BỘ KIT PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN
E.COLI


Sinh viên thực
hiện

MSSV

Nguyễn Quang
Anh

2018039
9


1.1. SƠ LƯỢC VỀ VI
KHUẨN E.COLI
• Escherichia coli do Theeodore
Echerich(1857-1911) phát hiện lần đầu
năm 1885.
• E.coli là một trong những thành viên chính
của hệ vi khuẩn bình thường nhưng cũng là
căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng.
• E.coli được sử dụng nhiều trong cơng nghệ
sinh học.
• Là vi khuẩn được nguyên cứu sâu nhất và
cho đến nay vẫn được quan tâm, nghiên
cứu.

1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
• là trực khuẩn Gram âm.
• kích thước 2-5*0,5(*10^6)m,hầu hết có lơng và có khả
năng di động.
• tính chất ni cấy: dễ phát triển
ở nhiệt độ từ 5-40độ C trong môi
trường nuôi cấy thông thường
hoặc rất nghèo dinh dưỡng,hiếu
hay kị khí tùy ý.

• có khả năng lên men nhiều loại
đường và có sinh hơi.
• Kháng ngun: Kháng nguyên
O,K,H.
• Phát triển nhanh, thời gian thế
hệ khoảng từ 20-30 phút.


1.3. KHẢ NĂNG
GÂY BỆNH
Là vi khuẩn đứng đầu gây
tiêu chảy,viêm đường tiết
niệu, viêm đường mật…
Đứng đầu căn nguyên gây
nhiễm khuẩn huyết.
Là căn nguyên thường gặp
trong viêm màng não,
viêm phổi ở trẻ mới sinh.



1.4. PHÂN LOẠI
Dựa vào vị trí gây bệnh E.coli được phân thành hai
loại:
GÂY BỆNH NGỒI ĐƯỜNG
GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT

RUỘT

• EPEC: E.coli gây bệnh đường ruột.

• MAEC: E.coli gây viêm màng não

• ETEC: E.coli sinh độc tố ruột.

• UPEC: E.coli gây nhiễm khuẩn
đường tiết niệu

• EIEC: E.coli xâm nhập ruột.
• EAEC: E.coli ngưng tập ruột.
• DAEC: E.coli bám dính phân tán.
• EHEC: E.coli gây xuất huyết ruột.


Dựa vào cấu trúc kháng nguyên E.coli được chia
thành các loại huyết thanh.
Các type huyết thanh được kí hiệu bằng tên của các
kháng nguyên O và K.
Ví dụ: O86B7: yếu tố kháng nguyên O số 86; yếu tố
kháng nguyên K số 7 loại B.


1.4. PHÂN LOẠI


BỘ KIT PHÁT HIỆN NHANH CÁC VI
SINH VẬT GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
Thuật ngữ kit dùng để chỉ việc cung cấp hóa
chất, cơng cụ cần thiết để sử dụng một cách
nhanh chóng, hiệu quả cho một kĩ thuật sinh
học phân tử.

Có 2 loại KIT chẩn đốn nhanh:
Loại 1 dựa trên phản ứng PCR
Loại 2 dựa trên phản ứng Kháng
nguyên - Kháng thể.


PHƯƠNG PHÁP PCR( POLYMERASE
CHAIN REACTION)


phản ứng chuỗi polymerase

2.
Phươn
g
pháp
PRC

Phương pháp căn bản chạy PCR được
phát minh bởi Kary Mullis


cho phép khuếch đại chọn lọc một
chuỗi DNA mục tiêu mà không cần
sử dụng các sinh vật sống để thực
hiện

nghiên cứu y - sinh học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau


2.1.NGUYÊN LÝ CHUNG
• PCR là phản ứng liên quan đến q trình khuếch đại enzyme
qua trung gian DNA.
• PCR dựa trên việc sử dụng DNA polymerase để tổng hợp chuỗi
DNA mới bổ sung cho chuỗi mẫu được cung cấp.
• Phản ứng cần mồi vì DNA polymerase chỉ có thể thêm một
nucleotide vào nhóm 3′-OH có sẵn để thêm nucleotide đầu tiên.
DNA polymerase sau đó kéo dài đầu 3 của nó bằng cách thêm
nhiều nucleotide để tạo ra một vùng DNA chuỗi kép mở rộng.


2.2. THÀNH PHẦN CỦA PCR
• Mẫu DNA: DNA chuỗi kép (DSDNA) quan tâm, được tách ra khỏi mẫu.
• DNA polymerase: Thường là Taq polymerase chịu nhiệt, khơng biến tính
nhanh ở nhiệt độ cao (98°C) và có thể hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khoảng
70°C.
• Các mồi oligonucleotide: Các đoạn ngắn của chuỗi DNA đơn (thường là 2030 cặp bazơ) bổ sung cho đầu 3 của các chuỗi cảm thụ và kháng cảm của
chuỗi mục tiêu.
• Deoxynucleotide triphosphate: Đơn vị cơ sở A, T, G và C (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP) cung cấp năng lượng cho phản ứng trùng hợp và các khối xây dựng

để tổng hợp DNA.
• Hệ thống đệm: Bao gồm magiê và kali để cung cấp các điều kiện tối ưu cho
q trình biến tính và tái tạo DNA; cũng quan trọng đối với hoạt động
polymerase, tính ổn định và độ trung thực.



2.3 QUY TRÌNH PCR
• 1. Biến tính
Bước này liên quan đến việc làm nóng hỗn hợp phản ứng đến 94°C trong 15-30
giây. Trong thời gian này, DNA sợi kép bị biến tính thành các chuỗi đơn do bị
phá vỡ trong các liên kết hydro yếu.
• 2. Ủ
Nhiệt độ phản ứng nhanh chóng hạ xuống 54-60°C trong 20-40 giây. Điều này
cho phép các mồi liên kết (ủ) với trình tự bổ sung của chúng trong DNA mẫu.
• 3. Độ giãn dài
Cũng được biết đến khi mở rộng, bước này thường xảy ra ở 72-80°C (phổ biến
nhất là 72°C). Trong bước này, enzyme polymerase tuần tự bổ sung các bazơ
vào đầu 3′ mỗi mồi, mở rộng trình tự DNA theo hướng từ đầu 5′ đến 3′. Trong
điều kiện tối ưu, DNA polymerase sẽ thêm khoảng 1.000 bp/phút.


• 4. Lặp lại
Các bước từ 2 đến 4 được lặp lại 25 lần, tuy nhiên với mồi và polymerase tốt,
15 đến 20 chu kỳ có thể là đủ.
• 5. Bảo quản
Giữ hỗn hợp ở 7 °C. Tại nhiệt độ này DNA sẽ khơng bị hư hại trong vịng 1
đêm.
Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích thước của chúng qua việc sử
dụng điện di trên gel agarose. Điện di trên gel agarose là phương pháp bao

gồm việc nhỏ mẫu sản phẩm PCR của DNA vào gel agarose và sau đó chạy
điện di trên gel. Kết quả là các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các
đoạn lớn qua gel từ cực âm đến cực dương. Kích thước của sản phẩm PCR có
thể được xác định bằng việc so sánh vói thang DNA, thang này có chứa các
DNA đã biết trước kích thước, cũng nằm trong gel


2.6. ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP
PRC
ƯU ĐIỂM
• Thời gian cho kết quả nhanh.
• Có thể phát hiện được VSV khó ni cấy,
việc tăng sinh là đơn giản hoặc khơng cần
thiết.
• Hóa chất cần dùng cho phản ứng dễ tìm và
dễ tồn trữ.
• Dụng cụ và mơi trường đơn giản.
• Ít tốn kém về mặt nhân sự.

NHƯỢC ĐIỂM
• Mật độ VSV gây bệnh hiện diện trong
mẫu thực phẩm thường thấp.
• Không phân biệt được TB sống với TB
chết. => kết luận sai.
• Sự ức chế Taq DNA polymerase khó khăn
bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực
phẩm thường có thành phần phức tạp.


3.PHƯƠNG

PHÁP PCR PHÁT
HIỆN VI KHUẨN
E.COLI


3.1.Ngun tắc


Tổng hợp DNA dựa trên khn
mẫu là một trình tự đích DNA
ban đầu, khuếch đại, nhân số
lượng của bản sao này thành
hàng triệu ban sao nhờ hoạt
động của enyme Polymerase
và một cặp mồi đặc hiệu cho
đoạn DNA này.


3.2. Môi trường tăng sinh


Sử dụng môi trường tăng sinh pepton đệm có bổ
sung kháng sinh cefiximw (0,0125mg/l) và
vancomycin (8mg/l) => ức chế vi khuẩn Gram
dương và các vi khuẩn sống hoại sinh khác.


3.3. Môi trường
phân lập



Sử dụng các môi trường: MacConkey
(MAC), Sorbitol MacConkey (SMAC),
Sorbitol MacConkey có bổ sung cefixime
(0.05mg/l) và tellurite (2,5mg/l) (CTSMAC).



Khoảng 90% E.coli đều lên men đường
lactose, trên môi trường MAC, e.coli điển
hình khuẩn lạc màu đỏ, mơi trường SMAC
CT và-SMAC, e.coli không lên men đường
sorbitol => cho khuẩn lạc màu trắng,
những dòng E.coli lên men sorbitol cho
KL màu h



Trên từng loại môi trường, chọn ngẫu
nhiên 6-10 khuẩn lạc rời rạc đại diện cho
mỗi nhóm hình thái, cấy từng khuẩn lạc
được chọn trên thạch ống nghiêng NA.



Làm thí nghiệm sinh hóa IMViC cho từng
khuẩn lạc riêng lẻ thuộc nhóm đó để xác
định E.coli.