XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO SEN ĐÁ KIM
CƯƠNG (HAWORTHIA COOPERI VAR. TRUNCATA) TỪ GIAI
ĐOẠN KHỬ TRÙNG ĐẾN TẠO CÂY CON HỒN CHỈNH
Phan Thị Linh, Ngơ Nhựt Khương và Nguyễn Hữu Kiên*
Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh
GVHD:: TS. Trịnh Thị Lan Anh

TÓM TẮT
Sen đá Kim Cương (Haworthia cooperi var. Truncata) hay còn gọi là thực vật mọng nước thuộc họ
Asphodelaceae. Sen đá Kim Cương khơng chỉ đẹp mà lồi cây này còn đem đến may mắn, tài lộc, hạnh
phúc. Sen đá được nhân giống bằng phương pháp truyền thống khơng thể đáp ứng được nhu cầu của thị
trường. Vì vậy, điều cần thiết là phải xây dựng một quy trình nhân giống phù hợp tạo nguồn mẫu in vitro
sạch bệnh, tăng sinh mô, nhân chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh để cung cấp cây giống sen đá Kim cương đáp
ứng nhu cầu về chất lượng và số lượng. Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được quy trình nhân giống hoàn
chỉnh từ giai đoạn khử trùng đến tạo cây hồn chỉnh. Q trình khử trùng mẫu với chất khử trùng HgCl2 tốt
nhất ở nồng độ 0,100% có bổ sung Tween-20 trong 5 phút. Tỷ lệ tạo mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS
bổ sung 1,00 mg/L BA kết hợp 0,100 mg/L NAA; tạo chồi hiệu quả trên môi trường bổ sung 2,00 mg/L
BA; ra rễ tạo cây hoàn chỉnh tối ưu khi bổ sung 0,05 mg/L NAA vào mơi trường ni cấy.
Từ khóa: khử trùng, nhân giống, mô sẹo, sen đá Kim Cương (Haworthia cooperi var. Truncata), tạo cây
hoàn chỉnh.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, nhu cầu trồng cây xanh để trang trí trong nhà ngày càng tăng. Một trong những loại cây được ưa
thích đó là cây sen đá vì hình dáng, màu sắc, kiểu dáng đẹp, có nhiều chủng loại và màu sắc đa dạng đặc
tính dễ trồng, khơng tốn nhiều thời gian chăm sóc. Các loài thuộc chi Haworthia được trồng thương mại
làm vật trang trí và một số lồi q hiếm khá có giá trị kinh tế cao trên thị trường bán lẻ nhưng tốc độ tăng
trưởng chậm và khó nhân giống (Chen et al., 2019). Thông thường sen đá được nhân giống bằng phương
pháp truyền thống như tách cây con, hủy đỉnh, nhân giống bằng lá và nhân giống bằng hạt nhưng phương
pháp này tỷ lệ nảy mầm chưa cao (Bayer, 1982); (Pilbeam, 1983) và không thể đáp ứng được nhu cầu của
thị trường hiện nay về số lượng cũng như chất lượng cây giống (Chen et al., 2019). Các phương pháp này
phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố mơi trường (khí hậu, độ ẩm, nhiệt độ, ánh sáng,…) và thời gian để cây con
có thể hồn tồn tự phát triển khỏe mạnh rất lâu (Rogers, 1993); (Richwine et al., 1995); (Chen et al., 2019).

Vì những lý do đó việc nhân giống in vitro cây sen đá Kim Cương nói riêng và các lồi khác thuộc chi sen
đá nói chung là cần thiết. Phương pháp nhân giống in vitro khắc phục được hầu hết các khó khan do nhân
giống truyền thống; khơng bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường, tạo được cây con khỏe mạnh, không hạn
514


chế về số lượng, giúp cây có khả năng thích nghi với mơi trường bên ngồi, đáp ứng nhu cầu về chất lựng
và số lượng của thị trường.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
Cây sen đá Kim Cương được mua từ các trại sen đá trong thành phố. Lựa chọn cây khỏe mạnh, khơng có
sâu bệnh, đang trong thời kỳ phát triển tốt nhất, lá phát triển đầy đủ, khỏe mạnh khơng có dấu hiệu bị sốc
nhiệt. Để hạn chế tối thiểu khả năng nhiễm nấm, tiến hành để cây trong phịng kín, tưới nước đầy đủ và
phun thuốc trị nấm (dạng phun sương) 2 lần/ tuần trước khi vào mẫu khoảng 2 tuần.
2.2. Phương pháp
Mẫu được lựa chọn là các lá bánh tẻ. Sử dụng mũi dao số 11 đã được khử trùng cắt sát gốc; lưu ý: không
dùng tay để bẻ lá để giảm tổn thương cho mẫu, mang bao tay y tế cầm mẫu để giảm khả năng nhiễm cho
mẫu. Dùng khăn giấy sạch, mềm thấm nhựa cây sau đó gói mẫu lại để ở nơi mát khoảng 1 ngày cho vết
thương khô lại.
Giai đoạn khử trùng ngồi tủ cấy, khi lá đã khơ vết thương tiến hành rửa bằng xà phịng lỗng, xoa đều và
nhẹ cả hai bề mặt lá. Tiếp theo, lắc đều mẫu trong 1 phút với dung dịch Javel nồng độ 5 – 7%, rửa lại bằng
nước sạch 2 lần. Sau đó, cho mẫu chạy động lực học dưới vòi nước nước sạch khoảng 30 phút, dùng kẹp
sạch gắp mẫu vào bình erlen đã hấp khử trùng và đưa vào tủ cấy vô trùng. Trước khi đưa mẫu vào tủ cấy,
tủ phải được vệ sinh sạch bằng cồn 70 độ, bật UV trong khoảng 15 – 30 phút và khử trùng tủ thêm 1 lần
nữa bằng cồn 70 độ để đảm bảo tủ cấy được sạch khuẩn tuyệt đối.
Các thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Mơi trường sử dụng trong thí nghiệm là
mơi trường MS (Murashige và Shoog, 1962), tùy vào từng giai đoạn nuôi cấy mà các hóa chất khác nhau,
các chất điều hịa sinh trưởng khác nhau được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp.
Các chỉ tiêu theo dõi tiến hành theo phương pháp nghiên cứu sinh học thông dụng: tỷ lệ nhiễm và chết mẫu
(%), tỷ lệ sống sót (%), tỷ lệ tạo mô sẹo (%), tỷ lệ tạo chồi (%), tỷ lệ ra rễ, đặc điểm.

2.3. Thống kê và xử lý số liệu
Số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010®
và Statgraphics centurion 19; phân tích phương sai (ANOVA), với P ≤ 0,05.
2.4. Bố trí thí nghiệm
2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 đến quá trình khử trùng mẫu cấy
Chất khử trùng HgCl2 được khảo sát ở các nồng độ 0,025; 0,050; 0,075; 0,100 và 0,125% đối với giai đoạn
khử trùng mẫu trong tủ cấy. Mẫu được khử trùng bằng cồn 70 độ trong 30 giây, rửa lại bằng nước cất vô
trùng 3 – 4 lần; sau đó, mẫu được tiếp tục khử trùng bằng HgCl2 bổ sung 0,05% Tween-20 trong 5 phút,
sau đó rửa bằng nước cất vô trùng từ 5 – 6 lần và làm khô bằng giấy lọc đã tiệt trùng (Boling et al., 2017).
515


Mẫu sau khi khử trùng, dùng dao cắt bỏ lớp mỏng phần cuống bị tổn thương. Sau đó, cấy mẫu lá (không
cắt nhỏ) lên mặt thạch của môi trường, phần cuống lá ngay vị trí mặt cắt được cắm nhẹ vào môi trường.
Môi trường nuôi cấy MS bổ sung sucrose 3% (w/v) và làm đặc bằng agar 0,7% (w/v). pH của môi trường
được điều chỉnh đến 5,8 bằng NaOH 0,1 M hoặc HCl 0,1 M. Bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực
vật trước khi điều chỉnh pH và khử trùng. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Tất cả
các mẫu cấy được nuôi ở 24 ± 1oC chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày (Boling et al., 2017). Thu kết quả sau 12
tuần nuôi cấy.
2.4.2. Cảm ứng tạo mô sẹo
Các mẫu cấy sau khi khử trùng sẽ được cấy vào môi trường cảm ứng tạo mô sẹo. Môi trường nuôi cấy bao
gồm: môi trường MS cơ bản, bổ sung BA thay đổi (0,25; 0,50; 1,00 và 1,25 mg/L BA) kết hợp với sự thay
đổi nồng độ NAA (0,05; 0,075; 0,1 và 0,125 mg/L NAA). Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 2oC, cường
độ chiếu sáng: 1500 – 2000 lux, chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày (Boling et al., 2017) thu kết quả sau 12 tuần
nuôi cấy.
2.4.3. Phát sinh chồi từ mô sẹo
Mẫu mô sẹo được cấy vào môi trường sử dụng MS làm môi trường cơ bản, bổ sung 3% sucrose, 0,7% agar
và BA ở các nồng độ khác nhau (0,10; 0,15, 0,20; 0,25 mg/L), pH 5,8. Mẫu được ni cấy trong phịng
ni cấy ở nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux, chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày (Boling
et al., 2017) thu kết quả sau 8 tuần ni cấy.

2.4.4. Tạo cây con hồn chỉnh
Các chồi dài (chiều dài 1 – 1,5 cm) được cấy trên môi trường MS bổ sung NAA thay đổi (0,000; 0,025;
0,050; 0,075 mg/L) NAA cho sự hình thành rễ. Mẫu cấy được ni trong phòng ở nhiệt độ 25 ± 2oC, cường
độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux, chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày (Boling et al., 2017) thu kết quả sau 4 tuần.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của HgCl2 trong việc khử trùng mẫu
Sau 12 tuần nuôi cấy, thu kết quả và trình bày ở bảng 1.
Bảng 1: Ảnh hưởng của HgCl2 đến quá trình khử trùng mẫu
Nồng độ (%)

Tỷ lệ nhiễm và chết mẫu (%)

Tỷ lệ sống sót (%)

0,025

80,1a

19,9e*

0,050

64,4b

35,6d

0,075

50,3c


49,7c

516


0,100

11,9e

88,1a

0,125

29,7d

70,3b

*Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.

Từ kết quả thu được ở bảng 1, cho thấy khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở nồng độ 0,100% cho kết quả tốt nhất
(hình 1), kết quả này tương tự với kết quả trong các quy trình vào mẫu cây sen đá đã được báo cáo (Boling
et al., 2017). Vì vậy, khi vào mẫu sen đá Kim cương sử dụng HgCl2 ở nồng độ 0,100%.
3.2. Cảm ứng tạo mô sẹo
Sau 8 tuần nuôi cấy, thu kết quả và trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Ảnh hưởng của BA và NAA dến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo
BA (mg/L)

NAA (mg/L)

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)


0,25

0,050

1,1h*

0,25

0,075

5,0h

0,25

0,100

13,3g

0,25

0,125

20,2g

0,50

0,050

44,3fg


0,50

0,075

52,2f

0,50

0,100

60,4ef

0,50

0,125

66,7e

1,00

0,050

75,3c

1,00

0,075

80,1b


1,00

0,100

90,1a

1,00

0,125

87,2b

1,25

0,050

83,1bc

517


1,25

0,075

79,0c

1,25


0,100

75,2c

1,25

0,125

71,0d

*Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.

Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ở bảng 2, cho thấy có sự tương tác giữa 2
chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA và NAA đối với mẫu cấy sen đá Kim cương; ở nồng độ 1,00 mg/L
BA kết hợp với 0,100 mg/L NAA cho kết quả tạo mơ sẹo nhiều và tốt nhất (hình 2), kết quả này tương tự
với kết quả nghiên cứu trên sen đá đã được báo cáo (Wang et al., 2017; Chen et al., 2019). Nhưng khác với
nghiên cứu của của Boling và cộng sự (2017), kết quả cho thấy khi ni cấy mơ sẹo trên mơi trường MS
có bổ sung 1,0 mg/L BA và 0,2 mg/L 2,4-D cho kết quả tạo mô sẹo tối ưu trên đối tượng sen đá.
3.3. Phát sinh chồi từ mô sẹo
Sau 8 tuần nuôi cấy, thu kết quả và trình bày ở bảng 3.
Bảng 3: Ảnh hưởng của BA đến quá trình tạo chồi
BA (mg/L)

Tỷ lệ tạo chồi (%)

0,10

58,3c*

0,15


75,1b

0,20

80,5a

0,25

75,5b

*Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.

Từ kết quả thu được ở bảng 3 cho thấy bổ sung BA ở 0,20 mg/L cho số lượng, hình thái, màu sắc chồi tốt
nhất. Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu của Chen và cộng sự (2019).
3.4. Tạo cây con hồn chỉnh
Sau 4 tuần ni cấy, thu kết quả và trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của NAA đến q trình ra rễ tạo cây hồn chỉnh
Nồng độ (mg/L)

Tỷ lệ ra rễ (%)

0,000

0,0d*

518


0,025


58,1c

0,050

79,3a

0,075

70,2b

*Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05.

Ra rễ tạo cây hồn chỉnh là một trong những giai đoạn quan trọng trong nhân giống in vitro, bộ rễ phải
khỏe mạnh và phát triển đầy đủ thì mới có thể đưa cây con ra ngoài vườn ươm. Kết quả khảo sát nồng độ
NAA bổ sung vào môi trường ra rễ sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy, ở nồng độ 0,050 mg/L cho kết quả bộ rễ
phát triển tốt nhất (hình 3).

Hình 1: Chồi và sự phát sinh mô sẹo ở mẫu cấy cây sen đá Kim Cương sau khi tiến hành khử trùng với
HgCl2 ở nồng độ 0,100%, sau 12 tuần nuôi cấy

519


Hình 2: Mơ sẹo và sự phát sinh chồi từ mô sẹo ở cây sen đá Kim Cương khi bổ sung 1,00 mg/L BA kết
hợp với 0,10 mg/L NAA sau 8 tuần ni cấy

Hình 3: Sự ra rễ tạo cây hồn chỉnh ở cây sen đá Kim Cương ở mơi trường bổ sung 0,050 mg/L NAA sau
4 tuần nuôi cấy
4. Kết luận

Quá trình khử trùng mẫu bằng HgCl2 cho thấy nồng độ 0,100% thích hợp cho khử trùng mâu 4 cấy lá sen
đá Kim cương. Quá trình cảm ứng tạo mô sẹo, cho thấy sự kết hợp giữa 1,00 mg/L, BA với 0,10 mg/L
NAA cho khả năng tạo mô sẹo tốt nhất. Cảm ứng tạo chồi trên mẫu mô sẹo sen đá Kim Cương với nồng
độ BA 2,0 mg/L cho tỷ lệ bật chồi cao và chồi phát triển rất tốt. Giai đoạn cuối cùng, tạo cây hoàn chỉnh
với nồng độ 0,050 mg/L NAA rễ phát triển khá tốt. Các kết quả của nghiên cứu này có thể sử dụng trong
520


nhân giống in vitro cây sen đá Kim Cương nói riêng và các lồi sen đá nói chung. Tuy nhiên, đối với từng
loài cụ thể cần được nhiên cứu thêm để đạt được kết quả tốt nhất và rút ngắn thời gian nhân nhanh cây con
phục vụ cây giống chất lượng cao cho nhu cầu thị trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Bayer M.B. (1982). The new Haworthia handbook. Cape and Transvaal Printers, Capetown.
[2]. Boling L., Hongzhou F., Chaorong M., Ming C., Qingdong C. (2017). Establishment of a Rapid and
Effificient Micropropagation System for Succulent Plant Haworthia turgida Haw. Hortscience, 52 (9):
1278-1282.
[3]. Murashige T., Skoog F.A. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue
cultures. Physiol. Plant, Compenhagem, 15:473-479.
[4]. Ogihara Y., K. Tsunewaki. (1978). Tissue culture in Haworthia. I. Effects of auxins and kinetin on
callus growth. Bot. Mag. Tokyo, 91:83-91.
[5]. Ogihara Y. (1979). Tissue culture in Haworthia. II. Effects of three auxins and kinetin on greening and
redifferentiation of calluses. Bot. Mag. Tokyo, 92:163-171.
[6]. Pilbeam J. (1983) Haworthia and Astroloba: a collector’s guide. B.T. Batsford, London.
[7]. Richwine A.M., Tipton J.L., Thompson G.A. (1995). Establishment of Aloe, Gasteria, and Haworthia
shoot cultures from inforescence explants. Hortscience, 30:1443-1444.
[8]. Rogers S.M.D. (1993). Optimization of plant regeneration and rooting from leaf explants of fve rare
Haworthia. Sci Hortic, 56:157-161.
[9]. Wang Y., Mu H., Yongping L.V., Li H., Wang Y., Chen J. (2017). In vitro plant regeneration and tissue
culture industrialized proliferation of Shoujin. Acta Botany Chinese Bulletin of Botany, 52 (3): 331-336.
[10]. Yen-Ming C., Jian-Zhi H., Ting-Wen H., Chun P. (2019). Efects of light intensity and plant growth

regulators on callus proliferation and shoot regeneration in the ornamental succulent Haworthia.
Springer Botanical Studies, 60 (10): 1-8.

521