dụng.
2. Đặc điểm.

(*) Công thức cấu tạo chung :Các kháng sinh nhóm tetracyclin có bộ khung chính
là octahydro naphtaxenic:

1


(*)Tính chất lý hóa:
 Các Tetracyclin là chất bột màu vàng, ít tan trong nước, tan trong dung dịch
có tính base hay acid. Tetracyclin base là một kết tinh vàng sẫm, ít tan trong
nước và các dung mơi hữu cơ. Dạng base này không bền nên thực tế sản
xuất tetracyclin clohydrat là bột vàng sang tan trong nước vừa bền vững vừa
dễ sử dụng.

 Tính lưỡng tính : Do trong phân tử của các KS nhóm tetracyclin có chứa
nhóm dimetylamino có khả năng tạo muối với acid và các nhóm hydroxyl có
khả năng tạo muối với kiềm hoặc với Ca2+ , Mg2+ ( tạo tetracyclinat ) .
 Không bền vững với các tác nhân oxy hóa ngay cả oxy trong khơng khí .
Trong dung dịch kiềm dễ bị oxy hóa tạo dẫn chất có màu thẫm . Bị phân hủy
bởi ánh sáng .
 Phát huỳnh quang trong môi trường kiềm.
 Các cyclin cho phản ứng alcaloid với acid picric, iodomercurid, iodoiodid...
 Tan được trong dung dịch kiềm và tạo tạo màu với Fe 3+.
 Kết hợp với các ion hóa trị 2 và 3, thường nhất là Fe 3+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Zn2+,
tạo các phức chelat, kém hấp thu.
 Kém bền với nóng ẩm và ánh sáng → phân hủy thuốc, tạo thành
anhydrotetracyclin, 4-epitetracyclin, anhydro 4-epi-tetracyclin có độc tính
cao trên thận

2


 Dễ bị đồng phân hóa ( do cấu trúc hydro naphtaxenic ) trong dung dịch
nước ở pH 2,0 – 6,0 tạo ra epitetracyclin khơng có tác dụng kháng sinh .
Hiện tượng đồng phân hóa xảy ra nhanh hơn ở tetracyclin và clotetracyclin .

3. Điều chế.
 Phương pháp vi sinh: từ các Streptomyces khác nhau
 Phương pháp bán tổng hợp:
Các chất bán tổng hợp thường đi từ các chất thiên nhiên (clotetracyclin hoặc
tetracyclin), trong đó:
Vị trí 2: thay thế trên nhóm carboxamid (rolitetracyclin) Vị trí 6: loại nhóm
hydroxyl hoặc methyl (metacyclin,
minocyclin, doxycyclin)

Vị trí 7: loại nhóm halogen, amin hóa (minocyclin) Vị trí 9: amin hóa (amicyclin)
 Tổng hợp tồn phần
4. Sinh tổng hợp Tetracyline.
Tetracycline

Dữ liệu dược động học
3


Sinh khả dụng

75%

Chủn hóa dược phẩm

Khơng

Chu kỳ bán rã sinh học

8–11 hours, 57–108 giờ (hỏng thận)

Bài tiết

Nước tiểu (>60%), thận

Công thức hóa học

C22H24N2O8

Khối lượng phân tử


444.435 g/mol

a. Chủng giống
 Khả năng sinh tổng hợp các kháng sinh nhóm tettracyclin tập trung chủ
yếu ở xạ khuẩn, phần lớn xạ khuẩn có các đặc điểm sau:
•

Hiếu khí

•

Ưa ẩm, độ ẩm thích hợp 40-50%

•

Nhiệt độ thích hợp sinh trưởng 27-28 °C ,

pH từ 6,6-7
 Các giống xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin gồm những chủng
Streptomyces rimosus, str. Aureofaciens, str. Platensis, str. Gilvus…
 Cơ chế sinh tổng hợp các tetracyclin rất phức tạp với sự chuyển hóa qua
nhiều giai đoạn trung gian khác nhau (cơ chế sinh tổng hợp clotetracyclin
gồm có 72 phản ứng). q trình sinh tổng hợp này có thể chia làm ba giai
đoạn chính:
1.

Sinh tổng hợp chuỗi oligoketidamit mạch thẳng từ các nguồn

hydrocacbon.


4


2.

Khép vòng chuỗi oligoketidamit tạo thành bộ khung pretetramits (hoặc 6-

metylpretetramit) .
3.

Chuyển tiếp mạch pretetramit (hoặc 6-metylpretetramit) để tạo thành các

tetracyclin.

b. Đặc điểm quá trình lên men
Các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin là những chủng vi sinh
vật hiếu khí nên q trình ni cấy cần lắc hoặc khuấy trộn kèm theo sục khí
liên tục với lưu lượng khoảng 1 VVM ; cánh khuấy có đường kính phù hợp, thể
tích nồi lên men phù hợp
=>Việc đảm bảo thông khí hợp lý và liên tục trong suốt q trình lên men có
ảnh hưởng rất lướn đến hiệu suất sinh kháng sinh, đặc biệt là trong 6 đến 12
giờ đầu tiên – q trình có thể bị hủy hồn tồn nếu dừng oxy trong 5 phút. pH
tối ưu cho phản ứng là 6,6 – 7,2.
Mỗi bào tử nảy 2 -4 chồi tạo thành hệ sợi. kháng sinh nằm trong sinh khối xạ
khuẩn. nhiệt đọ ni cấy thích hợp là 27 – 28 độ C.
Thời gian lên men thường là 110 đến 140 giờ. Do kháng sinh là sản phẩm bậc 2,
cần thời gian để tổng hợp. Nên được thu vào cuối pha cân bằng.

5



c. Nhu cầu dinh dưỡng


Nguồn hydrat carbon: chủ yếu là bột ngô, bột mỳ, tinh bột khoai tây hoặc
tinh bột ngơ. Ngồi ra người ta cịn bổ sung vào mơi trường nuôi cấy một số
loại đường như glucose hoặc maltose. Các chủng xạ khuẩn nhóm tetracyclin
khơng có khả năng phân giải saccharose và h.



Nguồn nito: môi trường nuôi cấy cần có cả nguồn nito vơ cơ và hữu cơ như
cao ngô, bột đậu tương, bột lạc..



Nguồn phospho: đối với quá trình sinh tổng hợp tetracyclin hàm lượng
phosphor vơ cơ hịa tan trong môi trường lên men (chủ yếu từ cao ngơ) có ý
nghĩa rất quan trọng đến hiệu suất tạo kháng sinh:
• Thiếu phospho giống phát triền kém và hiệu suất lên men thấp.
• Thừa phosphor giống phát triển nhanh nhưng hoạt lực kháng sinh giảm
đáng kể do tích tụ acid acetic và aicd pyruvic trong môi trường => để tránh
thừa phosphor người ta bổ sung CaCO3 để tạo thành các phosphat canxi
khơng tan.
• Ngồi ra cịn có tác dụng giảm nồng độ các kháng sinh hòa tan để tránh
độc tính của kháng sinh đối với giống.

 Nguồn kim loại vi lượng: các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nhóm tetracyclin
cũng cần một số kim loại như Fe, Mn, Mg, Cu…và thường được bổ sung dưới

dạng muối sulfat.
(*) Nếu môi trường có cao ngơ, bột đậu, bột lạc.. thì khơng cần bổ sung vì bản
thân các loại nguyên liệu này đã có sẵn các muối kim loại.
(*) Cần chú ý đặc biệt đến hàm lượng sắt vì nếu thừa sắt sẽ kết hợp với
tetracyclin tạo ra những phức chất không có hoạt tính kháng sinh.

6


d. Nguyên tắc chiết xuất từ môi trường lên men
Các kháng sinh nhóm tetracylin có tính chất lượng tính nên có thể dùng cả 3
phương pháp sau để chiết tách sản phẩm và khỏi dịch lên men:
 Chiết bằng dung mơi hữu cơ có chất mang: isooctanol kèm theo chất mang
là acid oxalic,dung môi hữu cơ như methyalkyl.
 Chiết bằng phương pháp kết tủa:dùng thuốc nhuộm acid arylsulfonic
 Chiết bằng phương pháp trao đổi ion: nhựa trao đổi ion sulfocationit
(*) Tùy theo loại kháng sinh cụ thể, độ tình khiết cần thiết của sản phẩm mà
người ta lựa chọn phương pháp thích hợp.
e. Quy trình lên men


Điều kiện của q trình lên men tạo tetracyclin bởi chủng Str.
Aureofaciens gần giống với lên men tạo clotetracyclin. Tuy nhiên điểm khác
biệt quan trọng nhất là thành phần môi trường nuôi cấy. Dựa vào thành phần
môi trường cung cấp cho xạ khuẩn mà người ta có thể định hướng được sản
phẩm cuối cùng của q trình lên men.



Str. Aureofaciens trong điều kiện ni cấy bình thường tạo ra

clotetracyclin, nhưng khi ni dưỡng trong điều kiện đặc biệt có chất ức chế
q trình clo hóa xạ khuẩn sẽ tạo ra chủ yếu tetracyclin.



Để nâng cao hiệu suất sinh rổng hợp tetracyclin phải loại hết những vết Clra khỏi mơi trường. trong phịng thí nghiệm, để loại ion Cl- có thể dùng muối
bạc, tuy nhiên phương pháp này không thực tế.



Hiện nay người ta dùng những chất ức chế q trình clo hóa như brom,
iod, thiocyanid… Tuy nhiên nếu tăng hàm lượng bromid trong môi trường xạ
khuẩn sẽ tổng hợp ra cả 7 – bromtetracyclin và chất ức chế sinh tổng hợp
tetracyclin.

7


=> Vì vậy, ngồi NaBr cịn thêm các chất ức chế q trình clo hóa khác như 2 –
mercaptobenzothiazol, 2 – thiouracyl, dẫn xuất của dithiocarbamic… .Cơ chế tác
dụng của các chất này đến nay chưa được rõ vì chúng khơng có rác dụng cạnh
tranh với ion Clo, có thể sự có mặt của nhóm sulfuhydryl –SH có tác dụng kích
thích phản ứng oxy khử làm loại Clo ra khỏi phân tử kháng sinh.

f. Quy trình chiết tetracyclin



Tetracyclin có thể được chiết xuất bằng cả ba phương pháp.
Ở đây giới thiệu phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ:


Dịch lên men xong bơm vào thùng chứa, hạ nhiệt độ xuống 15 độ C. thêm aicd
oxalic và hạ pH xuống 2,5 đến 3. Thêm Na2CO3 khuấy pH = 3,5. Thêm
K4Fe(CN)6 khuấy tiếp 15 phút để loại sắt. lấy mẫu phân tích Ca++ và Fe++: yêu
cầu Ca++ <= 0,4 – 0,6 g/l, Fe++ khơng có. Trong thiết bị chiết thêm hỗn hợp
isooctanol có chứa 1,5 đến 2,5% acid oleic tỉ lệ dung môi/dung dịch kháng sinh
là 1:3 đến 1:4, thêm NH4OH 5 phần trăm vào và khuấy pH = 9 – 9,5. Tetracyclin
chuyển sang dung môi, dịch thải chuyển về phân xưởng thu hồi dung môi. Dịch
chiết isooctanol bơm vào thiết bị chứa cùng acid oxalic (dung dịch 5 phần trăm)
thêm vào với lượng 0,5 đến 0,6 phần trăm theo tỉ lệ dịch kháng sinh. Tại đây sẽ
loại đi ion canxi và các kim loại khác dạng oxalate. Ly lọc hút chân khơng thì kết
tinh tetracyclin base bằng dung dịch NH4OH 10%. Khuấy để kết tinh ở 15 độ C
và pH 3,9-4,5. Ly tâm thu sản phẩm và sấy khô bằng máy sấy tầng sôi. Hiệu suất
đạt 70-75%.

8


(*) Quy trình chiết xuất Tetracyclin bằng DM hữu cơ

4. Sinh tổng hợp Clotetracyclin
a. Đặc điểm.


Clotetracyclin cịn có tên khác là biomycin, aureomycin được tìm ra lần đầu
năm 1948 trong môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn Str.aureofaciens.



Muối clohydrat của clotetracyclin là dạng bột tinh thể màu vàng, không

mùi, vị đắng, bền vững trong khơng khí khơ ở nhiệt độ phịng, nếu để ra ánh

sáng thì mất dần hoạt tính. Clotetracyclin bền trong dung dịch acid (pH 0,62,6), không bền trong dung dịch kiềm.

9


b. Điều kiện lên men


Môi trường lên men phải cung cấp ion clo để tạo clotetracyclin. Thích hợp
nhất là amoni clorid, natri clorid hoặc natri nitrat.



Các tiền chất sử dụng trong sinh tổng hợp clotetracyclin là các hợp chất
mạch vòng, thích hợp nhất là benzylthioxyanid (C6H5CH2SCN) với hàm lượng
1-3 mg/l mơi trường có thể làm tăng hiệu suất 30-40%.

c. Phương pháp chiết xuất


Có thể sử dụng phương pháp kết tủa để thu clotetracyclin từ dịch lên men
theo sơ đồ sau:

(a) Quy trình thu clotetracyclin tinh khiết
(b,c) Quy trình thu biovit
(*) Quy trình xử lý dịch lên men clotetracyclin

•


Clotetracyclin có hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp 4 lần tetracyclin song
độc tính cao hơn nên hiện khơng dùng trong y học.

•

Hiện tại, clotetracyclin được sản xuất dạng thô dùng trong chăn nuôi gia
súc, gia cầm.

10


5. Sinh tổng hợp Oxytetracyclin

a. Đặc điểm :
•

Oxytetracyclin được phát hiện lần đầu vào năm 1950 trong môi trường
nuôi cấy Str. rimosus.

•

Hiện nay dùng chủ yếu trong thú y và chăn ni với các sản phẩm: Teravit,
terramycin, biostat

•

Tính chất: Oxytetracyclin base là bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị
đắng.


b. Chủng giống: Chủng giống: Str. rimosus, Str. griseoflavus, Str. armilatus
c. Mơi trường lên men (%) :
• Bột ngơ 6,0
• Cao ngơ 0,5
• (NH4) 2SO4 0,6
• CaCO3 0,6
• CoCl2. 6H2O 0,01
• pH sau khử trùng 6,8 - 7,0
• Nhiệt độ ni cấy: 28•C
• Thời gian lên men: 120 - 144h
• Cung cấp khí vơ trùng: 0,8 - 1 thể tích khơng khí/ 1 thể tích mơi
trường/phút, áp suất nồi lên men: 0,3 - 0,4 at
d. Điều kiện lên men:
11


• Ni cấy chìm, khuấy trộn có cấp khi.
• Nhiệt độ lên men: 28•C, cấp khí lưu lượng 1 VVM
• Thời gian: 120 - 144h
• Q trình lên men xảy ra theo 2 pha: Trong 60h đầu xạ khuẩn phát triển
mạnh, 60h tiếp khuẩn ty đứt ra, nảy mầm tạo hệ khuẩn ty mảnh hơn => là
pha sinh tổng hợp ra kháng sinh.
f. Quy trình chiết xuất kháng sinh:
 Phương pháp trao đổi ion.

Bước 1: Tạo dịch lọc chứa kháng sinh: Dịch lên men để ở 15•C, loại sắt bằng
K4Fe(CN) 6, loại Ca++ bằng acid oxalic. Yêu cầu: Ca++ <= 0,4 - 0,6 g/l, Fe++ khơng
có. Lọc dịch.
Bước 2: Hấp phụ trên nhựa: Làm lạnh dịch chứa kháng sinh đến 7 - 8•C, loại
protein và các tạp khác.bơm dịch qua cột trao đổi ion. Các cation tetracyclin thay

thế cation hydro của phân tử nhựa.
Bước 3: Phản hấp phụ: Dùng dung dịch đệm borat amoni (với lượng amoniac vừa
đủ để thay thế cation kháng sinh trên nhựa và hòa tan oxytetracyclin được đẩy
ra).
Bước 4: Kết tinh Oxytetracyclin base: Acid hóa dịch phản hấp phụ. Kết tinh 2h ở
10•C, ly tâm lấy tinh thể.
Bước 5: Tinh chế: Hòa tan oxytetracyclin base trong HCl 0,1N. Tẩy màu, lọc, thu
dịch chứa oxytetracyclin từ 30 - 40 g/l. Điều chỉnh bằng NH4OH, kết tinh. Ly tâm
lấy tinh thể. Sấy. Thành phẩm đạt khoảng 900 UI/mg.
Bước 6: Hoàn nguyên nhựa: Bằng NaOH 3N và HCl 1N

12


(*)Các công đoạn chiết xuất Oxytetracyclin:

6. Sản xuất một số Tetracyclin bán tổng hợp
a. Các kháng sinh là dẫn xuất amid
• Từ Tetracyclin, cho tác dụng với formaldehyd và 1 amid tương ứng, sẽ tạo
nên 1 kháng sinh mới như: Rolitetracyclin, linecyclin, mepicyclin.
• Ví dụ:

b. Các kháng sinh được thay thế các nhóm chức ở vị trí số 6 và 7.
• Ưu điểm: Dùng liều thấp hơn nên ít độc hơn, tác dụng kéo dài.
• Ba đại diện tiêu biểu: Methacyclin (1960), docyclin (1962) - được dùng phổ
biến hơn cả dưới dạng monohydrat hay hyclat, minocyclin (1967).
13


• Methacyclin: bán tổng hợp từ 6 - deoxy - oxytetracyclin.


c. Các kháng sinh được thay thế các nhóm chức ở vị trí 6 và 7.
• Doxycyclin: bán tổng hợp từ methacyclin :

• Minocyclin: bán tổng hợp từ 6 - demethyl – tetracyclin :

14