XÉT NGHIỆM VI SINH
CHẨN ĐOÁN LAO VÀ LAO
KHÁNG THUỐC

LOẠI BỆNH PHẨM – T
QUẢN VÀ VẬN CHUY

2

13-Sep181

1

○Bệnh

phẩm phải được đảm bảo về chất lượng và số lượng; được thu thập, vận
chuyển và xử lý đúng cách.
○Tùy theo thể loại bệnh lao mà các loại bệnh phẩm được thu thập khác nhau:
3

Loại bệnh phẩm Thể tích Đàm 5-10ml (VN: 3-5ml) Dịch não tủy 10ml, càng nhiều càng tốt Dịch
abces 10ml, càng nhiều càng tốt Dịch màng phổi, dịch màng tim, dịch màng bụng
10ml, càng nhiều càng tốt
Dịch dạ dày 5-10ml Hạch lympho 1 phần hay toàn bộ hạch Dịch rửa phế quản ≥ 5ml
Nước tiểu 50ml, càng nhiều càng tốt Sinh thiết mô 1g Phân ≥1g Máu 10ml Xương, tủy
xương 100mg, càng nhiều càng tốt
1-3ml bệnh phẩm chọc hút
4

13-Sep-182
THỂ TÍCH DỊCH NÃO TỦY - TỈ LỆ CẤY DƯƠNG

118 BN LMN/HIV âm
90

80 78 8070605040
57

62

40302010

00-1.9 2.0-3.9 4.0-5.9 6.0-7.9 >8

THỂ TÍCH DỊCH NÃO TỦY (ml)
5
Thwaites, G. E., T. T. Chau, and J. J. Farrar. 2004. Improving the bacteriological diagnosis of tuberculous meningitis. J Clin Microbiol 42:378-9.

➢

Các bệnh phẩm phải được chuyển đến phòng xét nghiệm ngay lập tức.


➢

Nếu khơng có điều kiện chuyển mẫu ngay (đàm), có thể giữ mẫu ở 40C trong vòng 3-4 ngày

6

13-Sep-183



Advances in Diagnostic Assays for Tuberculosis. Cold Spring Harb Perspect Med 2015;5:a017806

SỰ PHÁT TRIỂN CÁC TEST CHẨN ĐOÁN
7

13-Sep-184

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN MỚI ...
➢

Cần:

Cho kết quả nhanh ➢ Cho kết quả chính xác: độ nhạy, đặc hiệu cao ➢ Test có thể được lưu trữ v
nhiệt độ phịng ➢ Dễ thực hiện, đơn giản ➢ Không cần trang thiết bị hiện đại, phức tạp ➢ Rẽ tiền ➢
rộng rãi ở những nước có mật đơ lao cao
➢

10

13-Sep-185


XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO 11

PHƯƠNG PHÁP SOI TÌM AFB
➢Được

áp dụng để chẩn đốn và phát hiện lao ở các nước có gánh nặng về lao với n
chế ➢Dễ thực hiện, chi phí thấp ➢Cho kết quả chính xác và nhanh, trong vòng vài g

phân biệt vi khuẩn sống hay chết, vi khuẩn
nhạy hay kháng thuốc, MTB hay NTM ➢Các phương pháp soi:
➢

Soi trực tiếp (áp dụng rộng rãi) ➢Soi thuần nhất (áp dụng hạn chế) 12
13-Sep-186

Rửa Fuchsin 0.3% - 05 phút
nhẹ dưới vòi nước NHUỘM

ZIEHL Rửa nhẹ dưới vòi nước
NEELSEN
Methylen 0.3% - 1 phút
Acid cồn 3% - 03 phút
Rửa nhẹ dưới vịi nước – Để khơ tự nhiên
14

PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP (1)
➢ 10.000 vi khuẩn/ml đàm ➢ Độ nhạy: 50 – 80%, Độ đặc hiệu: 98 – 99% ➢ Thu
thập 2 mẫu đàm trong 1 ngày, cách nhau 2
giờ
13

13-Sep-187

PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP NHUỘM ZN (2)
Cách đọc và ghi kết quả 0 AFB/100 qt Âm tính 1 – 9 AFB/100pt Ghi số cụ thể 10
– 99 AFB/100qt 1+ 1 – 10 AFB/qt 2+ >10 AFB/qt 3+
➢ Tỉ lệ phát hiện:



▪ Đàm

1: 80 – 83%
▪ Đàm 2: Thêm khoảng 10%
15

▪ Đàm 3: Thêm khoảng 5%
Rửa nhẹ dưới vòi nước Auramine 0.1% - 20 phút
KMnORửa nhẹ dưới vòi nước
4 0.5%

- 1 phút
Acid cồn 0.3% - 3 phút
Rửa nhẹ dưới vòi nước – Để khơ tự nhiên

NHUỘM
HUỲNH
QUANG
16

2011

13-Sep-188

SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (3)
NC phân tích tổng hợp Độ nhạy
(%)
Độ đặc hiệu (%)
Bệnh phẩm không xử lý

KHV thường 32 - 94 94 - 100
KHV HQ 52 - 97 94 - 100
Bệnh phẩm đã xử lý
KHV thường 52 - 94 94 - 100
KHV HQ 63 - 97 94 - 100
17

Lancet Infect Dis, 2006.6(9):p.570-81

SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (4)KHV

HUỲNH QUANG LED
Sử ánh dụng sáng đèn thường LED thành cực sáng ánh sáng như 1 huỳnh nguồn quang sáng phản
chiếu, chuyển ➢ Không thay bóng đèn ➢ Khơng tạo nhiệt trong q trình sử dụng ➢ Giảm năng lượng
tiêu thu ➢ Có thể sử dụng pin ➢ Giảm giá thành ➢ 10.000 giờ ➢ Có Rhod/KMnO4; thể sử dụng
➢

Au/MethBlue)
nhiều loại thuốc nhuộm (Au/KMnO4; Au18

13-Sep-189


KHV HQ LED đã được TCYTTG khuyến cáo sử dụng vào năm 2009 để phát hi
lao cao

Chuẩn vàng Độ nhạy LED-FM Độ đặc hiệu LED-FM
Cấy 93% (85% - 97%) 99% (98% - 99%)
Soi trực tiếp (ZN) Tăng 6% (0.1% - 13%) Không thay đổi
13-Sep-1810

Soi huỳnh quang cổ điển

PHƯƠNG PHÁP CẤY
➢

>100 - 1000 vi khuẩn/ml đàm ➢ Vi khuẩn lao tăng sinh tốt trên môi trường trứng chứa glycerol và a

môi trường lỏng chứa serum

hoặc albumin bò ➢ Tăng tỉ lệ phát hiện khoảng 30 – 50% so với phương pháp soi ➢ Cho kết quả chậm vì thời gian n
(18-24 giờ):
▪ Phương
▪ Phương

pháp cấy đặc: 3 tuần – 1 tháng

pháp cấy lỏng: 2 – 3 tuần ➢ Các chủng cấy dương có thể dùng để thực hiện :
▪ Các

xét nghiệm định danh

▪ Kháng
▪ Xét

sinh đồ

nghiệm sinh học phân tử... 20

ăng 5% (0 – 11%) Tăng 1% (-0.7% - 3%)


19

Giảm thời gian đọc tiêu bản còn 50% so với ZN


13-Sep-1810
13-Sep-1810

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MƠI TRƯỜNG ĐẶC (1)
➢

Được TCYTTG cơng nhận là chuẩn vàng trong chẩn đốn lao

➢

Các loại mơi trường:
▪ Lưwenstein-Jensen (LJ): mơi
▪ Mơi trường OGAWA

trường trứng chứa Glycerol và Asparagine

: môi trường trứng chứa Glycerol và sodium glutamate

▪ Middlebrook 7H10 agar

➢

Qui trình cấy:
13-Sep-1811
▪ Trả


kết quả âm tính sau 8 tuần ➢ Tỉ lệ ngoại nhiễm chấp nhận: 2-3%

22

13-Sep-1811
13-Sep-1811
▪ Bệnh phẩm
▪ Cặn lắng

được xử lý với NALC-NaOH hoặc NaOH 2-4% (ngoại trừ dịch cơ thể vô trùng như dịc

của bệnh phẩm đã xử lý được cấy trên môi trường LJ, ủ ở 35-37 0C cho đến khi thấy khóm
21

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MƠI TRƯỜNG ĐẶC (2)
➢

Đọc và phân tích kết quả:
▪ Đọc

kết quả hàng tuần

▪ Thường có kết

quả cấy dương sau 3-4 tuần :

▪

Khóm trùng có màu kem, sần sùi như bơng cải súp lơ


▪

Khi hịa tan khóm trùng trong nước muối sinh lý sẽ thấy sự hiện diện của các hạt rất nhỏ


▪

Quan sát dưới KHV: hình ảnh dây thừng với chiều dài khác nhau

▪ Nếu có

kết quả cấy dương trong vịng 1 tuần:

Nhóm vi khuẩn mọc nhanh (Mycobacterium Other Than Tuberculosis – MOTT hay Nontubercul
NTM)
▪

13-Sep-1811
13-Sep-1811

PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (4)
➢

Ưu điểm
▪ Môi

trường dễ pha chế

▪ Rẽ


tiền

▪ Vi

khuẩn lao mọc tốt trên mơi trường này

▪ Sau

khi pha chế, có thể sử dụng trong vài tuần (giữ 4-80C)


▪ Mơi

trường có chứa malachite green dùng để ức chế sự phát triển của các tạp khu
13-Sep-1812
thể 20-100 khóm trùng Dương tính: 1+

100-200 khóm trùng Dương tính: 2+
200-500 khóm trùng Dương tính: 3+
>500 khóm trùng Dương tính: 4+
Ngoại nhiễm Ngoại nhiễm

Khóm trùng vi khuẩn lao trên mẫu cấy dương

Mẫu cấy LJ dương

13-Sep-1812
13-Sep-1812
➢


Khuyết điểm
24

▪ Thời gian cho kết quả
Đọc kết quả Giải thích

lâu (4-8 tuần)

Khơng mọc Âm tính
1-19 khóm trùng Dương tính: số cụ
13-Sep-1812
13-Sep-1812

PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (1)
➢

Hệ thống BACTECTM MGITTM 960 (Becton Dickinson, Sparks,

23


MD) ➢ Ưu điểm:
 Vi khuẩn lao mọc và phát triển trên môi trường lỏng nhanh
hơn môi trường đặc  Độ nhạy cao hơn phương pháp cấy đặc khoảng 10%  Đọc kết quả bằng máy
 Thời gian cho kết quả nhanh (10-14 ngày) ➢ Khuyết điểm  Đắt tiền  Tỉ lệ ngoại nhiễm cao hơn
(5-10%)
Năm 2007, TCYTTG khuyến cáo sử dụng phương pháp cấy lỏng để tăng tỉ lệ phát hiện
25


PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (2)
MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube ➢ Tube MGIT chứa Middlebrook 7H9, OADC và
PANTA ➢ Đáy tube được phủ 1 lớp silicon chứa muối ruthenium
(ruthenium salt) đóng vai trị như 1 chất phát huỳnh quang. ➢ Bình thường, oxy hiện diện trong mơi
trường cấy sẽ che lấp
sự phát quang của muối ruthenium. ➢ Khi vi khuẩn sử dụng oxy để chuyển hóa và tăng sinh trong
môi trường nuôi cấy, lượng oxy trong môi trường sẽ giảm, sự phát quang ở đáy tube sẽ được nhìn
thấy khi xem dưới đèn UV ➢ Cần xác định sự hiện diện của AFB trong mẫu cấy
➢

26

13-Sep-1813

ĐỊNH DANH VI KHUẨN LAO (1)
Định danh vi khuẩn lao chủ yếu dựa vào các tính chất sau:

khuẩn sinh trưởng chậm  Nhiệt độ sinh trưởng 35 – 370C  Không sinh sắc tố
Niacin dương tính  Phản ứng Nitrate dương tính  Phản ứng catalase dương tính ở
 Khơng mọc trên mơi trường LJ có chứa 500mg/L p Vi

nitrobenzoic acid  Mọc trên mơi trường có chứa thiophen-2-carboxylic
13-Sep-1814

acid hydrazide (2μg/ml TCH)
27

TEST ĐỊNH DANH MTB COMPLEX
Phát hiện protein MPT 64 (kháng nguyên) do M.tb complex tiết ra trong môi trường cấy lỏng



28

JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Dec. 2011, p. 4343–4346

13-Sep-1814
13-Sep-1814

XÉT NGHIỆM VI SINH
29

CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜN
➢

Phương pháp kháng sinh đồ cổ điển: phương pháp tỉ lệ kháng
(proportional DST method)
▪ Là

phương pháp kháng sinh đồ gián tiếp

▪ Được

công nhận là chuẩn vàng trong chẩn đốn lao kháng thuốc

▪ Tính

chất kháng thuốc được xác định dựa trên tỉ lệ % của số khóm trùng đếm được ở ống m
trên ống môi trường không thuốc.
▪ Được


khuyến cáo thực hiện ở những bệnh nhân lao/nghi lao kháng thuốc: BN bỏ trị, thất bại

HIV...
▪ Rẽ

tiền
13-Sep-1815

▪ Thời

gian có kết quả từ 28 – 42 ngày kể từ khi có kết quả cấy dương tính
30

13-Sep-1815
13-Sep-1815


PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1)

Thuốc kháng lao hàng 1 Thuốc kháng lao hàng 2 INH Ofloxacin Streptomycin Amikacin Rifamp
Ethambutol Kanamycin
PAS Capreomycin
PZA: Phương pháp Wayne: positive: nhạy (có pyrazinamidase)
pyrazinamidase/MTB (pncA gene)
PZA (prodrug) Pyrazinoic acid (POA)

13-Sep-1816
dạng hoạt động của PZA, diệt MTB
31


Jonmalung et al. BMC Microbiology 2010, 10:223

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (3)

➢

Giải thích kết quả: vd: với tỉ lệ kháng 1%

▪ Nếu
▪ Nếu

tỉ lệ này <1%: chủng nhạy
tỉ lệ này≥1%: chủng kháng

32

13-Sep-1816
13-Sep-1816


BACTECTM MGITTM 960 SIRE/PZA
○Kháng
○Cơ

sinh đồ gián tiếp

chế hoạt động của máy tương tự MGIT 960

○Một


bệnh phẩm: Ống control
Ống INH 0.1μg/ml Ống RIF 1μg/ml Ống STR 1μg/ml Ống
EMB 1μg/ml

○Máy

tự so sánh độ phát quang đo được ở ống thuốc so với ống khơng thuốc để xác đ
nhạy/kháng thuốc
○Máy

tự động phân tích và báo kết quả 33

LINE PROBE SSAY – LPA GENOTYPE MTBDR-PLUS (1)
○Xét

nghiệm sinh học phân tử

○Phát

hiện M.tb complex trực tiếp từ mẫu đàm hoặc từ mẫu cấy dương

○Phát

hiện chủng kháng INH (đột biến gen katG và inhA)

○Phát

hiện chủng kháng RIF (đột biến trên gen ropB) trực tiếp từ mẫu đàm

○Thời


gian cho kết quả trong vịng 24 giờ
34

13-Sep-1817

Genotype®MTBDRplus – Version 1 (2)
Mẫu đàm soi dương:
Nhạy – RIF : 98.9% Đặc hiệu – 99.4%


Nhạy– INH: 94.2% Đặc hiệu – INH: 99.7%
Mẫu đàm soi âm
Khơng giải thích được kết quả:
RIF: 20% (n=4/20) INH: 26% (n=5/19)
Barnard, Am J Respir Crit Care Med, 2008
35

GENOTYPE®MTBDRPLUS (3)

Năm 2008, TCYTTG khuyến cáo:
➢

Áp dụng test SHPT này trong chẩn đoán sớm lao đa

kháng ➢ Chỉ áp dụng cho mẫu đàm soi dương hoặc mẫu cấy
dương ➢ Không thể thay thế hoàn toàn các phương pháp cấy
và kháng sinh đồ cổ điển
36


13-Sep-1818
13-Sep-1818
13-Sep-1818

XPERT MTB/RIF (1)
○Hệ thống khép kính
○Xét nghiệm trực tiếp từ mẫu đàm
○Phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng RIF
○Có kết quả trong 90 phút


○Tăng

tỉ lệ phát hiện khoảng 30% so với phương pháp soi
○Sử dụng tại tuyến cơ sở
37

XPERT MTB/RIF (2)
Độ nhạy Đặc hiệu Cấy (+) Soi (+) /cấy (+) Soi (-)/cấy(+) Không lao 3 mẫu đàm n=x/y (%)
604/616 (98.1) 2 mẫu đàm n=x/y (%)
723/741
566/567
157/174 (97.6)
(99.8)
(90.2)
1215/1232 (98.6) 1 mẫu đàm n=x/y (%)
1423/1482
1127/1134
296/348 (96.0)
(99.4)

(85.1)
675/732
551/561
124/171
604/609 (92.2)
(98.2)
(72.5)
(99.2
Catharina C Boehme et al. NEJM, 2010
38

13-Sep-1819

Năm 2010 - 2011, TCYTTG khuyến cáo:

➢ Ưu tiên áp dụng Xpert MTB/RIF trong chẩn đoán sớm lao và lao đa kháng, ở các đ
▪ Có nguy cơ mắc lao đa kháng
▪ Bệnh nhân HIV(+) có triệu chứng nghi ngờ mắc lao hoặc lao đa kháng


➢ Có thể áp dụng để chẩn đốn lao ở những bệnh nhân có 39triệu chứng nghi lao nhưn
nhóm ưu tiên

40

13-Sep-1820

TRIỂN KHAI ÁP DỤNG KỸ THUẬT ...
➢


KHV huỳnh quang LED: Thay thế KHV đèn
sáng và KHV huỳnh quang cổ điển

➢

Kỹ thuật SHPT (LPA): Chuẩn vàng, không thể
loại bỏ pp cấy và kháng sinh đồ cổ điển

➢

Xpert MTB/RIF: Thay thế cho phương pháp soi.


Xpert MTB/RIF khơng thể loại bỏ hồn tồn sự cần thiết của các pp soi, cấy và LPA
gần 41
13-Sep-1821

○ Xét

nghiệm dựa trên sự phát hiện kháng nguyên mycobacterial lipoarabinomannan (LAM) antigen t

○ Xét

nghiệm thực hiện trên mẫu nước tiểu nên có ưu điểm hơn so với xét nghiệm thực hiện trên mẫu
tiểu dễ thu thập và lưu trữ, và không có các nguy cơ kiểm sốt nhiễm khuẩn liên quan đến thu thập m
○ Kháng

nguyên LAM là một lipopolysaccharide hiện diện trong thành phần màng tế bào của mycob
phóng trong q trình chuyển hóa hoặc phân hủy tế bào vi khuẩn.
○ LAM


được tìm thấy nổi bật ở những người đang mắc lao; và có phản ứng chéo thấp với nhiễm myco

○ Sự

hiện diện của LAM trong nước tiểu có liên quan gián tiếp đến đáp ứng miễn dịch của người; và q
hiện nó có đóng góp vào việc phá triển các test POC có chi phí khơng đắt.
○ Có

độ nhạy chưa đạt yêu cầu, test LAM nước tiểu hiện tại khơng thích hợp để sàng lọc lao. Tuy nhiê
giống các phương pháp chẩn đốn lao khác, nó có độ nhạy được cải thiện ở nhóm HIV/Lao và cải thi
nếu CD4 thấp.
44

13-Sep-1822

1. Ngoại

trừ những trường hợp đặc biệt được nêu dưới đây đối

với người nhiễm HIV có CD4 thấp hoặc những người bệnh rất nặng, LF-LAM không được dùng
(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp).


2. LF-LAM

có thể được dùng để hỗ trợ chẩn đốn lao ở bệnh nhân người lớn ngoại trú nhiễm HIV có
lao (lao phổi/lao ngồi phổi) và có CD4 ≤ 100 cells/μL, hoặc người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất k
nhiêu/khơng biết số lượng CD4 (khuyến cáo có điều kiện, bằng chứng có chất lượng thấp).


Lưu ý:
▪ Khuyến

cáo này cũng áp dụng đối với BN HIV ngoại trú có triệu chứng mắc lao (LP/LNP) có CD4 ≤100 cells
người nhiễm HIV có bệnh rất nặng bất kể CD4 là bao nhiêu/khơng biết tình trạng CD4,
khái quát kết quả của BN nội trú.

▪ Khuyến

cáo này cũng áp dụng đối với BN HIV trẻ em có triệu chứng mắc lao (LP/LNP) , dựa trên khái quát kết qu
lớn.
13-Sep-1823
3. LF-LAM

không được dùng làm test sàng lọc lao

(khuyến cáo mạnh, bằng chứng có chất lượng thấp )
46

13-Sep-1823
13-Sep-1823
13-Sep-1823


WHO 2015, FL-LAM. Policy Guidance

13-Sep-1824

(02 mẫu cấy âm trên 2 mẫu đàm khác nhau)


(02 mẫu cấy âm trên cùng mẫu đàm hoặc khác mẫu đàm)

Có ít nhất 01 mẫu cấy âm

13-Sep-1825

1. TB-LAMP có thể được sử dụng như 01 xét nghiệm thay thế cho XN soi đàm để chẩn đoán lao phổ
có triệu chứng nghi lao (Khuyến cáo có điều kiện, bằng chứng có chất lượng thấp). 2. TB-LAMP có t
dụng như 01 XN hỗ trợ thêm XN soi đàm đối với những BN người lớn có triệu chứng nghi lao phổi, đ
cần làm thêm XN ở BN soi đàm âm tính (Khuyến cáo có điều kiện, bằng chứng có chất lượng thấp).


• Các khuyến cáo này được áp dụng ở những nơi có thực hiện
XN soi đàm trực tiếp.
• TB-LAMP khơng được sử dụng để thay thế các XN sinh học

phân tử nhanh để phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao kháng RIF, đặc biệt là ở nhóm BN có nguy
kháng thuốc.
• Chưa có bằng chứng để kết luận liệu TB-LAMP có giá trị chẩn
đốn hỗ trợ đối với XN soi đàm ở BN đồng nhiễm HIV có triệu chứng và dấu hiệu mắc lao.

• Các khuyến cáo này chỉ áp dụng đối với XN TB-LAMP trên mẫu đàm ở BN có triệu chứng và dấu h

• Các khuyến cáo này cũng được áp dụng ở trẻ em, dựa trên bằng chứng ở người lớn, vì viết rằng rất k
đam ở trẻ em.
13-Sep-1826

The TB diagnostics pipeline - FIND

XPERT MTB/RIF ULTRA