THU NHẬN ENZYME CELLULASE
Phần 1 : Giới thiệu về enzyme cellulase
1 . Định nghĩa
Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm
hòa tan. Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp. Một mặt chúng như
enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulase lại là chất cảm ứng không chặt chẽ), một mặt
chúng lại chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm soát
bởi cơ chế dị hóa).
2. Cấu tạo chung của cellulase
Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30-110 Kdal (Beguin, 1900 và
cộng sự 1991). Cấu trúc không gian khoảng 280-600aa nhưng chiều dài cellulase
thường khoảng 300-400 aa (Gillees và cộng sự 1992) và trung tâm xúc tác khoảng
250 aa. Cellulase là một loại homopolimer của β – D – glucose. Các góc β-D-
glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan.
Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3 enzyme khác nhau:
endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), exoglucanase
(1,4-β-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và β-glucosidase (β-D-glucosid
glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzyme này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt
động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-β-D-glucoside trong
phân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành các
phân tử cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.
3. Phân loại hệ thống các enzyme thuỷ phân cellulose
Hệ thống các enzyme thủy phân cellulose gồm có: endoglucanase có ký hiệu EC
3.2.1.4, Exoglucanase ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucansidase có kí hiệu EC
3.2.1.21.
+Endoglucanase EC 3.2.1.4
Tên thường gọi: cellulase
Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-β-D-glucan-4-glucannohydrolase.
Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzyme này bằng tên khác: endo-1,4-β-D-
glucanase; β-1,4-glucanase; cellulase A,
Enzyme này thường thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và

các β-D-glucan của các loại ngũ cốc.
+Exoglucanase- EC 3.2.1.91
Tên thường gọi: cellulose 1,4-β-cellobiosidase.
Tên hệ thống: 1,4,β-D-glucan cellobiohydrolase
Các tên khác: exo-cellobiohydrolase, exoglucanase; cellulase C1; exo-β-1,4-
glucan cellobiohydrolase
Enzyme này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid, giải phóng
cellobiose từ đầu không khử.
Exoglucanase là một enzyme chứa hai vùng xúc tác với một vùng gắn cellulose
qua một vùng liên kết được glycin hóa cao. Exoglucanase gồm có 2 chuỗi A và B.
Cả hai chuỗi đều có 434 aa nhưng giữa chúng có sự khác nhau để phân biệt.
+β-glucosidase-EC 3.2.1.21
Tên thường gọi: β-D-glucosidase.
Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase.
Một số trường hợp cũng thủy phân:β-D-galactosidase, β-D-fucoside;β-D-
xyloside; α-L-arabinoside.
4. Tính chất
 Tính đặc hiệu
Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và các β-
D-glucan của ngũ cốc. Người ta cho rằng đầu tiên exogluxanase tác động
lên các đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellobiose, β-
glucosidase thủy phân các gốc β-D-glucose cuối cùng từ các đầu phân tử
cellulose.
 Đặc tính vật lý và hóa học
Theo nghiên cứu, các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần
acid amin giống nhau. Độ bền và tính đặc hiêu cơ chất có thể khác nhau.
_ nhiệt độ tối ưu: 40-50
0
C.
_pH tối ưu: thường ở giữa 4-5.

 Chất ức chế:
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose. Thủy
ngân ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn
2+
, Ag
+
,
Zn
2+
chỉ ức chế nhẹ.
Cơ chế tác động
Quá trình thủy phân cellulase tự nhiên được thực hiện dưới sự tác động
của 1 phức hệ cellulase, bao gồm chủ yếu các enzyme C
1
, C
x
và β-
glucosidase.
Enzyme C
1
là một enzyme không đặc hiệu. Dưới tác dụng của enzyme
này các cellulose tự nhiên (bông, giấy lọc…)bị trương lên và chuẩn bị cho
tác dụng của enzyme tiếp theo. Hiện nay có nhiều tác giả cho rằng enzyme
C
1
không phải là một enzyme mà chỉ là một yếu tố của enzyme C
1
. Có tác
dụng làm biến đổi cellulose, nhưng khi tách riêng thì tác dụng này không
có tác dụng nữa.

Để xác định hoạt tính của enzyme C
1
người ta thường sử dụng các loai
cellulose tự nhiên nhất là sợi bông thấm nước.
Enzyme C
x
còn gọi là enzyme β-1,4-glucanase. Enzyme này thủy phân
cellulose thành cellobiose. Chữ X cho ta biết enzyme này có nhiều thành
phần khác nhau. Người ta thường chia C
x
thành 2 loại:
 Exo-β-1,4- glucanase: xúc tác tách ra một cách liên tiếp các đơn vị
glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose
 Endo-β-1,4-glucanase: có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-
glucoside ở bất cứ nơi nào bên trong chuỗi cellulose phân tử.
Để xác định hoạt tính của enzyme C
x
người ta thường sử dụng CMC
(cacboxymethyl cellulose) hay HEC (hydroxyethyl cellulose) làm cơ
chất.
 Cellobiose thì tác dụng lên các disacaritxellobiose để tạo ra glucose.
Phức hệ cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ nấm Myrothecium
verrucaia. Bằng phương pháp điện di, người ta thấy phức hệ enzyme
này gồm 6 cấu tử. Nhưng chỉ có 3 cấu tử có khả năng thủy phân được
cellulose nguyên thủy và cellulose hòa tan. Ở nấm Polyporus
versicolor thì phức hệ cellulase có 4 cấu tử trong đó có β-glucosidase.
Các enzyme này khác nhau bởi cấu trúc phân tử, tính đặc trưng và vận
tốc tác dụng trên cellulose
6. Sinh vật tổng hợp cellulase

6.1.giới thiệu chung về nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase
Cellulase có mặt trong các hạt của thực vật bậc cao, lúa mạch, sâu róm, giun đất
các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, niêm khuẩn. Có thể nói quá trình phân giải cellulose
bởi vsv là một trong những chu trình quan trọng nhất của tự nhiên. Người đầu tiên
nghiên cứu khả năng phân giải cellulose của các vsv kị khí là Popov vào năm
1875, tiếp đó là Omelianxki. Các môi trường nghiên cứu phân lập các vsv này trở
nên kinh điển. Người đầu tiên pháp hiện sự phân giải cellulose bởi vsv hiếu khí là
G.Van Interson năm 1903.
Trước đó ,hoạt động của vsv phân giải cellulose trong dạ cỏ của động vật nhai
lại đã được phát hiện năm 1955 và đến năm 1971 đã phân lập được các vsv này.
Về sau người ta phát hiện thêm nhiều vsv phân huỷ cellulose trong đất, nước
,không khí phân bón hữu cơ.
Cellulose rất phổ biến trong tự nhiên. Hằng năm cellulose do thực vật tổng hợp
nên là 10
11
tấn. Nếu như cellulose được tạo ra từ cây xanh thì sự phân hủy
cellulose lại do vi sinh vật. Do đó, quá trình phân hủy cellulose bằng các enzyme
từ vi sinh vật có ý nghĩa lớn về lý thuyết cũng như về thực tế. Nhờ vậy mà hằng
năm bầu khí quyển trái đất được bổ sung đầy đủ lượng CO
2
cần thiết.
Enzyme Cellulase thường được tổng hợp mạnh mẽ từ các nhóm nấm mốc như
Aspergillus, Penicillium, Trichoderma… nhiều vi khuẩn và xạ khuẩn cũng có khả
năng tổng hợp cellulase cao
6.2 xạ khuẩn
-Nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn
Streptomyces, Actinomyces… các ông đã nhấn mạnh rằng trong cùng một loài hoạt
tính phân giải cellulose của các chủng khác nhau thì khác nhau.
- Loại 1: Act. Coelicolor, Act.sulfureus, Act, aureus, Act. Ellulosae, Act.
Chromogenes, Act. Verne, Act. Glaucus…

- Loại 2: Act. Hydroscoopicus, Act. Griseoflavus, Act. Albidus, Act. Viridans,…
- Loại 3:Act. Thermoficus, Act. Xanthosromus.
- Loại 4: Act, flavochromogenes, Act. Bovis, Act. Sampsonii.
6.3 Vi khuẩn
Vi khuẩn chủ yếu sinh ra endoglucanase và Β - glucisudase và gần như không tạo ra
exoglucanase.
Người ta phân tích thấy rằng có đến 15-20 tỷ vi khuẩn/ 1cm
3
chất có khả năng phân
giải cellulose mạnh trong dạ cỏ
- Ruminococus albus
- Ruminococcus flavefaciens
- Ruminobacter parum-Butyviribrio fibrisolvens
- Cillobacterium – cellulosove
Vi khuẩn hiếu khí: cellulomonas persica sp. Nov và cellulomonas iranesis sp. Nov
Vi khuẩn kỵ khí: clostridium thermcellum, clostridium cellulovorans, clostridium
cellulotiticus
6.4 nấm sợi
Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulose thuộc giống
Alternaria. Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Cladospochung. Chúng được tác
từ đất xung quanh các vùng rễ cây, từ mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn tự
nhiên khác có quá trình phân giải cellulose. Một số chủng nấm mốc đã tổng hợp
cellulose có hoạt tính khá cao:
- Asp. Flavus, Asp. Niger, Asp. Oryzae…
- Chaetomium globosum, chae. Elatum…
- Mucor pusillus
- Penicillium notatum, pen. Variabite, pen. Pusillum
- Trichoderma koningi, Trichoderma vidide…
Trong đó nấm sợi Trichoderma đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu sản xuất
cellulose (Bothast &Saha 1997), nấm này sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn

endoglucanase và exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít Β- glucosidase.
Quá trình sinh tổng hợp Β- glucosidase thường xảy ra chậm hơn quá trình sinh tổng
hợp C1 và C2 là do bản chất của Β- glucosidase là một enzyme tham gia quá trình
chuyển hoá cellulose biến tính chứ không có khả năng chuyển hoá cellulose kết tinh.
Như vậy. Cellulose biến tính có thể coi là chất cảm ứng của Β- glucosidase, mà
cellulose biến tính được hình thành trên cơ sở dưới tác dụng của enzyme C1.
7. Khái quát chung về nấm mốc Trichoderma Harzinaum
7.1 Phân loại
Lớp : Deuteromycetes
Bộ: Moniliales
Họ: Moniliaceae
Giống: Trichoderma
7.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá và sinh thái
- Khuẩn lại Trichoderma Harzianum trên môi trường PGA có dạng bông, khi còn
non có màu trắng, khi già có màu vàng xanh do màu của bào tử, mặt
trái của Petri có màu vàng nhạt đến vàng nghệ.
- Cuốn sinh bào tử dạng chùm, phân nhánh liên tục. Đỉnh bào tử hình cầu có đường
kính 3.6- 4.5 µm, có vách xù xì.
- Đặc tính sinh lý: sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 0
0
C, tối ưu 20- 30
0
C, tối đa 34-
38
0
C .
- Độc tố: không sinh độc tố, có khả năng sinh enzyme chống lại 1 số
Loại nấm gây bệnh cho cây , các enzyme thu nhận từ nó không gây đột biến vi
khuẩn và mô chuột.
- Sinh thái: chiếm ưu thế ở vùng khí hậu nhiệt đới.

Hệ thống phân loại nhóm nấm Deuteromycetes( nhóm nấm sợi sinh sản vô tính)
là dựa vào hình thái đại thể và vi thể do đó, các loài được phân biệt về hình thái
với các loài khác cùng giống.
Phần 2 : Sản xuất và ứng dụng
1. Sản xuất
Enzyme thương mại thường được thu nhận từ T.ressei, Asp.niger và gần đây là
các chủng vi khuẩn. Cellulase thương mại được thu nhận từ T.viridae bằng
phương pháp nuôi cấy bề mặt theo quá trình Koji ( từ cám mì, xử lý nhiệt, cấy bào
tử, nuôi ủ, sau 3-5 ngày thu enzyme tủa với cồn)
Hiện nay việc sản xuất chế phẩm cellulase đã được tiến hành ở quy mô công
nghiệp và được ứng dụng rộng rãi, có nhiều loại chế phẩm đã xuất hiện trên thị
trường như: cellulase và novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament CT
[RM] , Avizyme [FR], Sumizyme C [SN], Meicelase MC[MJ] , Cellulase TAP
[AM] .Cytolase [GR].
2. Ứng dụng
 Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc.
Chúng ta đều biết cellulose là thành phần quan trọng của vỏ tế bào thực
vật. Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được gia công
bằng chế phẩm cellulade sẽ được mềm ra, tăng hệ số đồng hóa, chất lượng
được tăng lên. Do đó sẽ rất bổ ích cho trẻ em,cho người ăn kiêng cũng như
chế biến thức ăn cho gia súc. Việc nghiên cứu và sử dụng trực tiếp enzyme
cellulase trong quá trình chế biến thực phẩm cũng như trong việc chế biến
thức ăn cho gia súc để cải thiện độ tiêu hóa đang được chú ý rất nhiều. Ở
Việt Nam cũng có những ứng dụng cellulase trong việc thủy phân vỏ dứa,
vỏ chuối… để làm thức ăn gia súc.
 Thủy phân gỗ và các phế liệu của gỗ. Ví dụ như enzyme cellulase của
T,viridae thủy phân 100g gỗ thành 25g đường. Trong quá trình ủ cỏ
xanh, sự phối hợp của enzyme và các enzyme thủy phân khác như
pectinase, hemicellulase… có tác dụng phân giải thành tế bào thực vật,
do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho nhóm VSV Lactobacillus lên men

acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các VSV có hại khác.
 Sử dụng làm chất phá vỡ thành tế bào: cellulase phá vỡ thành tế bào
thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc được
dễ dàng. Điều này còn giúp cho việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào trần
nhằm tạo ra tế bào lai có những tính trạng như mong muốn. Cellulase
được sử dụng để sản xuất tinh bột. Cellulase của chủng T.viridae và
của một số chủng nấm còn được dùng để tách tinh bột ra khỏi khoai
lang và đậu tương. Sau khi tách rời các tế bào khoai lang và đậu tương
ra nhờ enzyme tách tế bào người ta cho tiếp xúc với cellulase để phá
thành tế bào và do đó giải phóng tinh bột một cách dễ dàng hơn.
Cellulase còn có tác dụng làm mềm vải nên được bổ sung vào thành
phần chất giặt tẩy trong công nghiệp bột giặc. Ngoài ra cellulase còn
cung cấp cho các cơ chất của quá trình lên men, tạo ra hàng loạt các
sản phẩm như mong muốn như ethanol, glicerin, protein đơn bào.
 Trên nguyên tắc, bất cứ chất vật liệu sinh học nào chứa nhiều Carbon,
hoặc dưới dạng đường, tinh bột, cellulose đều có thể chế biến thành
ethanol, hoặc chứa nhiều acit béo thì chế biến diesel-sinh-học được.
Thông thường nhất là từ thực vật có khả năng quang-tổng-hợp – biến
CO2 của khí quyển thành chất đường, tinh bột, cellulose, rồi protides,
lipids, v.v. Trung bình cứ mỗi phân tử CO2 cây hấp thụ và biến chế
qua quang-tổng-hợp thành sinh-khối chứa 114 kilocalories
Phần 3 : Nuôi cấy vsv tổng hợp Cellulase
Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng
Một quá trình sinh tổng hợp enzyme được gọi là cảm ứng nếu nó
chỉ xảy ra với mức độ đáng kể trong khi môi trường có cơ chất đặc
hiệu của enzyme này hoặc một số chất có cấu trúc tương tự cơ
chất. Các chất này được gọi là chất cảm ứng.
Cellulose là một loại enzyme thuộc hệ enzyme cảm ứng, cellulase
được sinh ra trong môi trường có Cellulose hay dẫn xuất Cellulose
và Lactose, còn trên môi trường chứa Glucose hay Fructose hoặc

Glycerol thì Cellulase không sinh ra. Một trong số các phân tử kích
thích sợi tổng hợp Cellulase có hiệu quả nhất là Sophorose, chất
này có nguồn gốc từ phân tử Celloligosaccharide.
Ảnh hưởng của yếu tố dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp
enzyme Cellulase của vsv
- Nguồn cacbon
Để sinh tổng hợp cellulase trong môi trường nhất thiết phải có
cellulose. Cellulose trong môi trường có thể là giấy lọc,bong, bột
cellulose, lõi ngô, mùn cưa, rơm… ngoài ra chất cảm ứng có thể là
Cellobiozootaacetat, cám mì, lactose.
Những loài vsv khác nhau thì có chất cảm ứng khác nhau vì từ chất
cảm ứng đó vsv sẽ tạo nên lượng enzyme có hoạt tính mạnh nhất.
Các nguồn cacbon khác như Glucose, Cellobiose, Acetat,
Citrat,Oxalat, Succinat và những sản phẩm trung gian của chu trình
Krep, nếu trong môi trường có nồng độ rất thấp thì có tác dụng
kích thích vsv phát triển và tạo enzyme,nhưng nếu nồng độ cao sẽ
ức chế sinh tổng hợp Cellulase. Glycerin chỉ có tác dụng kích thích
vsv sinh trưởng và phát triển không cảm ứng tổng hợp Cellulase.
- Nguồn Nitơ
Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất rõ rệt đến
việc tạo thành Cellulase ở nấm. Theo Sin và Sinden (1951) khi sử
dụng hết 1g nitơ nhiều vsv phân giải Cellulase sẽ phân giải được
khoảng 24-25g Cellulose.
Nitrat là nguồn vô cơ tốt nhất đối với vsv. Các muối amon làm
acid hóa môi trường nên ít có tác dụng nâng cao hoạt lực Cellulase
mà thậm chí ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme và có khả
năng làm mất hoạt tính của enzyme tạo thành.
Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa,tạo điều kiện thuận lợi
cho sự tạo thành cellulase.
- Các nguyên tố khoáng

Fe, Mn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tổng hợp
cellulase cuả vsv, trong đó Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo
enzyme này ở nhiều chủng. Nồng độ tối ưu của Znlà 1,11- 2,2
mg/l, Mn 3,4-27,2 mg/l
- Nhiệt độ nuôi cấy
Vsv sử dụng oxy để hô hấp và làm tác nhân oxy hoá trong quá
trình biến đổi hoá sinh, đồng thời CO
2
thải ra xung quanh và toả
nhiệt. Khi nhiệt độ tăng tốc độ các phản ứng cũng tăng theo nhưng
nhiệt độ tăng quá tốc độ phản ứng sẽ giảm.
Các loài khác nhau có các nhiệt độ hoạt động khác nhau như
Aspergilluse Niger, Trichodecma Konigi phát triển thích hợp ở 25-
30
o
c, đôí với loài xạ khuẩn ưa nhiệt như Thermonospora Curvata
phát triển ở 50- 60
o
c và tích luỹ nhiều enzyme phân giải cellulose
trên môi trường nuôi cấy chứa Cellulose vi tinh thể và cao nấm
men.
- Ph ban đầu trong môi trường:không giống nhau ở mỗi loài
vsv
Phần 4: Phương pháp lên men bán rắn thu nhận
enzyme cellulose từ nấm mốc Trichoderma
Harzianum
Trong phương pháp lên men bán rắn, vsv mọc trên mặt môi trường rắn( môi trường rắn
trước khi nuôi cấy vsv phải được làm ẩm trước) . Các phụ phế phẩm nông nghiệp được
xem là tốt nhất cho quá trình lên men bán rắn, do đó phương pháp lên men bán rắn được
sử dụng rộng rãi. Một số cơ chất được sử dụng từ: bã mía, bã mì, cám gạo, bột bắp , rơm,

trấu, mạt cưa, cùi bắp… tuy nhiên, cám mì là cơ chất được sử dụng rộng rãi nhất. Vsv khi
phát triển sẽ lấy chất dinh dưỡng từ môi trường và sử dụng oxy của không khí để hô hấp.
Để đảm bảo cho vsv mọc đều trên bề mặt môi trường và sử dụng được nhiều chất dinh
dưỡng lớp môi trường rắn cần phải mỏng, chiều dày chỉ khoảng 2-5cm.
Phương pháp lên men bán rắn có nhiều ưu điểm hơn lên men chìm: môi trường lên men
tương đối rẻ tiền, nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với nuôi cấy chìm,
canh trường lên men dễ dàng sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzyme, không cần thiết
bị phức tạp, chủ yếu nuôi cấy trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ ẩm thích hợp, quá
trình sản xuất ít tiêu hao năng lượng.
Một số ứng dụng của enzyme cellulose là thủy phân cellulose để cung cấp cơ chất cho
các quá trình lên men, tạo ra hàng loạt các sản phẩm như mong muốn như ethanol,
glycerin, protein đơn bào… Việc sử dụng cellulose của Trichoderma harzianum để
chuyển hoá phế liệu chứa cellulose từ ethanol cũng đang được nghiên cứu, áp dụng(vì
người ta thấy trộn xăng với ethanol là biện pháp hữu hiệu để giảm bớt chi phí về xăng
cho các loại xe hơi, xe máy và bớt bụi khói.
1. Sơ đồ quy trình thu nhận:
Hấp khử trùng
115độ C trong 20’
Khuấy trong 30’
Môi Trường
Bã mía,cám mì,
khoáng,nước
Xử lí môi
trường
Ủ
Giống
Thu canh
trường
Nghiền
Nước

Trích ly
Chế phẩm enzim
thô
Tủa
Tinh sạch
Enzim
bán tinh
khiết
Nhân giống
Lọc
Li tâm
Trích ly
Thu tủa
Cồn :dịch:4:1
5000v/ph Aceton 70%
MuốI 70%
Hoà vào đệm Na acetat
Sắc kí lọc gel
2. Quy trình thu nhận
2.1.Nguyên vật liệu:
Nguyên liệu:
Chế phẩm enzyme cellulose thô thu được từ môi trường nuôi cấy Trichoderma
Harzianum ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ cám mì:bã mía là 6:4, độ ẩm 55%, ph 5
Các chất bổ sung trong môi trường lên men bán rắn: (NH
4
)
2
SO
4
, K

2
HPO
4
,
mgso
4
.7H
2
O, feso
4
.7H
2
O,znso
4
.7H
2
O,nano
3
,cuso
4
.
Các hoá chất dùng để pha dung dịch đệm: CH
3
COONa, CH
3
COOH
Hoá chất dựng đường chuẩn: glucose và albumin
Hoá chất dung trong quá trình tủa: ethanol 96
0
,(NH

4
)
2
SO
4
, aceton.
Hoá chất dung trong quá trình lọc gel: Biogel P- 100(Bio- Rad).
Thiết bị
Bộ điện di đứng.
Bộ nguồn chạy điện di
B
ã
Đồng hoá
Nồi hấp
Máy đo pH
2.2.Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma Harzianum
Chuẩn bị môi trường
Môi trường giữ giống PGA: khoai tây 200g, agar 20g, glucose 20g, nước cất
1000ml. Chia vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng, khử trùng ở
1atm/20’
Môi trường nuôi cấy
- Cám mì : bã mì là 6:4
- Môi trường czapeck
Pha khoáng cho môi trường
- NaNO
3
3.5 g/l
- K
2
HPO

4
1,5g/l
- MgSO
4
.7H
2
O 0,5g/l
- KCl 0.5 g/l
- FeSO
4
.7H
2
O 0.01g/l
o Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma Harzianum

Phương pháp cấy truyền giữ giống
Môi trường nuôi cấy đổ vào ¼ ống nghiệm, thanh trùng ở 121
0
C trong
20’. Lấy ra để nghiêng 30
0
cho tới khi thạch nguội, dung que cấy đã
thanh trùng trên ngon lửa đèn cồn , lấy một ít bào tử từ ống giống rồi
cấy trên ống thạch theo hình zic zac
Nuôi cấy
Môi trường gồm: cám mì, bã mía, khoáng và nước
Tiến hành ở pH 5, độ ẩm 55%, cám mì :bã mía= 6:4
Lượng nước cần bổ sung vào để đạt độ ẩm cần thiết:
A(B%-C%)
F=

100%
F: lượng nước bổ sung vào môi trường để có độ ẩm cần
thiết(ml)
A: khối lượng cơ chất cần bổ sung
B: độ ẩm cần đạt được
C: độ ẩm có sẵn trong cơ chất
100%: độ ẩm 100%
2.3.Thu chế phẩm enzim thô
Sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng , môi trường nuôi cấy sẽ mọc đầy tơ
trắng. Ta thu cả cơ chất và tơ trắng rồi tiến hành tách enzim với cơ chất .Có nhiều
pp tách như dùng nước ,đệm acetat và muối sinh lí nhưng tách bằng nước sẽ giữ
được hoạt tính cao nhất. Sau khi cho nước vào thì khuấy đều bằng máy khuấy
trong 30’ sau đó lọc để tách cơ chất.
Phần bã thu được ta đem phá vỡ bào tử bằng pp đồng hóa áp lực cao để giải phóng enzim
ngoại nội bào. Phương pháp đồng hóa áp lực cao được ứng dụng rộng rãi trong quy mô
sản xuất công nghiệp.Theo phương pháp này huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp
suất cao, chúng va chạm rất mạnh và tế bào bị phá vỡ bởi lực cắt và sức nén.Sau đó ta thu
chế phẩm enzim thô. Chế phẩm enzim thô thường chứa những thành phần cơ bản sau:
-Nước chiếm khối lượng lớn nhất
-Protein không có hoạt tính sinh học
-Các tạp chất từ tế bào
-Enzim
(Hình máy li tâm liên tục)
Đặc điểm:
Không có dao cạo, lợi dụng trọng lực và lực li tâm tách liệu, không làm vở các hạt kết ★
tinh.
Kết cấu theo kiểu đứng, lắp ráp đơn giản, vận hành ổn định, tỉ lệ sự cố thấp.★
Thây lưới lọc đơn giản, tuổi thọ sử dụng dài.★
Điện năng hao tổn thấp, tiếng ổn trong vận hành thấp.★
Không cừng nền chống rung phức tạp.★

Kiểu thiết kế bịt kín hoàn toàn, bịt kín đối với các dung môi hữu cơ và vật liệu có muồi★
khó chịu.
Thiết bị phân li chất lỏng rắn Tấm lót cao su chống rung
2.5 .Cô đặc dịch enzim

Để giảm ảnh hưởng của đường có trong canh trường lên men và vì dd enzim thô
thường không chứa nhiều enzim ta phải tiến hành cô dặc dd enzim thô bằng pp tủa.Trong
quy mô công nghiệp để xử lí một khối lượng lớn enzim phải tốn rất nhiều công sức và chi
phí xử lí rất cao,mặt khác lượng enzim có trong dd thô quá ít, hoạt tính không cao vì thế
phải tiến hành cô đặc dịch enzim.Hiệu quả của quá trình này là:
-Làm tăng hoạt tính enzim trong một khối lượng enzim
-Hạ thấp chi phí và công sức
-Tăng khả năng bảo quản enzim
-Giảm chi phí vận chuyển và bảo quản
-Tăng hiệu suất tác động của enzim đối với cơ chất.
Phương pháp tủa được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp
vì nguyên liệu rẽ tiền đơn giản nhưng khi tinh sạch phải có thêm bước tách muối.Phương
pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc enzim là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa
với những nồng độ muối khác nhau.
Muối ở nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzim và làm
chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzim. Trong công nghiệp người ta
thường sử dụng muối ammonium sulfat vì muối này có tính hòa tan tốt. Ngoài ra còn có
thể tủa bằng cồn lạnh 4 độ C và tủa bằng aceton
Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35-40 độ C nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt
tính enzim người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzim trước khi
trộn hai loại này với nhau.Khoảng tối ưu của nồng độ muối la từ 20-80%.
Thu cặn tủa và hoà lại bằng dung dịch đệm Na acetate 50mm,pH 5. Tiếp tục pha loãng
với dung dịch đệm Na- acetate 50mm,pH 5 đến độ pha loãng thích hợp.
chú ý : pH tối ưu là 5 . Enzyme rất nhạy cảm với pH môi trường, pH môi trường ảnh
hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme

Tủa bằng muối(NH
4
)
2
SO
4
bão hoà ở nồng độ muối 70% được hàm lượng và hoạt tính
enzyme cao nhất. Nếu nồng độ quá cao có thể ảnh hưởng đến lực hút tĩnh điện làm giảm
khả năng kết tủa, còn nồng độ quá thấp sẽ không tủa hết được enzyme.
Tủa bằng Acetone ở nồng độ 70% ta thu được hàm lượng protein và hoạt tính cao nhất
2.6.Tinh sạch enzyme cellulose bằng sắc kí lọc gel( sắc kí rây phân tử)
Enzim được tinh sạch thu nhận những giá trị sau:
-Giảm được khối lượng vận chuyển, trị số này có ý nghĩa trong việc đóng bao bì ,vận
chuyển ,sử dụng và bảo quản.
-Tăng hoạt tính enzim
-Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm.
Sơ đồ
Trong 12h ở 20oC
hoặc là 4h ở 100oC

Thêm dd đêm với 5-10 phút
V gấp 2lần
Biogel-P100
Huyền phù hoá
hạt gel
Hydrat hoá
Gạn lớp bề mặt
Dung dịch
Khử khí của
dung dịch

Gạn lớp bề mặt
Nạp gel vào
cột
Mẫu enzim
Tiến hành
chạy sắc kí
Bản chất phương pháp
Đối với các sản phẩm tủa bằng cồn lạnh và acetone, quá trình tinh sạch chỉ
được thực hiện trên Biogel P-100, đối với các sản phẩm tủa bằng muối ,
quá trình tinh sạch xảy ra qua hai bước: loại muối bằng gel Sephadex G-
25 và tinh sạch trên Biogel p- 100
Phương pháp sắc kí rây phân tử được sử dụng để làm sạch phân tử protein,
xác định trọng lượng phân tử và phân tích định lượng tương tác phân tử.
Một số thông số của phương pháp
 Giới hạn tách: là MW của phân tử nhỏ nhất không chui vào bên
trong hạt gel , như vậy chúng sẽ thổi cùng một lượt ra khỏi cột.vd: giới
hạn tách của G- 50 FR từ 1500 – 30000 dal, có nghĩa là các phân tử lớn
hơn đều không chui qua khỏi hạt gel.
 Phạm vi tách: có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói
trên sẽ được phân tách dễ dàng bởi G- 50.
 Độ ngậm nước : là trọng lượng nước mà 1g bột gel khô hút nước.
Vd: G-50 có MR là 5,0-0.3g. Giá trị này chưa tính tới trọng lượng nứơc
bao quanh hạt. Do vậy không thể tính thể tích của nó để tính thể tích cột.
 Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ, kích thước hạt xác định bằng mesh
hoặc đường kính tính theo µm.
 Thể tích trống : là thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột.
 Thể tích thổi: là thể tích đệm cần thiết để thổi chất rắn tách ra khỏi
cột.
Nguyên tắc
Sắc kí gel phân tử (còn gọi là sắc kí gel, sắc kí thẩm thấu gel, sắc kí gel thâm

nhập, sắc kí gel nhập, sắc kí gel lọc…) là một loại sắc kí có khả năng lớn
để phân tách , phân tích, xác định kích thước và trọng lượng phân tử các
hợp chất cao phân tử, các protein và các polimer. Ngoài ra phương pháp
rây phân tử được sử dụng thành công trong việc điều chế và tinh sạch
polimer sinh học protein acid nucleic. Hiện nay phổ biến nhất là các gel
hữu cơ loại dextran mạng sephadex với kích thước lỗ khác nhau và hoạt
tính hấp phụ không đáng kể.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên khả năng khác nhau của các
phân tử chất tan thẩm thấu vào khung gel hoặc chui qua lỗ của các rây
phân tử. Nghĩa là dựa trên sự phân bố các chất tan giữa dung môi tự do và
dung môi nằm trong các gốc pha tĩnh. Mức độ thâm nhập của các phân tử
chất tan chủ yếu phụ thuộc vào kích thước lỗ và cấu trúc của chúng. Các
đại phân tử có kích thước lớn hơn lỗ không thể chui qua lỗ, chúng chỉ có
thể khuếch tán vào khe hở giữa các hạt rắn xốp và do đó bị rửa ra khỏi cột
sớm. Các phân tử có kích thước nhỏ hơn lỗ có khả năng xâm nhập vào lỗ.
Khi dòng pha động đi qua, các phân tử đó lại ra khỏi lỗ và di chuyển cùng
pha động.
Như vậy, trong sắc kí rây phân tử các cấu trúc được rửa giải theo thứ tự giảm
kích thước phân tử. Đối với các cấu trúc không gian gần giống nhau, thứ
tự rửa giải theo chiều giảm trọng lượng phân tử. Dĩ nhiên điều đó chỉ đúng
khi hiệu ứng hấp thụ không đáng kể
Hóa chất:
- Gel “Biogel P- 100” có đặc tính : hạt mịn , kích thước hạt 45-
90µm, khả năng ngậm nước: 12ml/g gel khô, phạm vi phân tách 5000-
150000 Dal.
- Gel Sephadex G- 25 có đặc tính phạm vi phân tách:1000-5000
Dal, khả năng ngậm nước :2,5 ml/g gel khô, thể tích nền 6 ml/g gel khô.
- Đệm Na-acetat 50mm, ph 5 khử bọt khí trước khi dùng
-
Tiến hành chạy sắc kí

- Người ta thường sử dụng gel trong 2 trường hợp:
+ Sắc kí loại muối dùng cột 30 x1,5 và Gel Saphadex G- 25 : loại bỏ phân tử
có MW thấp ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (vd quá trình loại muối
ra khỏi dung dịch chứa protein và acid nucleic)
+ Sắc kí dùng để tinh sạch enzyme dùng cột 50x1,5 và Biogel P-100(cần 12h
ở 20
0
C để hydrat hoá hoặc 4h nếu bắt đầu ở 100
0
C. Sau khi huyền phù
đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn
định trong suốt quá trình hydrat hóa.
+ Cỡ hạt hay sử dụng là 100-200 mesh (10-40µm) hay 200-400 mesh(20-80
µm). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn nhưng thời gian thực hiện rất
dài.
+ Sau khi quá trình hydrat hóa xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt.
Chuyển dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân
không. Khử khí của dung dịch trong khoảng 5-10’, thỉnh thoảng lắc nhẹ
bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hỏng gel
+ Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc
nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt. Gạn hoặc loại lớp nổi
trên bề mặt bằng cách hút để tạo ra các hạt mịn.
+ Khi cột nạp đầy gel , khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor, mở khóa đầu
ra của cột và cho dung dịch đệm gấp 2 lần thể tích của nền chảy qua cột
đến lúc điều khiển tốc độ qua dòng chảy.
+ Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flower adaptor xuống đến lớp nền gel.
Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào lớp
nền gel qua flow adaptor, nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không nên
vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị.
Chuẩn bị mẫu

Mẫu chạy phải sạch, hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm
Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít qua làm mẫu bị loãng.
Để phân tích chỉ được phép đưa vào cột một lượng nhỏ mẫu khoảng 1/55
tổng thể tích cột( là thể tích nước tương đương chiều cao nền đã nhồi).
Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức thấp hơn một chut so với dòng chảy
tự do ngang( 15-25 ml/h) còn đối với gel lỗ lớn thì 2- 5 ml/cm
2
(5-10ml/h).
Dòng chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ
nhỏ. Tuy nhiên đối với gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên
phải dùng bơm nén. Thông thường nén theo chiều trọng lực, tuy nhiên
cũng có tác giả sử dụng nén ngược lên.
Thu và xác định mẫu tách được
Dịch ra khỏi cột được đo ở bước song 280nm bằng detector trong hệ sắc kó và
được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc kí đồ. Dịch thu tự động bằng máy
thu mẫu. Dựa vào sắc kí đồ , tiến hành thu các phân đoạn cuối cùng của
một peak, các peak sẽ được phân tích hàm lượng protein. Hoạt tính sau khi
đã làm sạch bằng sắc kí và xác định trọng lượng phân tử bằng kĩ thuật điện
di trên gel polyacrylamide.
Phần 5 :Một số kết qủa sau thu nhận và bảo
quản enzim
Nếu tiến hành tủa 50ml dịch thô từ 1000ml dịch chiết thô ta thu được kết quả như
sau:
Hoạt tính cmcase
(UI/g CP)
Hàm lượng
Protein(mg/g CP)
Hoạt tính
Riêng(UI/mg
)

Tủa bằng cồn(tỉ lệ cồn:dịch e
là 4:1
89.8 10,82 8.3
Tủa bằng aceton 70% bão hoà 100.5 10.95 9,18
Tủa bằng muối 70% bão hoà 119.33 12.22 9.77
Nhận xét
- Về hoạt tính cmcase: tủa muối > tủa acetone> tua cồn
- Về hàm lượng protein: tủa muối > tủa acetone > tủa cồn
- Về hoạt tính riêng: tủa muối > tủa acetone > tủa cồn
Vậy tủa bằng cồn , acetone chỉ thực hiện trong phòng thí nghiệm.
Tủa bằng muối sử dụng trong sản xuất công nghiệp để thu nhận
enzyme
So sánh độ tinh sạch của chế phẩm enzyme với 3 tác nhân tủa khác nhau trong 1g chế
phẩm khi tiến hành chạy sắc kí
Hoạt tính
cmcase (UI/g)
Hàm lượng
protein (mg/g)
Hoạt tính
riêng(UI/mg)
Hiệu suất
thu nhận(%)
Độ tinh
sạch
Dịch
enzyme thô
63,67 17.33 3.67 100 1
Cồn 143.36 8.83 16.92 60.13 4.61
Acetone 176.67 8.15 19.31 56.88 5.26
Muối 187.56 9.5 19.74 63.62 5.37

nhận xét: sau khi tiến hành chạy sắc kí, Hoạt tính riêng tăng lên đáng
kể vì sau quá trình tinh sạch này một số protein tạp bị loại bỏ.
Enzim rất khó bảo quản do đó phảisử dụng chất bảo quản như là : Glycerol,sucrose …
và phảI ở nhiệt độ nhất định khoảng 4xuống -<200 độ C.
Một trong những hợp chất độc nhất của nó là đimêtyl thủy ngân, là độc đến đến mức chỉ
vài micrôlít rơi vào da có thể gây tử vong. Một trong những mục tiêu chính của các chất
độc này là enzym pyruvat dehiđrôgenat (PDH). Enzym bị ức chế hoàn toàn bởi một vài
hợp chất của thủy ngân, thành phần gốc axít lipoic của phức hợp đa enzym liên kết với
các hợp chất đó rất bền và vì thế PDH bị ức chế.
Chứng bệnh Minamata là một dạng ngộ độc thủy ngân. Thủy ngân tấn công hệ thần kinh
trung ương và hệ nội tiết và ảnh hưởng tới miệng, các cơ quai hàm và răng. Sự phơi
nhiễm kéo dài gây ra các tổn thương não và gây tử vong. Nó có thể gây ra các rủi ro hay
khuyết tật đối với các thai nhi. Không khí ở nhiệt độ phòng có thể bão hòa hơi thủy ngân
cao hơn nhiều lần so với mức cho phép, cho dù nhiệt độ sôi của thủy ngân là không thấp.
Tài liệu tham khảo:
-Công nghệ enzim của Nguyễn Đức Lượng
-Luận văn tốt nghiệp :nghiên cứu các chủng vsv sinh enzim cellulase, ứng dụng thủy
phân bã mía của Nguyễn Xuân Quang
-Luận văn tốt nghiệp : nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng enzim cellulase ,thu nhận
cellulase từ nấm mốc Trichoderma harzianum .
-Web :Sinhhocvietnam.com;
-Thu nhận cellulase từ Trichoderma Reesie của viện sinh học nhiệt đớI:vnulib.edu.vn