PHẢN ỨNG
PHẢN ỨNG


Kháng nguyên – Kháng thể
Kháng nguyên – Kháng thể
PGS. TS.
PGS. TS.
Cao Minh Nga
Cao Minh Nga
BM Vi sinh - Khoa Y - ĐH Y Dược TP. HCM
BM Vi sinh - Khoa Y - ĐH Y Dược TP. HCM
KHÁI NIỆM
KHÁI NIỆM

ĐN:
ĐN:
Là những ph
Là những ph
ươ
ươ
ng pháp miễn dịch học (MDH)
ng pháp miễn dịch học (MDH)

Mục
Mục
đ
đ
ích:
ích:
Xác

Xác
đ
đ
ịnh hoặc / và
ịnh hoặc / và
- chuẩn
- chuẩn
đ
đ
ộ một KN
ộ một KN
-
-
đ
đ
ịnh l
ịnh l
ư
ư
ợng hiệu giá một KT
ợng hiệu giá một KT
-
-
đ
đ
o l
o l
ư
ư
ờng một phức hợp KN-KT

ờng một phức hợp KN-KT
-
-
đ
đ
o l
o l
ư
ư
ờng các nhân tố
ờng các nhân tố
≠
≠
tham gia / hệ thống MD.
tham gia / hệ thống MD.
VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể.
VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể.
Nguyên lý phản ứng KN-KT
Nguyên lý phản ứng KN-KT

Tính
Tính
đ
đ
ặc hiệu
ặc hiệu
αa
αb
b
a

c
Kháng nguyên A
αc
Kháng nguyên
Kháng nguyên
•
Điểm quyết định KN (epitope):
phần trên phân tử KN có khả
năng liên kết đặc hiệu vào phần
liên kết với KN trên phân tử KT
Tương tác KN - KT
Tương tác KN - KT
Hiện tượng vùng
Hiện tượng vùng
PHÂN LOẠI
PHÂN LOẠI
A. PƯ dựa trên sự tạo thành “hạt”:
A. PƯ dựa trên sự tạo thành “hạt”:
1. PƯ kết tủa (
1. PƯ kết tủa (
precipitation reaction
precipitation reaction
): KN hòa tan.
): KN hòa tan.
2. PƯ ng
2. PƯ ng
ư
ư
ng kết (

ng kết (
agglutination reaction
agglutination reaction
): KN hữu hình
): KN hữu hình
B. PƯ dựa trên hoạt
B. PƯ dựa trên hoạt
đ
đ
ộng sinh học của KT:
ộng sinh học của KT:
1. PƯ kết hợp bổ thể (
1. PƯ kết hợp bổ thể (
complement binding reaction
complement binding reaction
)
)
2. PƯ trung hòa (
2. PƯ trung hòa (
neutralization reaction
neutralization reaction
)
)
C. PƯ MD
C. PƯ MD
đ
đ
ánh dấu:
ánh dấu:
1. PƯ MD huỳnh quang (

1. PƯ MD huỳnh quang (
immunofluorescence reaction
immunofluorescence reaction
)
)
2. PƯ MD men (
2. PƯ MD men (
enzyme linked immunosorbent assay
enzyme linked immunosorbent assay
– ELISA)
– ELISA)
3. PƯ MD phóng xạ (
3. PƯ MD phóng xạ (
radio immmuno assay
radio immmuno assay
- RIA).
- RIA).
4. Thử nghiệm xác
4. Thử nghiệm xác
đ
đ
ịnh Westein Blot (dấu thấm MD).
ịnh Westein Blot (dấu thấm MD).
Các phản ứng MD có
Các phản ứng MD có
đ
đ
ộ nhạy khác nhau
ộ nhạy khác nhau





µ
µ


 
 
!"
!"


-
-
#!$
#!$
Mancini
Mancini




-
-
#!#
#!#
Ouchterlony
Ouchterlony





-
-
$%
$%
Immuno electrophoresis
Immuno electrophoresis


&'
&'
(
(
)'
)'
*
*
+'
+'


#"
#"
,!
,!


-

-




,-#.
,-#.


'/+
'/+
'/'')
'/'')
'/'')
'/'')
0$12..03
0$12..03
'/)
'/)
4%1!5 673
4%1!5 673
'/)
'/)
819:7;
819:7;
'/''')
'/''')


81<5=7;

81<5=7;
'/''')
'/''')


* C
* C
ác phản ứng MD
ác phản ứng MD
th
th
ư
ư
ờng dùng
ờng dùng
trong Vi sinh lâm sàng
trong Vi sinh lâm sàng
A.
A.
PƯ ng
PƯ ng
ư
ư
ng kết
ng kết


(agglutination reaction)
(agglutination reaction)





- Ng
- Ng
ư
ư
ng kết:
ng kết:
nhóm máu, nhóm VKĐR, …
nhóm máu, nhóm VKĐR, …
- Latex, ng
- Latex, ng
ă
ă
n ng
n ng
ư
ư
ng kết (HI)
ng kết (HI)
B.
B.
PƯ MD
PƯ MD
đ
đ
ánh dấu:
ánh dấu:
- MDHQ (IF),

- MDHQ (IF),
- ELISA
- ELISA


A
A
.
.


PƯ ng
PƯ ng
ư
ư
ng kết
ng kết


(agglutination reaction)
(agglutination reaction)
Kháng nguyên
IgG
IgM
A
C
B
Phản ứng ngưng kết
- A: không xảy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn
vào một KN

- B: xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các KN
- C: rất dễ xảy ra khi KT là loại IgM
Kháng nguyên
Tạo mạng
Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp
Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp
(
(
thụ
thụ
đ
đ
ộng
ộng
)
)
* NK hồng cầu thụ
* NK hồng cầu thụ
đ
đ
ộng
ộng


KN hoặc hapten
KN hoặc hapten
KT / mẫu
KT / mẫu
gắn trên giá khoác
gắn trên giá khoác

Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp
Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp
(thụ
(thụ
đ
đ
ộng) - 2
ộng) - 2
* NK hồng cầu thụ
* NK hồng cầu thụ
đ
đ
ộng
ộng
đ
đ
ảo ng
ảo ng
ư
ư
ợc
ợc




KT / giá khoác
KT / giá khoác



KN / mẫu
KN / mẫu


PHẢN ỨNG NGĂN NG
PHẢN ỨNG NGĂN NG
Ư
Ư
NG KẾT HỒNG CẦU
NG KẾT HỒNG CẦU
(Hemagglutination Inhibition - HI)
(Hemagglutination Inhibition - HI)
B. C
B. C
ác phản ứng MD
ác phản ứng MD
đ
đ
ánh dấu
ánh dấu
1.
1.
MD huỳnh quang
MD huỳnh quang


(immunofluorescence -
(immunofluorescence -
IF
IF

)
)


VD:
VD:
∆
∆
RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae, …
RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae, …
*
*
Đếm tế bào dòng chảy
Đếm tế bào dòng chảy
(flow cytometry):
(flow cytometry):
đ
đ
ếm & phân loại TB.
ếm & phân loại TB.


2.
2.
MD men
MD men


(
(

enzyme linked immunosorbent assay
enzyme linked immunosorbent assay
– ELISA).
– ELISA).


VD:
VD:
∆
∆
HBV, HCV, HIV, Rubella, …
HBV, HCV, HIV, Rubella, …
1.
1.


PƯ MD huỳnh quang
PƯ MD huỳnh quang


(
(
immunofluorescence reaction
immunofluorescence reaction
) - IF
) - IF
1.
1.



PƯ MD huỳnh quang
PƯ MD huỳnh quang
: nguyên lý
: nguyên lý
Định týp virus DEN bằng IF với KT
Định týp virus DEN bằng IF với KT
đơ
đơ
n dòng
n dòng
(
(
thuốc nhuộm
thuốc nhuộm
fluorescein
fluorescein
)
)
Virus sởi tạo hợp bào từ các TB Vero bị nhiễm.
Virus sởi tạo hợp bào từ các TB Vero bị nhiễm.
Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi
Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi
đ
đ
ã biết.
ã biết.
(
(
thuốc nhuộm
thuốc nhuộm

rhodamin
rhodamin
)
)


2. PHẢN ỨNG
2. PHẢN ỨNG


ELISA
ELISA


(E
(E
nzyme
nzyme
L
L
inked
inked
I
I
mmuno
mmuno
S
S
orbent
orbent

A
A
ssay
ssay
)
)
*
*


Mục
Mục
đ
đ
ích
ích
:
:


đ
đ
ịnh l
ịnh l
ư
ư
ợng KN hoặc KT hòa tan / dịch sinh học
ợng KN hoặc KT hòa tan / dịch sinh học
.
.

*
*


Nguyên lý c
Nguyên lý c
ơ
ơ
bản
bản
:
:
KT/pha rắn + KN/mẫu + KT
KT/pha rắn + KN/mẫu + KT
E
E
+
+
Subtrate
Subtrate


KN/pha rắn + KT/mẫu + Kháng KT
KN/pha rắn + KT/mẫu + Kháng KT
E
E
+
+
Subtrate
Subtrate



→
→


màu: So màu (mắt / máy
màu: So màu (mắt / máy
đ
đ
o OD)
o OD)
*
*


Kỹ thuật thực hiện
Kỹ thuật thực hiện
:
:


- "
- "
Cạnh tranh”
Cạnh tranh”
- "
- "
Không cạnh tranh
Không cạnh tranh

"
"
Nhỏ H2SO4, giếng phản ứng: màu vàng. λ
max = 450 - 610nm
Rửa, nhỏ TMB,
giếng phản ứng: chuyển sang màu xanh
KT đã biết có enzyme sẽ gắn với KN còn lại
trong giếng
KT / mẫu gắn vào KN đã biết trên bề mặt
giếng
Phủ KN đã biết trên bề mặt của giếng
E
E E
E
E
H
2
SO
4
E E
E
E E
E
E
E
E E
TMB
a. MD cạnh tranh ELISA:
Nguyên lý kỹ thuật định lượng KT
MD cạnh tranh ELISA

MD cạnh tranh ELISA
Phản ứng màu
Phản ứng màu
tỉ lệ nghịch
tỉ lệ nghịch


với nồng độ kháng thể
với nồng độ kháng thể
b. ELISA theo phương pháp “sandwich”
b. ELISA theo phương pháp “sandwich”
c. ELISA “Tóm bắt”: MAC-ELISA
c. ELISA “Tóm bắt”: MAC-ELISA




(Ig
(Ig
M
M


a
a
ntibody
ntibody
c
c
apture-ELISA)

apture-ELISA)
Máy đo quang
Máy ủ
Máy rửa
Kháng IgM
IgM 4
KN đã biết
Cộng hợp
Cơ chất
Đo Mật độ quang (OD)
Giếng
Giếng
đ
đ
ã
ã
đư
đư
ợc gắn một l
ợc gắn một l
ư
ư
ợng KN nhất
ợng KN nhất
đ
đ
ịnh
ịnh