CHƯƠNG I. CLOSTRIDIUM
 Giới thiệu:

Clostridium là một giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes. Đây là những
vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có khả năng sinh nha bào khi môi trường sống bất lợi. Tên của chúng
bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp kloster (κλωστήρ) có nghĩa trục quay. Từ những đặc điểm điển hình
trên, người ta xếp các vi khuẩn vào giống Clostridium, tuy nhiên gần đây nhiều chủng đã được
phân loại vào các giống khác. Giống Clostridium bao gồm khoảng 100 loài, có những chủng
sống tự do trong môi trường và một số hiện diện như những mầm bệnh tiềm ẩn với con người.
Trong nhóm này có bốn vi khuẩn chủ yếu gây bệnh cho con người:
• C. botulinum, có khả năng sinh độc tố trong thức ăn, vết thương gây ra bệnh độc thịt
.
Đặc điểm
chung của các loài vi khuẩn thuộc giống C. botulinum là có khả năng sản sinh độc tố thần kinh.
Hiện có bảy loại độc tố được đặt tên theo các chữ cái (A-G). Phần lớn các chủng cùng sản sinh
một loại độc tố thần kinh nhưng đồng thời cũng sinh ra nhiều loại độc tố khác đã được ghi nhận.
C. botulinum sinh độc tố B và F được phân lập từ những trường hợp bệnh nhiễm độc thịt ở người
tại New Mexico và California. Một loại độc tố mới đã được xác định là Bf thuộc nhóm B ngoài
độc tố F được tìm thấy. Tương tự, các chủng sản sinh độc tố Ab và Af đã được báo cáo. Các loài
Clostridium đã được xác định gây ra bệnh độc thịt; Clostridium butyricum sản sinh ra độc tố E
và Clostridium baratii sản sinh độc tố F. Khả năng của C. botulinum chuyển gen mã hóa việc
tổng hợp độc tố thần kinh cho các loài clostridia đang được quan tâm, đặc biệt trong công nghiệp
thực phẩm nơi mà hệ thống bảo quản cần được thiết kế để tiêu diệt hay vô hiệu hóa loài C.
botulinum nhưng không làm ảnh hưởng đến các loài khác thuộc giống Clotridium. Trong mật
ong đôi khi có thể tồn tại nha bào của Clostridium botulinum. Người lớn và trẻ lớn tuổi hơn có
thể ăn mật ong mà không bị bệnh vì Clostridium không thể thích nghi trong đường tiêu hóa ở
phần dạ dày ruột.
• C. difficile, tồn tại như là mầm bệnh cơ hội thuộc hệ vi sinh vật ở ruột và phát triển khi có điều
kiện nhất là trong liệu pháp chữa trị bằng kháng sinh và gây ra chứng viêm đại tràng màng giả
• C. perfringens, ban đầu có tên C. welchii, là nguyên nhân gây ra một loạt các hội chứng khác
nhau, từ ngộ độc thức ăn cho đến bệnh hoại thư sinh hơi. Loài này cũng sản sinh ra độc tố ruột

huyết gây ra bệnh nhuyễn thận ở cừu và dê. Lợi ích của C. perfringens là thay thế nấm men trong
phương pháp bánh mì muối. Nó là loài kị khí không bắt buộc, rất ít khi tạo bào tử trong các môi
trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử khi nuôi cấy trong môi trường
Ellner, môi trường có bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline. Loài này có 6 kiểu kháng
nguên được ki81 hiệu từ A-F. Kiểu kháng nguên A thường gây hoại tử cho các vết thương và
gây ngộ độc thực phẩm.
• C. tetani, gây ra bệnh uốn ván. C.terani là loài kị khí bắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với
không khí. Loài này có đặc điểm tạo khối kết tụ khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Loài
này được tìm thấy trong đấy, trong phân các loài động vật và người.
Một vài trường hợp tử vong ở những người phụ nữ sau khi sinh nở được ghi nhận là do C.
sordellii
Giống Clostridium đôi khi được tìm thấy trên những lồng chim kiểu Trung Quốc. Vì vậy những
lồng chim này cần phải qua bước diệt khuẩn bằng sunfite trước khi nhập khẩu vào thị trường
Mỹ.
Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri
ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 37
0
C trong 1-2 ngày. Nếu nghi ngờ có Clostridium
ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 50
0
C. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do
phản ứng giữa ion sulphide S
2-
và ion sắt Fe
2+
có trong môi trường.
 Phương pháp xác định
 Môi trường và hóa chất
- Pepton đệm Buffered Peptone water (BPW)
- Iron Sulphite Agar (ISA)

- Perfringens selective Agar (hay Shahidi ferguson Perfringens, SFP)
 Qui trình phân tích
Mẫu được giải đông ở nhiệt độ không quá 45
0
C và được phân tích ngay sau khi giải đông.
Cân 10g (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước peptone đệm
và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Mẫu được tiếp tục pha loãng thập phân tùy mật độ hiện
diện của Clostridium trong mẫu. Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt ở 70 - 80
0
C trong 20 phút
để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác.
Cấy vào đĩa vô trùng 1ml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô
trùng. Đỗ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45
0
C vào đĩa, lắc đều. Sau khi
môi trường đã đông, đổ thêm trên bề mặt khoảng 10ml ISA hoặc SFP agar. Một phương pháp
khác là cho vào một ống nghiệm vô trùng 1ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp, thêm 12ml ISA
hay SFP agar đã được ủ ấm ơ 45
0
C vào ống, trộn đều mẫu. Sau khi môi đã đông, đổ thêm lên
trên bề mặt 2 - 3ml ISA hoặc SFP agar. Đĩa hoặc ống nghiệm đã cấy mẫu được ủ ở 37
0
C trong
24 - 48 giờ trong các bình kị khí. Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt, thực hiện ủ song song ở
37
0
C và 50
0
C. Thông thường việc đọc kết quả trên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm.
ISA là môi trường không chọn lọc nên các loài vi khuẩn sinh H

2
S khác không phải là
Clostridium cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường này. Để khẳng
định là khuẩn lạc Clostridium cần thực hiện thêm những qui trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định
kết quả.
Ví dụ Xác định Clostridium botulinum
Ta dùng các phương pháp :
Phương pháp truyền thống : Dựa vào đặc sinh hoá của Clostridium botulinum mà ta kiểm tra
các phản ứng sinh hoá nhằm khẳng định Clostridium botulinum.
Phương pháp hiện đại phương pháp PCR : Dựa vào kết quả điện di
 Báo cáo kết quả
Đếm tất cá các khuẩn lạc đen, hoặc có thể bao quanh bởi vòng đen. Mật độ Clostridium
trong mẫu được tính từ số khuẩn lạc đếm được nhânvới hệ số pha loãng và được trình bày ở dạng
CFU/g hay CFU/ml sản phẩm. Qui trình định lượng được tóm tắt như sau:
Hình ảnh thực phẩm có chứa Clostridium
Các loại thực phẩm nhiễm Clostidium botulinum
Vi khuẩn gây bệnh uốn ván là Clostridium Tetani, nằm trong đất, bùn. Mật ong nhiễm bào tử C.
botulinum gây bệnh ở trẻ
CHƯƠNG II. PSEUDOMONAS AERUGINOSA
 Giới thiệu:

• Từ Pseudomonas có nghĩa bộ phận giả, bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp pseudo- (Tiếng Hi Lạp cổ:
ψευδο, giả) và từ monas (tiếng Latin: monas, từ tiếng Hi Lạp cổ: μονος, một bộ phận duy nhất).
Thuật ngữ mon được sử dụng vào thuở ban đầu của lịch sử vi sinh học để đề cập đến mầm bệnh,
ví dụ, Giới Monera.
• Những loài mang tên aeruginosa trong tiếng La tin có nghĩa là gỉ đồng, giống như lớp đồng bị
oxy hóa trên tượng Nữ thần Tự do. Điều này cũng được dùng để miêu tả sắc tố lam-lục của vi
khuẩn trong nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Sắc tố lam-lục là một hợp chất của hai chất
chuyển hóa do P. aeruginosa tiết ra, pyocyanin (lam) và pyoverdine (vàng), hai sắc tố này kết
hợp với nhau tạo ra sắc tố lam-lục của môi trường nuôi cấy. Sự tổng hợp Pyocyanin được điều

hòa bởi sự cảm biến túc số như trong các màng sinh học liên hệ với sự cư trú của các vi khuẩn tại
phổi trong các bệnh nhân xơ nang. Một khẳng định khác là từ này có lẽ bắt nguồn tiền tố tiếng
Hi Lạp ae- nghĩa là "cũ hay già nua, và hậu tố ruginosa có nghĩa nhăn nheo hay lỗ chỗ.
• Nguồn gốc của hai từ pyocyanin và pyoverdine cũng là từ tiếng Hi Lạp, với pyo-, nghĩa là mủ,
cyanin, nghĩa là lam, và verdine, nghĩa là lục. Nếu sắc tố pyoverdine xuất hiện riêng lẻ không
có sắc tố pyocyanin thì có màu vàng ánh bạc.
• Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ biến gây
bệnh ở động vật và con người. Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các
môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không
khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí ôxy, và do đó có thể cư trú trong
nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo. Vi khuẩn này dinh dưỡng bằng rất nhiều các hợp chất
hữu cơ; ở động vật, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho phép nó lây nhiễm và phá hủy các mô
của người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây
ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ
thể như phổi, đường tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người; vì vi khuẩn này phát
triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể. Vi khuẩn cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa
bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên nhân gây
ra viêm chân lông.
2) Đặc điểm
Đây là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que với khả năng di chuyển một cực. Ngoài
việc một là mầm bệnh cơ hội cho con người, P. aeruginosa còn được biết đến như là mầm bệnh
cơ hội cho thực vật. P. aeruginosa là loài điển hình thuộc giống Pseudomonas (Migula ).
P. aeruginosa có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố, bao gồm pyocyanin (lam-lục),
fluorescein (vàng-lục và fluorescent, hiện tại được gọi là pyoverdin), và pyorubin (đỏ-nâu).
King, Ward, và Raney đã tìm ra thạch Pseudomonas Agar P (môi trường aka King A) để tạo điều
kiện cho vi khuẩn tiết pyocyanin và pyorubin, thạch Pseudomonas Agar F (môi trường aka King
B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết sắc tố fluorescein. P. aeruginosa thường được xác định sơ bộ
bởi vẻ ngoài óng ánh như hạt trai và có mùi giống như nho hoặc bánh tortilla khi được nuôi cấy
in vitro. Các triệu chứng khẳng định sự có mặt của P. aeruginosa trong lâm sàng thường bao
gồm khả năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng phát triển tại nhiệt

độ 42 °C. P. aeruginosa có khả năng sinh trưởng trong diesel và nhiên liệu máy bay, nơi mà vi
khuẩn này được coi là vi sinh vật sử dụng hydrocarbon (hay "HUM bug"), và gây ra sự ăn mòn
vi thể. Nó tạo nên một lớp mờ tối đôi khi được gọi không chính thức là "algae" bởi vì vẻ ngoài
của chúng.
Mặc dù được phân loại là một sinh vật hiếu khí, P. aeruginosa còn được xem như là sinh
vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi trường thiếu một phần hay toàn
phần khí oxy. Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối
cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat nó cũng có thể lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ
chất. Khả năng thích nghi trong môi trường vi hiếu khí hay kị khí mang ý nghĩa quan rất quan
trọng đối với cơ chế sinh bệnh của P. aeruginosa, ví dụ, ở những bệnh nhân bị viêm phổi do
bệnh xơ nang, khi mà lớp alginate dày bao quanh những tế bào vi khuẩn nhầy có thể giới hạn sự
khuếch tán của oxy vào máu.
Nhiễm sắc thể của Pseudomonas aeruginosa được cấu tạo phần lớn bởi nucleotid loại
G+C, bao gồm một lõi chính được bảo tồn và các phần phụ khác nhau. Bộ gen lõi của các dòng
P. aeruginosa phần lớn là giống nhau, biểu hiện sự đa dạng thấp, và chỉ chứa vài locus quy định
những tính trạnh nổi bật, như locus pyoverdine, flagella, pilA, và locus sinh tổng hợp kháng thể
O. Những đoạn gen quy định các tính trạng nằm rải rác khắp bộ di truyền và khoảng một phần ba
trong số chúng nằm kề sát các gen tRNA hay tmRNA. Ba điểm chính được biết tới nhờ tính đa
dạng di truyền của vi khuẩn gây ra bởi sự tương tác lẫn nhau giữa các họ đảo gen pKLC102 /
PAGI-2 vào các gen tRNA
Lys
hay tRNA
Gly
. Các đảo gen riêng lẻ khác nhau về thứ tự các gen trao
đổi chất, nhưng giống nhau về các gen tương kề truyền lại trực tiếp cho các chủng và các loài.
Các bệnh không điển hình thường là do đột biến khuyết chức năng mất, tái cấu trúc, và lặp các
đoạn gen trong bộ nhiệm sắc thể P. aeruginosa. Số lượng của loài P. aeruginosa chủ yếu được
đặc trưng bởi một vài chủng gây bệnh phân bố rộng trong môi trường sống. Bộ gen được cấu
thành bởi các phân đoạn gen của dòng vô tính điển hình trong lõi với dòng gen không bị giới hạn
trong dân số.

Là một mầm bệnh cơ hội gây nhiễm trùng bệnh viện tấn công các bệnh nhân bị suy giảm
miễn dịch, P. aeruginosa thường gây nhiễm trùng đường hô hấp, đường tiết niệu, các vết bỏng,
vết thương, và còn gây ra nhiễm trùng huyết.
Nhiễm trùng bệnh viện
Nhiễm trùng bệnh viện
Viêm phổi
Nhiễm trùng huyết
Nhiễm trùng đường niệu
Gastrointestinal infection
Nhiễm trùng da và mô mềm
3) Phương pháp xác định
3.1) Môi trường và hóa chất
- Môi trường canh Modified Letheen Broth (MLB)
- Môi trường chọn lọc Enterobacteriaceae (EMB Agar, Endo Agar, Deoxycholate Agar,
MacConkey Agar, Hektoen Enteric Agar và XLD Agar)
- Thạch nghiêng YE
- Môi trường thạch Simmons Citrate Agar (SCA)
- Môi trường canh Nitrate Broth
- Môi trường canh Koser’s Citrate Broth
- Môi trường thạch Christensens Citrate Sulfide Agar (CCSA)
- Môi trường canh malonate Broth
- Môi trường canh Nitrate Motility agar
- Môi trường Arginine decarboxylase Broth
- Môi trường Nutrient Gelatin
- Môi trường thạch Pseudomonas agar F
- Môi trường thạch Pseudomonas agar P
- Môi trường Cetrimide oxidase
- Môi trường thạch TSA
- Thuốc thử nghiệm oxidase
- Hóa chất nhuộm gram

- Thuốc thử nhuộm tiên mao
3.2) Qui trình phân tích
Đối với mẫu mĩ phẩm, tùy đặc tính vật lý của mẫu, mẫu được xử lý và chuẩn bị một cách
khác nhau. Thông thường 1ml mỹ phẩm dạng lỏng được bổ sung vào 9ml môi trường canh
MLB, 1g mỹ phẩm dạng kem hoặc bột được bổ sung vào ống nghiệm chứa 1ml Tween 80, sau
đó bổ sung 8ml canh MLB để thu được mẫu pha loãng 10
-1
.
Quy trình của FDA (Food and Drug Administration)
Dùng que cấy vòng tiến hành ria mẫu lên một trong các môi trường chọn lọc như EMB
agar, Endo agar, Deoxycholate agar, MacConkey agar, Hektoen Enteric agar và XLD agar để
phân lập họ Enterobacteriaceae và giống Pseudomonas, ủ ở 37
0
C, 24 giờ. Các môi trường này
là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn gram âm, nhưng các giống khác nhau cho khuẩn lạc có hình
thái đặc trưng khác nhau trên môi trường này. Ví dụ, trên môi trường XLD, E.coli có khuẩn lạc
dẹt, màu vàng, một vài chủng còn không mọc được. salmonella cho khuẩn lạc màu đỏ có tâm
đen, Pseudomonas cho khuẩn lạc màu đỏ không có tâm đen. Các khuẩn lạc có hình thái đặc
trưng cho Pseudomonas được dùng để nhuộm gram, trước tiên được thử nghiệm TSI, oxidase,
sau đó thử nghiệm các đặc trưng sinh hóa khác như sau:
- Nhuộm gram: việc nhuộm gram có thể được thực hiện bằng phương pháp Jensen hay phương
pháp Hucker. Trước tiên, tạo vệt bôi vi sinh vật trên phiến kính. Chọn một phiến kính sạch, dùng
bút ghi trên kính vẽ 1 vòng tròn đường kính khoảng 2cm ở mặt dưới của phiến kính. Đặt ở vị trí
tương ứng với vòng đánh dấu ở mặt trên của phiến kính vài giọt nước cất thành một giọt lớn.
Dùng que cấy vòng chuyển vài vòng dịch tế bào lên vùng vòng tròn ở trung tâm bề mặt phiến
kính, bôi đều trong khu vực của vòng tròn. Để yên cho vệt bôi khô. Dùng tay giữ 2 cạnh của một
đầu phiến kính, đưa phiến kính(ở vị trí cạnh vệt bôi) qua lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn hoặc
đèn Bunsen để cố định vệt bôi trên kính. Tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa. Thực
hiện tương tự để tạo một vệt bôi chung hai chủng vi sinh vật đối chứng trong cùng một phiến
kính khác.

- Theo phương pháp Jensen: Nhỏ vài giọt dung dịch methyl violet lên vệt bôi, giữ yên trong 20
giây. Dùng bình xịt nước, bơm nước lên vệt bôi, rửa phẩm nhuộm đến vừa mất màu. Để yên vài
giây sau đó rửa sạch lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch safrarin 30 giây. Rửa sạch bằng
nước. Thấm nước dư bằng giấy lọc. Theo phương pháp của Hucker, bằng thao tác tương tự như
ở phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi 1 phút bằng dung dịch crystal violet. Rửa bằng nước.
Nhuộm bằng dung dịch KI/I
2
trong 1 phút.Khử màu bằng cách xịt cồn 95% cho đến khi sạch
màu. Rửa lại bằng nước và nhuộm bằng dung dịch safrarin trong 2 phút
- Thử nghiệm TSI: khuẩn lạc đặc trưng cho Pseudomonas được cấy chuyền sang ống thạch
nghiêng TSI, ủ 24 giờ ở 35
0
C. P.aeruginosa cho phản ứng kiềm hóa ở cả 2 phần thạch nghiêng
và phần sâu (màu môi trường đỏ), không sinh hơi (một vài chủng sinh H
2
S nhẹ).
- Thử nghiệm oxidase: cắt một miếng giấy lọc thành những dải nhỏ dài 10x40mm. Nhùng vào
hóa chất dùng cho thử nghiệm oxidase, thấm bớt dịch hóa chất thừa bằng giấy thắm. Tránh để
giấy lọc tẩm thuốc thử trực tiếp ngoài sáng lâu vì ánh sáng phân hủy hóa chất. Để khô ở 35
0
C và
giữ trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng. Sử dụng que cấy vòng bằng bạch kim chuyển sinh khối
lên một phần giấy lọc (dây bằng nichrome có thể cho phản ứng (+) giả). Đọc kết quả sau 10 giây,
không được để vượt quá thời gian này. Phản ứng oxidase là (+) khi có sự xuất hiện màu đỏ tía
đậm, là (-) khi giấy lọc không màu hoặc xuất hiện màu đỏ tía sau 10 giây. P.seudomonas spp. có
phản ứng oxidase (+).
- Sau khi kiểm chứng được chúng là Gram (-), không sinh H
2
S trên môi trường TSI và oxidase (+).
Các khuẩn lạc thuẩn này tiếp tục thử nghiệm các thử nghiệm sinh hóa để khẳng định chủng nghi

ngờ là P.aeruginosa như sau: khả năng ở 42
0
C, thử nghiệm biến dưỡng citrate, malonate, nitrate,
thử nghiệm ADH, geletinase.
- Khả năng tăng trưởng ở 42
0
C trên môi trường YE: cấy từ một khuẩn lạc thử nghiệm lên 2
ống thạch nghiêng YE, 1 ống ủ ở 35
0
C trong 24 giờ, ống còn lại ủ ở 42
0
C trong 24 giờ. Ống môi
trường dùng để ủ ở 42
0
C cần được ủ đạt đến nhiệt độ này trước khi cấy chủng thử nghiệm vì một
số loài Pseudomonas có thể mọc chậm ở 42
0
C trên môi trường chưa ủ, nhưng không thể mọc
được trên môi trường đã được làm ấm trước đó. Trên môi trường này, P.aeruginosa tằng trưởng
được ở 42
0
C và tạo ra mùi cá do trimelthylamine.
- Thử nghiệm biến dường citrate: cấy và ủ khuẩn lạc thử nghiệm trên môi trường canh Koser’s
Citrate Broth ở 35
0
C trong 24-48 giờ. P.aeruginosa sử dụng được citrate để tăng trưởng và làm
đục môi trường. Có thể thực hiện thử nghiệm này bằng cách sử dụng các môi trường thạch như
SCA hay môi trường CCSA như được trình bày trong chương IV.
- Thử nghiệm biến dưỡng malonate: cấy và ủ khuẩn lạc thử nghiệm trên môi trường canh
Malonate Broth ở 35

0
C trong 24 giờ. P.aeruginosa sử dụng được malonate làm nguồn carbon
duy nhất để tăng trưởng và làm môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang xanh dương.
- Thử nghiệm sử dụng nitrate (thử nghiệm nitratase): cấy ria khuẩn lạc thử nghiệm trên bề mặt
và đâm sâu xuống thạch Nitrate Motility Agar trong ống thạch sâu. Ủ ở 35
0
C trong 24 giờ. Nhỏ
vài giọt sulfanilic acid và naphthylamine. Nếu xuất hiện màu hồng đậm hay màu đỏ chứng tỏ có
sự biến đổi nitrate thành nitrite. Ngoài ra, nếu môi trường không đổi màu nhưng có sự tạo thành
bọt khí hoặc làm rạn nứt môi trường cũng được xem là phản ứng (+) do sự khử nitrate thành
nitrite để giải phóng nitơ. P.aeruginosa cho kết quả (+). Có thể thực hiện thử nghiệm này trên
môi trường Nitrate Broth. Chú ý luôn luôn thực hiện song song một ống đối chứng ở cùng điều
kiện, không được cấy giống P.aeruginosa có thử nghiệm nitratase (+).
- Thử nghiệm ADH: cấy khuẩn lạc thử nghiệm vào môi trường ống nghiệm canh Arginine
Decarboxylase Broth. Vặn chặt nắp ống nghiệm để tránh thông khí. Ủ ở 35
0
C trong 24 giờ.
P.aeruginosa có ADH (+), tăng trưởng được trên môi trường này và không đổi màu đỏ tía của
môi trường. Ngược lại, phản ứng ADH (-) khi môi trường bị chuyển thành màu vàng.
- Thử nghiệm gelatinase: cấy khuẩn lạc thử nghiệm vào ống thạch sâu chứa môi trường Nutrient
Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng ít nhất là 72 giờ. Làm lạnh ống nghiệm và quan sát sự hóa lỏng của
gelatin. P.aeruginosa làm hóa lỏng gelatin. Chú ý luôn luôn thực hiện song song 1 ống đối
chứng ở cùng điều kiện, không cấy giống.
- Thử nghiệm tạo sắc tố pyoverdine và pyocianine: cấy ria khuẩn lạc thử nghiệm lên 2 đĩa petri
môi trường thạch Pseudomonas Agar F và Pseudomonas Agar P. Ủ ở 25
0
C ít nhất là 3 ngày. Soi
đĩa môi trường Pseudomonas Agar F dưới tia UV (260nm). P.aeruginosa tiết sắc tố pyoverdine
phát huỳnh quang khuếch tán trong agar dọc theo đường cấy. Bẻ vỡ một mãnh môi trường
Pseudomonas Agar P bằng que thủy tinh, cho vào ống nghiệm chứa nước cất, lắc mạnh bằng

vortex để hòa đều sắc tố. Lọc nước qua một ống khác, thêm vào ống 5 – 10ml chloroform và lắc.
P.aeruginosa tiết sắc tố màu lam pyocyanine phân tán vào lớp chloroform. Hút lớp chloroform
vào một ống nghiệm khác và bổ sung 3ml nước cất. Nhỏ một giọt NH
2
SO
4
. Pyocianine trở nên
đỏ và di chuyển vào pha nước.
- Thực hiện nhuộm tiên mao: sử dụng canh khuẩn già, khoảng 14 -28 giờ sau nuôi cấy. Dùng
que cấy vòng chuyển vài vòng canh khuẩn vào một ống nghiệm nhỏ chứa 1ml nước cất, để yên
ống nghiệm 10 phút.
Thao tác nhẹ nhàng vì tiên mao dễ bị gãy. Chuẩn bị một phiến kính sạch bằng cách xịt
nước cất, sau đó xịt cồn và hơ lửa vài giây cho cồn khô. Tạo vệt bôi bằng cách chuyển vô trùng
một giọt canh khuẩn đã hòa loãng như trên lên vùng giữa gần một đầu của phiến kính. Nâng đầu
này của phiến kính để tạo một mặt nghiêng để giọt nước tự chảy về phía đầu kia của phiến kính.
Để vệt bôi khô trong gió. Nhỏ vài giọt phẩm nhuộm tiên mao lên vệt bôi. Nhuộm trong 15 phút.
rửa bằng nước và thấm nước thừa bằng giấy lọc. quan sát dưới kính hiển vi bằnng vật kính 100X
nhúng trong dầu. Pseudomonas aeruginosa là loài có tiên mao đơn cực.
Các thử nghiệm cần tiến hành và nhận định kết quả để khẳng định P. aeruginosa được
tổng hợp như bảng sau:
Bảng CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA KHẲNG ĐỊNH P. AERUGINOSA
Thử nghiệm hóa sinh và kết quả Kết luận
1.TSI
Acid ở đáy, kiềm ở phần thạch nghiêng, sinh
hơi.
Acid ở đáy, acid ở phần thạch nghiêng, sinh
hơi.
Kiềm ở đáy và bề mặt thạch nghiêng, không
sinh hơi.
Không phải P. aeruginosa

Không phải P. aeruginosa
P. aeruginosa
2.YE agar
Không phát triển ở 420C
Phát triển 420C
Không phải P. aeruginosa
P. aeruginosa
3.Koser’s Citrate
Không mọc
Mọc
Không phải P. aeruginos
P. aeruginosa
4.Sử dụng manolate
Âm tính
Dương tính
Không phải P. aeruginosa
P. aeruginosa
5.Arginine Decarboxylase
Âm tính
Dương tính
Không phải P. aeruginosa
P. aeruginosa
6.Khử nitrate
Âm tính, không sinh hơi
Dương tính
Không phải P. aeruginosa
P. aeruginosa
7.Khả năng di động
Âm tính
Dương tính

Không phải P. aeruginosa
P. aeruginosa
8.Tiên mao

 !"# $%&''&()*+,-*. %
/01&2 34"5678#"5&9:"6
;&< ="8>6?2 3
Kết luận: P.aeruginosa dương nh
@A""4
< ="BC4 < ="D E34
FG.4  4
4 @ 4 H)I4 JK34
2"& 4 2LE 4
Tiên mao đơn cực
Các loại tiên mao khác
P. aeruginosa
Không phải P. aeruginosa
9.Pseudomonas agar F
Không có sắc tố huỳnh quang
Sắc tố huỳnh quang (pyoverdine)
Không phải P. aeruginosa
P. aeruginosa
10.Pseudomonas agar P
Không sắc tố
Nếu có sắc tố, xác định là pyocyanine
Không phải P. aeruginosa
P. aeruginosa
Qui trình phát hiện P.aeruginosa
Đây là bệnh nhân bị nhiễm trực khuẩn xanh kháng thuốc
(Pseudomonas aeruginosa) Tụ cầu vàng