ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
--------

PHẠM NHƢ QUỲNH

SÀNG LỌC CHỦNG VI SINH VẬT
SINH ENZYME MANGANESE PEROXIDASE
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên, 2022


i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
--------

PHẠM NHƢ QUỲNH

SÀNG LỌC CHỦNG VI SINH VẬT
SINH ENZYME MANGANESE PEROXIDASE
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Khá

Thái Nguyên, 2022


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của thầy giáo:
TS. Trịnh Đình Khá. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và
chưa được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn
đều ghi rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể đều được ghi nhận
trong lời cảm ơn.
Thái Nguyên, ngày tháng 11 năm 2022
Học viên

Phạm Nhƣ Quỳnh


iii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên,
Phòng Đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi
trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Trân trọng cảm ơn TS. Trịnh Đình Khá đã dành nhiều thời gian chỉ bảo cho tôi
những kiến thức và kinh nghiệm q báu, giúp tơi hồn thiện đề tài này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ, giảng viên của trường Đại học
Khoa học - Đại học Thái Nguyên và trường Đại học Thủy lợi cùng các tổ chức cá
nhân, đoàn thể, và các em sinh viên đã giúp đỡ tơi trong q trình nghiên cứu, khảo

sát, thu thập dữ liệu liên quan đến đề tài.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ Giáo dục và Đào tạo ―Nghiên
cứu tạo enzyme manganese peroxidase tái tổ hợp có hoạt tính phân hủy độc tố nấm
mốc aflatoxin B1‖ Mã số: B2020-TNA-14.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tơi ln nghiêm túc và cố gắng hết mình, tuy
nhiên chắc chắn khơng thể tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được ý kiến
đóng góp của những nhà Khoa học, Chun gia, Thầy, Cơ giáo và đồng nghiệp để đề
tài được hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày ... tháng 11 năm 2022
Tác giả luận văn

Phạm Nhƣ Quỳnh


iv

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài ..................................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................2
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................4
1.1. Enzyme Manganese peroxidase .......................................................................4
1.1.1. Khái niệm ......................................................................................................4

1.1.2. Cấu trúc và tính chất ....................................................................................5
1.1.3. Cơ chế xúc tác .............................................................................................. 6
1.1.4. Enzyme MnP oxy hóa có chứa các hợp chất phenolic và các hợp chất
nonphenolic ............................................................................................................6
1.2. Vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase ............................................7
1.2.1. Nấm ...............................................................................................................7
1.2.2. Vi khuẩn ........................................................................................................9
1.2.3. Xạ khuẩn .....................................................................................................10
1.3. Aflatoxin và phƣơng pháp khử độc tố Aflatoxin .........................................11
1.3.1. Độc tố Aflatoxin ..........................................................................................11
1.3.2. Khử độc tố bằng phương pháp phi sinh học ..............................................19
1.3.3. Khử độc tố bằng phương pháp sinh học .....................................................23
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................27
2.1. Vật liệu .............................................................................................................27
2.1.1. Mẫu vật và Chủng vi sinh vật .....................................................................27
2.1.2. Thiết bị ........................................................................................................27
2.2. Hóa chất ...........................................................................................................28
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ...............................................................................28
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu đất ...........................................................................28


v

2.3.2. Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật ...................................................28
2.3.3. Phương pháp sàng lọc chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese
peroxidase .............................................................................................................29
2.3.4. Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase
lớn nhất. ................................................................................................................30
2.3.5. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật .........................31
2.3.6. Khảo sát một số yếu tổ ảnh hướng đến sự sinh tổng hợp enzyme MnP của

chủng nấm Pl3 ......................................................................................................31
2.3.7. Khảo sát khả năng phân hủy độc tố Aflatoxin của enzyme Manganese
peroxidase .............................................................................................................32
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu ..........................................................................33
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 34
3.1. Phân lập, sƣu tập và nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật ....34
3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất .......................................................34
3.1.2. Các chủng vi sinh vật phân lập từ một số mẫu thực phẩm.........................36
3.1.3. Sưu tập một số chủng nấm ..........................................................................37
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp MnP .................39
3.2.1. Định tính hoạt tính MnP .............................................................................39
3.2.2. Định lượng hoạt độ MnP ngoại bào ........................................................... 41
3.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh tổng hợp enzyme MnP của
chủng nấm Pl3 ........................................................................................................42
3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ............................................................. 42
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ Glucose ............................................................... 42
3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NH4NO3 ............................................................... 44
3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ pH ........................................................................46
3.4. Khả năng phân hủy độc tố Aflatoxin của enzyme MnP từ chủng Pl3 ..........47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................49
1. Kết luận ...............................................................................................................49
2. Kiến nghị .............................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................50


vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFB1


aflatoxin B1

CTAB

Đệm cetyltrimethyl ammonium bromide

EtBr

Ethidium bromide

LB

Luria Bertani

MnP

Manganese peroxidase

PDA

Potato Dextrose Agar


vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Tính chất lý – hóa chủ yếu của các aflatoxin .............................................16
Bảng 1.2: Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA ......................18
Bảng 1.3: Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam .........19
Bảng 1.4: Hàm lượng Afllatoxin sau khi xử lý bằng Metylamin và xử lý nhiệt đơn

giản .............................................................................................................................. 22
Bảng 2.1: Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu ..............................................27
Bảng 3.1: Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật từ 03 mẫu đất ............................... 35
Bảng 3.2: Một số đặc điểm hình thái các chủng vi sinh vật từ mẫu thực phẩm .........36
Bảng 3.3: Một số đặc điểm hình thái của 08 chủng nấm sưu tập ............................... 38
Bảng 3.4: Kích thước vịng hoạt tính MnP của các chủng vi sinh vật trên môi trường
chọn lọc .......................................................................................................................41
Bảng 3.5: Hoạt độ enzyme MnP .................................................................................41
Bảng 3.6: Hoạt độ enzyme MnP của chủng Pl3 ở các thời gian nuôi cấy ..................42
Bảng 3.7: Hoạt độ enzyme MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ Glucose ....................43
Bảng 3.8: Hoạt độ enzyme MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ NH4NO3 ...................45
Bảng 3.9: Hoạt độ enzyme MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ pH ............................ 47


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử và vị trí hoạt động của MnP ..............................................5
Hình 1.2: Chu trình xúc tác của MnP ............................................................................6
Hình 1.3: Nấm Aspergillus flavus và nấm Aspergillus parasiticus ............................ 12
Hình 1.4: Cấu trúc các loại Aflatoxin .........................................................................14
Hình 1.5: Đường cong hấp thụ UV của các aflatoxin B1, G1 và G1 ..........................15
Hình 1.6: Chuyển hóa Aflatoxin B1 thành hydroxi-dihydro-aflatoxin B1 và là
aflatoxin Ro .................................................................................................................25
Hình 3.1: Hình ảnh các chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường LB ....................34
Hình 3.2: Hình ảnh 05 chủng vi sinh vật phân lập trên 03 mẫu đất tại khu vực thành
phố Thái Nguyên .........................................................................................................35
Hình 3.3: Khuẩn lạc 03 chủng vi sinh vật phân lập trên Nem chua (NC), Nato (NT),
Tương (T-3) .................................................................................................................36
Hình 3.4: Hình thái của một số chủng nấm sưu tập ....................................................37

Hình 3.5: Hình thái hệ sợi của một số chủng nấm ......................................................39
Hình 3.6: Sàng lọc chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme Manganese peroxidase
trên môi trường chọn lọc có bổ sung guaiacol ............................................................ 40
Hình 3.7: Vịng hoạt tính MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ Glucose .......................43
Hình 3.8: Vịng hoạt tính MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ NH4NO3......................44
Hình 3.9: Vịng hoạt tính MnP của chủng Pl3 ở các nồng độ pH ............................... 46
Hình 3.10: Hình ảnh chạy TLC mẫu thử phân hủy aflatoxin B1 ................................ 47


ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Kích thước vịng hoạt tính MnP ở các nồng độ Glucose (cm) ...............43
Biểu đồ 3.2: Kích thước vịng hoạt tính MnP ở các nồng độ NH4NO3 (cm) ..............45
Biểu đồ 3.3: Kích thước vịng hoạt tính MnP ở các nồng độ pH (cm) .......................46


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nhiễm nấm mốc nấm trên lương thực, thực phẩm như ngũ cốc (gạo, ngô,...), hạt
có dầu (đậu tương, lạc,…), gia vị (hạt tiêu đen, nghệ,…), các loại quả, hạt khác (hạt
dẻ, dừa,…) và trong sữa của động vật là vấn đề nghiêm trọng. Các nhà nghiên cứu
trên thế giới, cũng như ở Việt Nam đang tích cực nghiên cứu, khảo sát mức độ nhiễm
độc tố từ nấm mốc nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và vật nuôi. Nấm mốc phát triển
không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của hạt mà còn sinh ra các độc tố khác
nhau gọi chung là mycotoxin. Trong những độc tố nguy hiểm phải kể đến aflatoxin.
Độc tố aflatoxin được cấu tạo hố học rất ổn định (vịng thơm) và khó bị phá huỷ bởi
nhiệt, ánh sáng, axit, xử lý kiềm, hay kéo dài thời gian lưu trữ. Độc tố aflatoxin được

sản xuất chủ yếu bởi loài vi nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và
Aspergillus nomius, là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây
độc cho người và gia súc. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin
B1 (AFB1) được coi là một loại độc tố mạnh với các đặc tính gây đột biến, gây quái
thai, gây ung thư gan và ức chế miễn dịch ở động vật và có thể ở người. Do đó, sử
dụng các phương pháp phân hủy độc tố aflatoxin được coi là một giải pháp quan
trọng để hạn chế được sự nguy hiểm của chúng.
Theo như nhiều nghiên cứu trước đây, để phân hủy độc tố aflatoxin có nhiều
cách khác nhau như phương pháp vật lý (nhiệt độ, chiếu xạ), phương pháp hóa học
(axit hóa, amoni hóa, ozon hóa), phương pháp sinh học (sinh vật, chiết xuất,
enzyme). Trong đó, phương pháp vật lý và phương pháp hóa học ít được sử dụng hơn
vì các kĩ thuật này khơng hiệu quả về mặt kinh tế, đồng thời, hiệu suất phân hủy thấp
(chiếu xạ), khó thực hiện trong thực tế, gây ảnh hưởng tối thiểu về chất lượng dinh
dưỡng của thực phẩm, bên cạnh đó cịn gây mùi vị khơng tốt (ozon hóa).
Phương pháp kiểm sốt aflatoxin bằng vi sinh vật học rất đáng được quan tâm
sử dụng vì giá thành rẻ, sử dụng thuận tiện, có lợi cho sản xuất, tạo ra sản phẩm sạch,
đảm bảo sức khỏe và quyền lợi cho người tiêu dùng. Độc tố aflatoxin bị phân giải bởi


2

một số loại vi sinh vật nhất định mà chủ yếu là nấm mục trắng bằng cách tiết ra hệ
enzyme oxy hóa mạnh bao gồm manganese peroxidase, laccase.
Việt Nam là một nước nhiệt đới ẩm, có hệ vi sinh vật phát triển mạnh mẽ và đa
dạng. Đây là nguồn nguyên liệu quan trọng trong nghiên cứu sản suất hệ enzyme oxy
hóa này. Bên cạnh đó, đây cịn là nguồn ngun liệu di truyền quan trọng để tạo ra
các chế phẩm enzyme tái tổ hợp, tiền đề cho nghiên cứu đột phá tạo ra các chế phẩm
sinh học trong công nghiệp xử lý rác thải. Manganese peroxidase là một trong các
loại enzyme chính trong phân giải lignin. Trên thế giới các nghiên cứu về Manganese
peroxidase đặc biệt được quan tâm do tính chất quan trọng của nó. Các nghiên cứu

này tập trung vào tuyển chọn chủng vi sinh vật mới, tiết enzyme mạnh. Các gene mã
hóa cho Manganese peroxidase đã được biểu hiện tái tổ hợp vào P. pastoris, A. niger,
… Tuy nhiên các kết quả hiện nay vẫn còn nhiều hạn chế, khả năng ứng dụng vẫn
cịn khó khăn. Manganese peroxidase cũng đã được thương mại hóa bởi hãng hóa
chất hàng đầu Sigma, tuy vậy, giá thành của enzyme thương mại rất đắt lên đến hàng
ngàn dollar cho 1g enzyme.
Góp phần vào việc nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme Manganese
peroxidase chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ―Sàng lọc chủng vi sinh vật sinh
enzyme Manganese peroxidase có khả năng phân hủy độc tố aflatoxin B1‖.
2. Mục tiêu của đề tài
Sàng lọc được chủng vi sinh vật sinh tổng hợp Manganese peroxidase mạnh có
khả năng phân hủy độc tố aflatoxin B1
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập chủng vi sinh vật từ một số mẫu mẫu đất, mẫu thực phẩm; và sưu tập
một số chủng nấm từ các nguồn cung cấp của viện nghiên cứu, trung tâm.
- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật phân lập và
sưu tập được.


3

- Sàng lọc và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase
từ chủng vi sinh vật được đã được phân lập.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme Manganese
peroxidase của chủng vi sinh vật tuyển chọn.
- Khảo sát khả năng phân hủy độc tố Aflatoxin B1 bằng enzyme Manganese
peroxidase từ chủng vi sinh vật tuyển chọn.


4


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Enzyme Manganese peroxidase
1.1.1. Khái niệm
Manganese peroxidase (MnP) (EC 1.11.1.13) là một glycoprotein có chứa nhân
heme, MnP xúc tác phản ứng oxy hóa Mn2+ thành Mn3+, do đó có thể oxy hóa một số
lượng lớn chất nền phenolic. MnP được phát hiện lần đầu tiên vào giữa những năm
1980 ở P. chrysosporium [7], [21], [32] bởi hai nhóm nghiên cứu quốc tế
(M.Gold’sand R. Crawford's) và được đặc trưng như một enzyme oxy hóa quan trọng
để phân hủy lignin (Paszczyński et al. 1985). Có nhiều chủng vi sinh vật khác nhau
có khả năng sản xuất enzyme Manganese peroxidase. Tuy nhiên, MnP được tìm thấy
chủ yếu ở các loại nấm mục trắng, chẳng hạn như Phanerochaete chrysosporium,
Ganoderma sp., Pleurotus sp., và Irpex lacteus [29], [41]. Gần đây, việc sản xuất các
enzyme ligninolytic bao gồm MnP đã được chứng minh ở Phyllosticta, Aspergilus,
Fusarium và Penicillium [36], [44].
Trong quá trình phân hủy, hệ thống MnP tạo ra các gốc tự do có phản ứng cao
và khơng đặc hiệu phân cắt các liên kết đơn vị cacbon và ete của các hợp chất phenol
và phi phenol khác nhau. Do đó, một loạt các khả năng oxy hóa cơ chất khiến nó trở
thành một loại enzyme thú vị cho các ứng dụng công nghệ sinh học trong một số
ngành công nghiệp. Các ứng dụng tiềm năng của MnP bao gồm nghiền bột cơ sinh
học, tẩy trắng sinh học bột giấy, khử màu thuốc nhuộm, xử lý sinh học của một số
chất hữu cơ khó ăn mịn (tức là cholorolignin có khối lượng phân tử cao,
chlorophenol, hydrocacbon thơm đa vòng, hợp chất nitroaromatic) và sản xuất hóa
chất giá trị cao từ lignin còn lại từ nhà máy sinh học và bột giấy và dịng bên giấy.
MnP có khả năng thâm nhập sâu vào đất và trong tự nhiên, nó xúc tác quá trình khử
phân giải lignin của thực vật. MnP cũng đã được báo cáo về sự phân huỷ/khử độc của
triclosan, aflatoxin, nylon, ß - caroten, cũng như than non có nguồn gốc từ axit
humic.



5

1.1.2. Cấu trúc và tính chất
Mangan peroxidase (MnP) là một loại enzyme có chứa heme thuộc họ
oxydoreductase [33]. Các vi sinh vật ligninolytic tiết ra enzyme MnP ở trạng thái rắn
và lỏng vào môi trường của chúng [24], [26]. Việc sản xuất các isozyme MnP có khối
lượng phân tử 40 – 50 kDa đã được báo cáo ở một số vi khuẩn, nấm basidiomycetes
và tảo do các gene khác nhau mã hóa và điều hịa [57]. MnP thường được quan sát là
các enzyme quan trọng cho sự thối hóa lignin. Cấu trúc phân tử chứa enzyme MnP
có hai ion Ca2+ và năm yếu tố cầu nối disulfide, chịu trách nhiệm duy trì cấu trúc vị
trí hoạt động của enzyme [13], [53] như thể hiện trong hình 1.1.

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử và vị trí hoạt động của MnP [13]
Vị trí hoạt động của enzyme MnP bao gồm các axit amin khác nhau như
histidine (His), liên kết hydro với axit aspartic (Asp) và trung tâm hoạt động
peroxidase có chứa chất xúc tác His và arginine (Arg). Enzyme MnP là cấu trúc tinh
thể của vị trí gắn kết cơ chất và các đột biến của chúng tiết lộ rằng chỉ có một vị trí
gắn Mn2+ và bao gồm hai phân tử nước, ba phối tử axit và propionate heme [26],
[52]. Các vi sinh vật ligninolytic như basidiomycetes, nấm mục trắng và vi khuẩn
oxy hóa Mn2+ thành Mn3+ trong một q trình nhiều bước. Mn2+ tăng tốc và kích hoạt
các chức năng và sản xuất cơ chất nhờ các enzyme MnP [55]. Sau đó, Mn3+ đã được
tạo ra thơng qua enzyme MnP, đóng vai trị trung gian trong q trình oxy hóa cho
một số hợp chất phenolic và không phenolic. M3+ chelates oxalate có kích thước rất
nhỏ để khuếch tán vào vị trí hoạt động của enzyme [54]. Enzyme MnP sở hữu đặc


6

hiệu, hoạt động như một enzyme oxy hóa và peroxidase [50]. Hơn nữa, MnP không
chỉ xúc tác lignin và các hợp chất dẫn xuất của nó mà cịn xúc tác các hợp chất phi

phenolic khác nhau như các hydrocacbon đa vịng thơm (PAH) thơng qua q trình
oxy hóa trong sự hiện diện của H2O2 như một chất oxi hóa thành Mn2+ để Mn3+ [49],
[51].
1.1.3. Cơ chế xúc tác
Chu trình xúc tác MnP được bắt đầu bởi H2O2 thông qua liên kết với enzyme
ferric tạo thành phức hợp sắt-peroxide [26]. Sự phân cắt của enzyme peroxide O liên
kết O cần một sự chuyển đổi hai electron từ heme-porphyrin dẫn đến sự hình thành
hợp chất MnP trung gian khơng ổn định, (cation gốc oxo-porphyrin Fe4+). Do đó, liên
kết dioxygene bị phân cắt dị thể và tạo ra một phân tử nước [26]. Một ion Mn2+ bị
oxy hóa thành Mn3+ và hoạt động như một chất cho điện tử cho porphyrin này để tạo
thành hợp chất trung gian II không ổn định [60]. Việc giảm hợp chất trung gian II
này tiến hành theo cách tương tự như một Mn3+ khác được hình thành từ Mn2+ dẫn
đến sự trở lại của enzyme trạng thái nghỉ và phân tử nước thứ hai được tạo thành
[19], [26] (Hình 1.2).

Hình 1.2: Chu trình xúc tác của MnP [26]
1.1.4. Enzyme MnP oxy hóa có chứa các hợp chất phenolic và các hợp chất
nonphenolic
Enzyme MnP tạo ra Mn (III) thơng qua q trình oxy hóa các hợp chất phenol
như phenol chứa thuốc nhuộm, amin và dẫn xuất lignin. Mn (III) là một phức chất,


7

điều kiện sinh lý hạn chế của chúng dẫn đến q trình oxy hóa cấu trúc lignin
phenolic [23]. Đối với các hợp chất phenolic là 1e oxy hóa từ hợp chất (1-(3,5dimethoxy-4-hydroxypheneyl)

-

2


-(4-(hydroxymethyl)-2-methoxyphenoxy)

-

1,3dihydroxypropane) thành phức chất Mn (III). Nó hoạt động như một chất oxy hóa
khuếch tán và tạo ra các gốc phenoxy trung gian, dẫn đến sự thối hóa khơng
enzyme, phân tách liên kết và sắp xếp lại để tạo ra các sản phẩm khác nhau (1-(3,5dimethoxy-4-hydroxypheneyl)
hydroxy-propane,

-2-(4-(hydroxymethyl)-2-ethoxyphenoxyl)-1-oxo3-

2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone,

2,6-dimethoxy-1,4-

dihydroxybenzene). (Tuor et al., 1992).
Oxy hóa một số hợp chất dẫn xuất lignin khơng phenol thông qua Mn (III) xúc
tác cho phản ứng với sự có mặt của chất trung gian thứ hai. Nó sử dụng electron
thơng qua vịng thơm và hình thành các gốc phản ứng/cation (ion tích điện dương)
gốc phenoxy [45]. Mn (III) có mặt trong thiols, như glutathione, làm trung gian q
trình oxy hóa của các cấu trúc rượu diarylpropane và benzyl thay thế thành ketone và
aldehydes tương ứng [45], [56]. Trong các phản ứng này, Mn (III) được thiol oxy hóa
để tạo ra các gốc thiyl, do đó, chất nền gốc benzylic được hình thành. Enzyme có
chứa Mn (III) cũng kết hợp với peroxid hóa lipid để xúc tác sự phân tách-aryl ether,
Cary-C di diarylpropane không phenolic, và-O-4 lignin và các dẫn xuất của nó tương
ứng [10], [35], [45].
1.2. Vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase
1.2.1. Nấm
Có nhiều lồi nấm đã được nghiên cứu về khả năng sinh enzyme MnP. Năm

1984, loài nấm P. Chrysosporium được nghiên cứu lần đầu tiên về khả năng sinh
MnP. Đến nay, MnP được sản xuất chủ yếu ở các loại nấm mục trắng [29], [41], gần
đây việc sản xuất các enzyme ligninolytic bao gồm MnP đã được chứng minh ở
Phyllosticta, Aspergilus, Fusarium và Penicillium [36], [44].
- Theo nghiên cứu của Yehia, Ramy Sayed (2014) đã nghiên cứu Manganese
peroxidase (MnP) được sản xuất từ nấm mục trắng Pleurotus ostreatus trên dịch lọc


8

nuôi cấy. Enzym đã được tinh chế thành đồng nhất bằng cách sử dụng kết
tủa (NH4)2SO4, sắc ký cột DEAE-Sepharose và Sephadex G-100. Hoạt tính enzyme
cuối cùng đạt được 81 U/mL, hoạt tính cụ thể 78 U/ml với độ tinh sạch 130 lần và
hiệu suất thu hồi 1,2% so với enzyme thô. Điện di SDS-PAGE chỉ ra rằng enzyme
tinh khiết có khối lượng phân tử xấp xỉ 42 kDa. Độ pH tối ưu là khoảng 4-5 và nhiệt
độ tối ưu là 25°C. Hoạt động MnP được tăng cường bởi Mn2+, Cu2+, Ca2+ và K+ và bị
ức chế bởi Hg+2 và Cd+2. H2O2 ở mức 5 mM làm tăng cường hoạt động MnP trong
khi ở 10mM ức chế đáng kể [61].
- Theo nghiên cứu của Nguyễn Minh Quang cộng sự (2017) đã nghiên cứu tăng
khả năng sinh tổng hợp manganese peroxidase (MnP) ở nấm Phanerochaete
chrysosporium và bước đầu ứng dụng để phân hủy glyphosate, hoạt tính MnP được
xác định sinh tổng hợp đạt 49,75 UI/L ở điều kiện môi trường PGB chứa 0,2%
glucose, 5g/L ammonium tartrate và thời gian nuôi 9 ngày [1].
- Theo nghiên cứu của Nguyen Duc Huy và cộng sự (2017) đã nghiên cứu khả
năng sản xuất peroxidase mangan từ nấm Fusarium sp. bằng cách sử dụng một
nguyên liệu nông nghiệp rẻ tiền như rơm rạ hoặc dăm gỗ làm nguồn carbon. Hoạt
tính manganese peroxidase cao nhất trên môi trường rơm rạ và trên dăm gỗ lần lượt
là 1,76 U/mL vào ngày 9 và 1,91 U/mL vào ngày 12 [27].
Hoạt tính MnP tối đa được xác định có cùng độ lớn như đã báo cáo đối với
nhiều basidiomycetes. MnP là enzyme chiếm ưu thế được sản xuất bởi Irpex lacteus,

với hoạt tính trung bình 270 U/L trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Baborová
và cộng sự [9]. Việc sản xuất MnP bởi Trametes villosa hiếm khi được mô tả trong
tài liệu và nồng độ được xác định trong nghiên cứu này lớn hơn nhiều so với ba
chủng được nghiên cứu bởi Machado và cộng sự [18], hoạt tính MnP tối đa trong
khoảng từ 1,2 đến 6,64 U/L khi ni cấy trong mơi trường bổ sung bã mía. Trong
mơi trường ni cấy của Phanerochaete chrysosporium, hoạt tính tối đa của MnP
tinh khiết đã đạt được trong 64 giờ (0,5 U/mL hoặc 500 U/L), sau đó nó bắt đầu giảm
[30]. Trong môi trường nuôi cấy lỏng của Stropharia coronilla, hoạt tính 0,77 U/mL


9

(700 U/L) là xác định sau 45 ngày nuôi cấy [31]. Lopez và cộng sự xác định hoạt tính
tối đa 0,22 U/mL (220 U/L) ở Coniochaeta ligniaria sau 10 ngày nuôi cấy trong điều
kiện lên men rắn với cơ chất phế thải cây hồ tiêu [39]. Nấm Trametes villosa, dưới sự
lên men lỏng với bổ sung glucose, hoạt động MnP đạt đến cao nhất ở mức 6 U/L sau
27 ngày [59].
1.2.2. Vi khuẩn
Hiện nay chưa có nhiều tài liệu cơng bố về enzyme ngoại bảo thuộc nhóm
peroxidase từ vi khuẩn. Một số báo cáo về MnP vi khuẩn được tìm thấy trong tài
liệu. Hai vi khuẩn, B. pumilus và Paenibacillus sp., được Duarte và cộng sự phân lập
từ vật liệu phân hủy gỗ và từ nước thải nhà máy giấy có thể tạo ra MnP trong điều
kiện kiềm.
Theo nghiên cứu của Oliveira và cộng sự (2009) đã nghiên cứu sản xuất
manganese peroxidase (MnP) từ Bacillus pumilus và Paenibacillus sp. đã được
nghiên cứu với việc sử dụng các chất cảm ứng indulin AT, guayacol, rượu veratryl,
axit lignosulfonic và khử lưu huỳnh bằng axit lignosulfonic. Indulin AT làm tăng
hoạt tính của B. pumilus MnP lên đến 31,66 U/L sau 8 giờ, nhưng khơng có cải thiện
nào được ghi nhận đối với Paenibacillus sp., đạt hoạt tính tối đa (12,22 U/L) sau 20
giờ. Cả hai MnP được tạo ra bởi các vi sinh vật này đã được tinh chế trong nhựa

phenyl sepharose và các protein từ chiết xuất thô được rửa giải thành hai phần. Tuy
nhiên, chỉ phần đầu tiên của mỗi chiết xuất có hoạt tính MnP. Thử nghiệm ở các giá
trị pH và nhiệt độ khác nhau, từ pH 5,0 đến pH 10,0 và 30 ºC đến 60 ºC tương ứng
được thực hiện với MnP tinh khiết. Hoạt độ tối đa đạt được của B. pumilus và
Paenibacillus sp. MnPs là 4,3 U/L ở pH 8,0 và 25oC và 11,74 U/L ở pH 9,0 và 35oC,
tương ứng. Các khối lượng phân tử được xác định bằng phương pháp điện di trên gel
SDS-PAGE là 25 kDa và 40 kDa, tương ứng, đối với enzyme tinh sạch từ B. pumilus
và Paenibacillus sp. [42].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về khả năng sinh enzym MnP từ vi khuẩn như
công bố của Đặng Thị Cẩm Hà và đồng tác giả (2009), chủng vi khuẩn Pseudomonas


10

sp. BQNR phân lập từ ô nhiễm dầu ở Quảng Ninh cũng sinh tổng hợp enzyme MnP
với hoạt tính đạt 215U/L. Gần đây nhất, theo công bố của Nguyễn Quang Huy và
cộng sự (2010), sáu chủng vi khuẩn bao gồm BDNP1, BDNP2, BDNP3, BDNP4,
BDNP5, BDNP6 được phân lập từ các công thức xử lý sinh học tẩy độc đất nhiễm
chất diệt cỏ tại sân bay Đà Nẵng. Khi khảo sát khả năng sinh MnP từ các chủng phân
lập được thì chỉ có chủng BDNP6 là khơng sinh MnP, cịn 5 chủng cịn lại đều sinh
MnP hoạt tính lần lượt là 10,4U/L, 7,4U/L, 3,3U/L, 17,2U/L, 9,7U/L. Định danh
BDNP2 bằng trình tự gene 16S rRNA kết hợp với các đặc điểm hình thái thì nó được
xếp vào chi Klebsiella và có tên là Klabsiella sp. BDNP2.
1.2.3. Xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật được nghiên cứu khá nhiều về khả năng sinh
MnP. Các đại diện thuộc chi Streptomyces, Norcadia được nghiên cứu khá nhiều,
trong đó các loại thuộc chi Streptomyces được phát hiện nhiều hơn và có khả năng
sinh MnP như S. Lavendulae REN-7, S. Viridosporus,...
- Theo nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự (2012) đã nghiên cứu
bốn chủng xạ khuẩn gồm XKBH1, XKBH2, XKBH3 và XKBH5 được phân lập từ

đất nhiễm chất diệt cỏ tại sân bay Biên Hịa. Các chủng này sinh laccaza với hoạt tính
ban đầu thấp. Dựa trên phân tích trình tự gene 16S rARN, chủng XKBH1 được phân
loại thuộc chi Streptomyces và đặt tên là Streptomyces sp. XKBH1. Trình tự gene
16S rARN (khoảng 1489 bp) được đăng ký trên GeneBank với mã số GQ 204110.
Chủng XKBH1 sinh trưởng trên môi trường KG và SH1 có chứa dioxin, 2,4,5-T,
pyren và Anthracen. Sau 7 ngày ni lắc, chủng này phân hủy được 72 % pyren,
48,3% anthracen trên môi trường KG và 63,3 % pyren, 55,8 % anthracen trên môi
trường SH1 với nồng độ ban đầu của mỗi chất là 100 ppm. Chủng này cũng sinh tổng
hợp laccaza, lignin peroxidaza (LiP) và mangan peroxidaza (MnP) trên môi trường
SH1 chứa dioxin và 2,4,5-T là chất cảm ứng. Hoạt tính MnP cao nhất đạt 15,7 U/L
trong mơi trường SH1 chứa 2,4,5-T [2].


11

- Theo nghiên cứu đề tài ĐT.05.18/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng
dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 của Bộ
Công thương và trang thiết bị của phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gene, Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam năm 2020 đã
nghiên cứu ―Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân hủy lignin
từ mẫu mùn thu nhận tại Nhà máy giấy Bãi Bằng‖, đã phân lập được 12 chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme MnP trên mơi trường lỏng Czapeck có bổ
sung 1% alkalin lignin, hoạt tính enzyme dao động từ 63 U/L – 135 U/L [3].
1.3. Aflatoxin và phƣơng pháp khử độc tố Aflatoxin
1.3.1. Độc tố Aflatoxin
1.3.1.1. Lược sử phát hiện độc tố aflatoxin
Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu
hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là ―bệnh gà tây X‖ (Turkey X disease)
[12]. Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất
nhiều. Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do

nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961 người ta đã tìm ra bản chất hố học của
độc chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.
Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên
thì thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây
ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất [35], [37], [38].
Năm 1961, các cơng trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được tạo ra bởi
nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động vật
[47]. Trên động vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố Aflatoxin trên cá
hồi được thực hiện bởi Ashley và các cộng sự [46].
Từ đó trở đi có nhiều cơng trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin. Các nhà khoa
học cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin.
1.3.1.2. Các lồi có khả năng sinh Aflatoxin
Aflatoxin thường được tạo bởi hai loài nấm quen thuộc là Aspergillus flavus và
Aspergillus parasiticus [2] với các lượng khác nhau tùy thuộc vào chủng nấm, cơ
chất, điều kiện khí hậu và môi trường.


12

Một số lồi nấm mốc khác cũng có khả năng sinh Aflatoxin với lượng rất ít như
lồi: Penicillium puberulum bai, các chủng thuộc Aspergillus như Aspergillus
tamariikita, Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper
[28] 
Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Aspergillus
flavus thường lẫn với nhiều loài nấm khác, đặc biệt là với Penicillium rubrum stoll và
khi đó có thể nhầm Aflatoxin là do Penicillium sản sinh ra.
Trong một số trường hợp, cũng có thể nhầm lẫn với độc tố Sterigmatoxistin và
Avecsin vì có cấu tạo hóa học gần giống với Aflatoxin.

Aspergillus flavus


Aspergillus parasiticus

Hình 1.3: Nấm Aspergillus flavus và nấm Aspergillus parasiticus
Aflatoxin được sản sinh từ hai chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus. Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khảo sát đều sản
sinh ra Aflatoxin, chỉ 73% có khả năng sản sinh Aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh
Aflatoxin ở mức cao nhất. Người ta đã ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng tùy
theo cơ chất từ đó đã phân lập các chủng A. flavus và tùy theo nguồn gốc địa lý.
Chẳng hạn, người ta đã thấy trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Hoa Kỳ có 94% số
chủng có sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc cũng tại nước này và chỉ
71% đối với các mẫu được phân lập cũng từ lạc nhưng ở Ixraen. Ngoài ra, lượng
Aflatoxin cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng.


13

Ngoài việc định lượng tổng số các Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ
lệ riêng phần của các Aflatoxin khác nhau đã biết. Nói chung, Aflatoxin B1 được tạo
ra nhiều nhất cả trong thiên nhiên lẫn nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó rất xa là
Aflatoxin B2, cịn Aflatoxin G2 và các Aflatoxin khác thì tỷ lệ khá thấp.
Phân biệt các chủng sinh độc tố và không sinh độc tố qua những đặc điểm hình
thái: chủng sinh độc tố có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống ni
cấy lâu ngày (thể bình hai lớp, cuống bào tử đính với vách có gai).
Một chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đó qua nhiều lần cấy truyền liên tiếp
trên các môi trường tổng hợp. Thế nhưng tính độc của một chủng tăng lên khi cấy
truyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp.
1.3.1.3. Cấu trúc hóa học
Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Hiện nay người ta đã
tìm thấy khoảng 18 loại aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp

nhất gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi
nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, được đặt tên là B1, B2, G1, G2
[43].
Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt
của Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Gren (màu xanh lá cây).
Các sắc kí đồ lớp mỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng chlorofrom : metanol
(98.5 : 1.5) được tách bằng hệ thống chlorofrom : cacbon tetraclorua : nước : metanol
(2 : 2.5 : 1 : 3) đã phát hiện hai vết huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại: một vết
huỳnh quang xanh tím, đó là aflatoxin B1, một vết khác có Rf thấp hơn và huỳnh
quang màu lục, đó là aflatoxin G1. Aflatoxin G1 có cấu trúc rất gần với cấu trúc
aflatoxin B1: nó có hai chức lacton, cịn aflatoxin B1 chỉ có một. Bằng cách khử nối
đơi cách trong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B1 và G1 ta thu được
hai sản phẩm độc khác là aflatoxin B2 và G2. So với aflatoxin B1, độc tính của
chúng đối với vịt con kém hơn từ 60 đến 100 lần; như vậy chúng sẽ khơng độc, nếu
khơng có các khả năng mất hidrat chuyển thành aflatoxin B1 rất độc.


14

Aflatoxin B1, B2 trong sữa bị được chuyển hố và gọi là Aflatoxin M1 và
Aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk). Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanh
tím, aflatoxin M2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang tím. Aflatoxin M1 là hidroxi – 4
aflatoxin B1, và aflatoxin M2 là hidroxi – 4 aflatoxin B2.
Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao
nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn.

Hình 1.4: Cấu trúc các loại Aflatoxin
Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại aflatoxin
khác, người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc flavacuramin:
- Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất fenolic của aflatoxin

B1. Người ta đã phân lập được chúng trên cột ambeclit XAD – 2 (Rohm và Haas).
Trọng lượng phân tử của nó, xác định bằng khối phổ là 2.8. Sản phẩm này là kết quả
sự khử metyl của aflatoxin B1.
- Aflatoxin 3B hay toxin B3: một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôi cấy A.
flavus, dạng tinh thể, màu vàng kim, độ độc kém aflatoxin B1 từ 40 đến 50 lần.


15

- Aflatoxin B3 [15] còn gọi là porositicol: nhân xiclopenten tận cùng của
aflatoxin B1 được thay thế bằng một chuỗi bên etanol, do đó chất này là 6 – metoxi 7 - (2’ – hidroxictyl) difurocumarin.
1.3.1.4. Tính chất vật lí
Các Aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này cho
phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp (0,5 ng hay thấp hơn trên một
vết ở sắc kí bản mỏng). Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các
phương pháp hoá lý về việc phát hiện và định lượng. Nồng độ Aflatoxin M1
0,02mg/l có thể được phát hiện trong sữa lỏng.
Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao lên đến điểm nóng chảy, khi
được làm nóng trong khơng khí. Tuy nhiên nó tương đối khơng bền khi để dưới
khơng khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hồ tan ở các
dung mơi có độ phân cực cao. Các Aflatoxin trong các dung môi clorofom và benzen
bền vững trong nhiều năm nếu được giữ trong chỗ tối và lạnh. Các Aflatoxin ít hoặc
khơng bị phá huỷ dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy
nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một khoảng
thời gian nhất định.

Hình 1.5: Đƣờng cong hấp thụ UV của các aflatoxin B1, G1 và G1
Các Aflatoxin được hoà tan trong các dung môi phân cực nhẹ như clorofom,
metanol và đặc biệt ở dimethylsulfoit (dung môi thường được sử dụng như phương