ỦY BAN NHÂN DÂN
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----oOo-----

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----oOo-----

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐÁNH GIÁ, XÁC ĐỊNH BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA VÀ HÌNH
THÁI KẾT HỢP BẢO TỒN MỘT SỐ GIỐNG LAN HỒNG THẢO
(Dendrobium spp.) CĨ GIÁ TRỊ.

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH
Chủ nhiệm đề tài:

TS. HUỲNH HỮU ĐỨC

TP. Hồ Chí Minh, Tháng …/2021


ỦY BAN NHÂN DÂN
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----oOo-----

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----oOo-----

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐÁNH GIÁ, XÁC ĐỊNH BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA VÀ HÌNH
THÁI KẾT HỢP BẢO TỒN MỘT SỐ GIỐNG LAN HỒNG THẢO
(Dendrobium spp.) CĨ GIÁ TRỊ.
Chủ nhiệm nhiệm vụ

Huỳnh Hữu Đức
Cơ quan chủ trì nhiệm vụ

TS. Nguyễn Đăng Quân

TP. Hồ Chí Minh, Tháng …/2021


TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-----oOo-----


-----oOo-----

Tp. Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2021
BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN
I. THÔNG TIN CHUNG VỀ NHIỆM VỤ
1. Tên nhiệm vụ: Đánh giá, xác định bằng chỉ thị phân tử DNA và hình thái kết hợp bảo
tồn một số giống lan Hồng thảo (Dendrobium spp.) có giá trị.
2. Chủ nhiệm nhiệm vụ:
- Họ và tên: TS. Huỳnh Hữu Đức
- Ngày tháng năm sinh: 1982 Giới tính: Nam
- Học hàm, Học vị: Tiến sỹ. Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Năm đạt học vị: 2014
- Chức danh khoa học:
Năm được phong chức danh:
- Tên cơ quan đang công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM
- Chức vụ: Phó trưởng phịng Thực Nghiệm cây trồng
- Địa chỉ cơ quan: 2374 quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp. HCM
- Điện thoại: 02837153792
Fax: 02838916997
- Địa chỉ nhà riêng: Phường Tân Phú, Quận 9, Tp Hồ Chí minh
- Điện thoại nhà riêng:
- Điện thoại di động: 0967 137 046
- E-mail:
3. Tổ chức chủ trì nhiệm vụ
- Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm cơng nghệ sinh học TP.HCM
- Điện thoại: 028.37153792
Fax: 028.38916997
- E-mail:
Website: www.hcmbiotech.com.vn
- Địa chỉ: 2374 quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Q12, Tp.HCM

- Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Dương Hoa Xô
- Số tài khoản: 9527.2.1007645
- Kho bạc Nhà nước/Ngân hàng: Tại kho bạc Nhà nước TP. HCM
II.TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 5 năm 2019 đến tháng 5 năm 2021
- Thực tế thực hiện: từ tháng 5 năm 2019 đến tháng 5 năm 2021
- Được gia hạn (nếu có):
- Lần 1 từ tháng…năm……đến tháng năm………
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí
a. Tổng số kinh phí thực hiện: 1.424.000.000 đồng trong đó:
- Kinh phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 1.424.000.000 đồng
1


-

Kinh phí từ các nguồn khác: 0 đồng

b. Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học
Theo kế hoạch
Thực tế đạt được
TT Thời gian
Kinh phí
Thời gian
Kinh phí
(tháng, năm)
(đồng)
(tháng, năm)
(đồng)

1
05/2019
1.424.000.000 05/2020
1.424.000.000

Ghi chú
(số đề nghị
quyết tốn)

c. Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi
Theo kế hoạch
T
T
1
2
3
4
5

Nội dung các
khoản chi

Tổng

Thực tế đạt được
Nguồn
khác

NSKH


Công lao động
517.288.500
517.288.500
trực tiếp
Nguyên vật liệu,
807.271.580
807.271.580
năng lượng
Thiết bị máy móc
Xây dựng sửa
chữa
Chi khác
99.439.920
99.439.920
1.424.000.000 1.424.000.000
Tổng cộng
- Lý do thay đổi (nếu có):

Tổng

Ngu
ồn
khác

NSKH

0

517.288.500


517.288.500

-

0

807.271.580

807.271.580

-

-

-

-

-

-

-

-

-

0
0


99.439.920
99.439.920
712.000.000 1.424.000.000

3. Các văn bản hành chính trong q trình thực hiện đề tài/dự án
(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ cơng đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh
phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện...nếu có); văn bản của tổ
chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh…nếu có)
TT Số, thời gian ban hành văn bản
Tên văn bản
Ghi chú
Số
355/QĐ-SKHCN
ngày Quyết định về phê duyệt nhiệm vụ
1
26/04/2019
nghiên cứu khoa học và công nghệ
Số 12/2019/HĐ-QPTKHCN ngày Hợp đồng thực hiện nhiệm vụ nghiên
2
09/05/2019
cứu khoa học và công nghệ
4. Các tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ
Tên tổ chức đã
Tên tổ chức đăng
TT
tham gia thực
ký theo thuyết minh
hiện
1

-

Nội dung
tham gia chủ
yếu

Sản phẩm chủ
Ghi
yếu đạt được
chú

Lý do thay đổi (nếu có):

5. Các cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp không quá 10
người kể cả chủ nhiệm)
T
T
1
1

Tên cá nhân
đăng ký theo
Thuyết minh
2
TS. Huỳnh
Hữu Đức

Tên cá nhân
tham gia thực

hiện
3
TS. Huỳnh
Hữu Đức

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt
được

4
5
Chủ nhiệm đề tài, thực Chủ nhiệm đề tài, thực hiện
hiện và theo dõi chung các và theo dõi chung các nội
nội dung
dung
2

Ghi
chú


2
3
4

TS. Dương
Hoa Xô
TS. Hà Thị
Loan


TS. Dương
Hoa Xô
TS. Hà Thị
Loan

ThS. Nguyễn
Trường Giang

ThS. Nguyễn
Trường Giang

ThS. Nguyễn
ThS. Nguyễn
Thị Thu Hằng
Thị Thu Hằng
KS. Nguyễn
KS. Nguyễn
Thị Xuân Hiền Thị Xuân Hiền
KS. Nguyễn
KS. Nguyễn
Hoàng Cẩm Tú Hoàng Cẩm Tú
ThS. Nguyễn
ThS. Nguyễn
Tấn Đức
Tấn Đức
ThS. Võ Minh
ThS. Võ Minh
Phát
Phát

- Lý do thay đổi (nếu có):

5
6
7
8
9

Thực các nội dung chính
của nội dung 1
Thực các nội dung chính
của nội dung 1
Thực hiện một số nội dung
chính trong phịng thí
nghiệm
Thực các nội dung chính
của nội dung 1, 5
Thực các nội dung chính
của nội dung 1, 5
Thực các nội dung chính
của nội dung 2,3,4
Thực các nội dung chính
của nội dung 5
Thư ký đề tài, thực hiện
một số nội dung chính

6. Tình hình hợp tác quốc tế
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
TT

điểm, tên tổ chức hợp tác, ssoos
đồn, số lượng người tham gia…)
1
-

Tham gia thực hiện nội
dung 2,3,4,6
Tham gia thực hiện nội
dung 1,5
Tham gia thực hiện nội
dung 1,5
Tham gia thực hiện nội
dung 2,3,4
Tham gia thực hiện nội
dung 5
Thư ký đề tài, tham gia thực
hiện nội dung 3,4,5

Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, ssoos
đoàn, số lượng người tham gia…)

Ghi chú

Lý do thay đổi (nếu có):

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

TT
điểm,)
1
-

Tham gia thực các nội dung
1
Tham gia thực các nội dung
1

Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm …)

Ghi
chú

Lý do thay đổi (nếu có):

8. Tóm tắt các nội dung, cơng việc chủ yếu
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong
nước và ngoài nước)
Thời gian
(Bắt đầu, kết thức -tháng/năm)
Theo kế
Thực tế đạt
hoạch
được

TT


Các nội dung, công việc chủ yếu cần
được thực hiện
(Các mốc đánh giá chủ yếu)

1

Nội dung 1: Thu thập, đánh giá chọn
lọc một số giống lan Hoàng thảo
(Dendrobium)

5/2019 –
04/2020

5/2019 –
04/2020

Huỳnh Hữu Đức,
Dương Hoa Xô, Hà
Thị Loan, Nguyễn Thị
Thu Hằng, Nguyễn Thị
Xuân Hiền

2

Nội dung 2. Xây dựng cơ sở dữ liệu
nguồn gen cho một số giống lan
Hoàng thảo dựa trên chỉ thị phân tử
DNA barcode
Công việc 1. Xây dựng quy trình ly

trích DNA tổng số thích hợp cho mẫu
lan.

8/20191/2021

8/20191/2021

Huỳnh Hữu Đức,
Nguyễn
Trường
Giang, Nguyễn Hoàng
Cẩm Tú

3

Người, cơ quan thực
hiện


3

Công việc 2. Khảo sát, đánh giá và xây
dựng bộ marker phân tử DNA barcode
cho một số giống lan Hoàng thảo
Cơng việc 3. Xây dựng cơ sở dữ liệu
trình tự DNA của các DNA barcode để
đánh giá mối quan hệ di truyền và xác
định một số giống lan Hoàng thảo thu
thập
Cơng việc 4. Đánh giá nguồn gen và

phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên
trình tự DNA barcode cho các giống lan
Hoàng thảo thu thập
Nội dung 3. Xây dựng cơ sở dữ liệu
nguồn gen cho các giống lan Hoàng
thảo thu thập dựa trên chỉ thị phân tử
SSR
Công việc 1. Khảo sát, đánh giá và xây
dựng bộ marker phân tử SSR cho các
mẫu giống lan Hồng thảo thu thập
Cơng việc 2. Xây dựng cơ sở dữ liệu
phân tử SSR để đánh giá mối quan hệ di
truyền và xác định cho các mẫu giống
lan Hồng thảo thu thập
Cơng việc 3. Phân tích mối quan hệ di
truyền dựa trên marker phân tử SSR cho
các giống lan Hoàng thảo thu thập

8/20191/2021

-

4

Nội dung 4. Lưu trữ in vitro một số
giống lan Hồng thảo có giá trị.

05/202001/2021

-


5

Nội dung 5. Thiết lập cơ sở dữ liệu
hình thái và di truyền một số giống
lan Hoàng thảo phục vụ công tác bảo
tồn và định danh

05/202001/2021

-

6

Nội dung 6: Xử lý số liệu, viết báo cáo

11/2020 –
4/2021

-

-

Huỳnh Hữu Đức,
Nguyễn
Trường
Giang, Nguyễn Hoàng
Cẩm Tú, Võ Minh Phát

Huỳnh Hữu Đức,

Nguyễn
Trường
Giang, Nguyễn Hoàng
Cẩm Tú, Võ Minh Phát
Huỳnh Hữu Đức, ,
Nguyễn Thị Thu Hằng,
Nguyễn Thị Xuân
Hiền, Võ Minh Phát,
Nguyễn Tấn Đức
Huỳnh Hữu Đức,
Nguyễn Trường Giang

Lý do thay đổi (nếu có):

III. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra
a. Sản phẩm dạng I
Tên sản phẩm cụ thể và chỉ
Đơn
Số
Thực tế
TT
Theo kế hoạch
tiêu chất lượng chủ yếu
vị
lượng
đạt được
Bộ giống lan hoàng thảo
20 giống lan Hoàng
1 (Dendrobium spp.) rừng thuần Giống 20

45
thảo
hóa
5-10 giống lan Hồng
2 Lưu trữ ở điều kiện in vitro
Giống 5-10
10
thảo
4


- Lý do thay đổi (nếu có):
b. Sản phẩm dạng II
TT

Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học cần đạt
Theo kế hoạch
Thực tế đạt được

Ghi
chú

Quy trình ly trích DNA tổng
01 quy trình
01 quy trình
số
Cơ sở dữ liệu trình tự DNA
Sàng lọc được bộ chỉ thị

dựa trên chỉ thị phân tử 01 bộ cơ sở dữ liệu phân tử DNA barcode để
2
DNA barcode cho một số DNA barcode
xây dựng bộ cơ sở dữ
giống lan
liệu DNA barcode
Sàng lọc được bộ chỉ thị
Cơ sở dữ liệu SSR một số 01 bộ cơ sở dữ liệu
3
phân tử SSR để xây dựng
giống lan
SSR
bộ cơ sở dữ liệu SSR
01 kết quả di truyền
Kết quả phân tích di truyền
Đã đánh giá mối quan hệ
dựa trên các marker
dựa trên các marker phân tử
di truyền của 45 mẫu
phân tử DNA barcode
4 DNA barcode và SSR để
giống lan dựa trên chỉ thị
01 kết quả di truyền
phục vụ công tác lai tạo và
phân tử DNA barcode và
dựa trên các marker
bảo hộ giống
chỉ thị phân tử SSR
phân tử SSR
- Lý do thay đổi (nếu có):

c. Sản phẩm dạng III
Yêu cầu khoa học cần đạt
Số lượng, nơi công bố
TT Tên sản phẩm
Theo kế hoạch
Thực tế đạt được (Tạp chí, nhà xuất bản)
01 báo cáo tổng
1
Báo cáo tổng kết 01 báo cáo tổng kết
kết
Tuyển tập báo cáo khoa
02 Bài đăng trên tạp
2
Bài báo
03 bài báo
học hội nghị cơng nghệ
chí chun ngành
sinh học tồn quốc 2020
- Lý do thay đổi (nếu có):
d. Kết quả đào tạo
Kết quả
Tên sản phẩm
Ghi chú
TT
(Thời gian kết thúc)
Theo kế hoạch
Thực tế đạt được
đăng ký
01 sinh viên Trường Đại
học Công nghiệp thực

phẩm Tp Hồ Chí Minh
(Phan Nguyên Huy), 01
1
Cử nhân
2
04/2021
sinh viên trường Đại học
Cơng nghệ Tp Hồ Chí
Minh (Đặng Hồng Thanh
Thanh)
01 học viên cao học:
Nguyễn Hồng Cẩm Tú,
2
Thạc sỹ
1
04/2021
Trường Đại học Nơng
Lâm Tp Hồ Chí Minh)
1

5


(Dự kiến báo cáo kết quả
vào tháng 05/2021)
- Lý do thay đổi (nếu có):
đ. Tình hình đăng ký quyền bảo hộ công nghiệp
Kết quả
Ghi chú
TT Tên sản phẩm đăng ký

Theo kế hoạch
Thực tế đạt được (Thời gian kết thúc)
1
- Lý do thay đổi (nếu có):
e. Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
TT

Tên kết quả đã
Thời gian
được ứng dụng

Địa điểm
(Ghi rõ tên, địa chỉ nơi ứng dụng)

Kết quả sơ bộ

1
- Lý do thay đổi (nếu có):
2. Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại
a. Hiệu quả về khoa học và công nghệ
(Nêu rõ danh mục và mức độ năm vững, làm chủ, so sánh với trình độ cơng nghệ so với khu
vực và thế giới…)
Đề tài đã thu thập và đánh giá được 45 mẫu giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) từ
các nguồn khác nhau. Sự đa dạng di truyền của các giống được phân tích dựa trên 58 đặc
điểm hình thái về hoa, lá, màu sắc, mùi thơm, cấu trúc lá được phân tích để đánh giá mối quan
hệ di truyền của và xây dựng cây phát sinh loài. Đây là nguồn cơ sở dữ liệu và nguồn gen quý
cho công tác khai thác và lai tạo các giống lan Hoàng thảo về sau.
Ngoài ra, cơ sở dữ liệu di truyền phân tử dựa trên 02 chỉ thị là DNA barcode và SSR
đã được thiết lập cho 45 mẫu giống thu thập là cơ sở cho việc đánh giá và nhận diện các giống
lan Hồng thảo nói chung phục vụ cho việc truy xuất nguồn gốc cũng như khai các các tính

trạng di truyền khác biệt trong nguồn gen này. Bộ cơ sở dữ liệu bao gồm: Bộ chỉ thị phân tử
DNA barcode cho các vùng rbcL, matK, psbK-psbI, ITS trên 45 mẫu lan; bộ cơ sở dữ liệu
18 SSR với số allen được phát hiện là 79 từ 18 locus với giá trị trung bình là 4,39 allen/locus,
trong đó tổng số alen đa hình là 77 với giá trị trung bình là 4,28 allen/locus.
Quy trình thực hiện cũng như các cơ sở dữ liệu hình thái và di truyền phân tử (SSR,
DNA barcode) cho 45 mẫu giống lan được lưu trữ ở dạng file mềm và có thể truy xuất nhằm
ứng dụng trong việc bảo tồn và khai thác có hiệu quả nguồn gen này.
b. Hiệu quả về kinh tế xã hội
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm cùng
loại trên thị trường…)
Trong quá trình thực hiện đề tài, 10 mẫu giống lan giả hạc (D01-Giả hạc 1, D02-Giả
hạc 2, D03- Giả học 3, D05-Giả hạc 5, D08-Giả hạc 8, D014-Giả hạc 14, D16-Giả hạc 16,
D18-Giả hạc 18, D19 giả hạc 19, D27 giả hạc 27) đã được lưu trữ dưới dạng in vitro, có thể
khái thác và nhân giống một cách thuận tiên trên quy mô lớn phục vụ nhu cầu của thị trường
khu vực Thành phố Hồ Chí Minh cũng như trên cả nước. Các giống có nguồn gốc rõ rang với
hình ảnh hoa cũng như dữ liệu di truyền phân tử SSR, DNA barcode, rất thuận tiện cho việc
truy xuất nguồn gốc.

6


Nguồn gen các giống lan rừng Hoàng thảo cũng như các cơ sở dữ liệu về hình thái và
chỉ thị phân tử đáng tin cậy này có thể được sử dụng cho nhiều mục tiêu khác nhau như định
danh giống, khai thác nguồn gen quý phục vụ lai tạo giống mới.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của nhiệm vụ
Thời gian
Ghi chú
TT
Nội dung
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì)

thực hiện
I
Báo cáo tiến độ
Lần 1
12/2019
Đang thực hiện các nội dung theo đúng tiến độ
II
Báo cáo giám định
05/2020
Nhóm ngiên cứu đã thực hiện đầy đủ nội dung
nghiên cứu trong giai đoạn 1 của hợp đồng, tiến độ
đúng hạn so với thời gian ghi trong hợp đồng số
12/2019/HĐ-QPTKHCN ngày 09 tháng 5 năm 2019
đựa ký kết giữa Quỹ phát triển Khoa học và Công
Lần 1
nghệ và Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ CHí
Minh.
Hội đồng thống nhất đề nghị Sở KH&Cn cho tiếp
tục thực hiện các nội dung giai đoạn 2 theo như hợp
đồng
III Nghiệm thu cơ sở
- Đề tài thực hiện đầy đủ các nội dung theo đề cương
nghiên cứu đã đăng ký. Kết quả quả nghiên cứu có
chất lượng, cơ sở khoa học chắc, cơ sở lý luận rất
khoa học, bố cục rõ ràng. Kết quả nghiên cứu có ý
nghĩa khoa học và ứng dụng vào thực tiễn cao
- Sản phẩm khoa học đạt yêu cầu theo đề cương đăng
ký về số lượng và chất lượng sản phẩm.
Các nội dung cần bổ sung:
- Cần bổ sung, cập nhật tài liệu tham khảo, thông tin

Lần 1
04/2021
các nghiên cứu mới.
- Phần kết luận cần viết ngắn gọn lại, nêu cụ thể kết
quả đạt được
- Hoàn chỉnh lại báo cáo theo góp ý của các thành
viên Hội đồng.
- Đồng ý nghiệm thu cấp cơ sở nhiệm vụ Đánh giá,
xác định bằng chỉ thị phân tử DNA và hình thái kết
hợp bảo tồn một số giống lan Hoàng thảo
(Dendrobium spp.)”
Chủ nhiệm đề tài

Thủ trưởng tổ chức chủ trì
GIÁM ĐỐC

TS. Huỳnh Hữu Đức

TS. Nguyễn Đăng Quân
7


MỤC LỤC
MỤC LỤC .............................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................... v
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về phong lan.................................................................................................. 3

1.2. Một số marker phân tử DNA dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ........................ 5
1.2. Tổng quan một số chỉ thị phân tử DNA......................................................................... 6
1.2.1. Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử DNA .................................................................... 7
1.2.2. Chỉ thị phân tử DNA barcode .................................................................................... 10
1.2.3. Chỉ thị phân tử SSR .................................................................................................... 12
1.3. Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong nghiên cứu về lan nói chung và Lan Dendrobium
nói riêng ....................................................................................................................... 12
1.4. Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA trên cây trồng trong nước ........... 17
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 22
2.1. Vật liệu .......................................................................................................................... 22
2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................... 22
2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, đánh giá chọn lọc một số giống lan Hoàng thảo (Dendrobium)
...................................................................................................................................... 22
2.2.2. Nội dung 2. Xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn gen cho một số giống lan Hoàng thảo
dựa trên chỉ thị phân tử DNA barcode ......................................................................... 23
2.2.3. Nội dung 3. Xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn gen cho các giống lan Hoàng thảo thu
thập dựa trên chỉ thị phân tử SSR ................................................................................ 23
2.2.4. Nội dung 4. Lưu trữ in vitro một số giống lan Hồng thảo có giá trị. ....................... 24
2.2.5. Nội dung 5. Thiết lập cơ sở dữ liệu hình thái và di truyền một số giống lan Hồng
thảo phục vụ cơng tác bảo tồn và định danh ................................................................ 24
2.2.6. Nội dung 6: Xử lý số liệu, viết báo cáo tổng kết, nghiệm thu đề tài .......................... 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 24
2.3.1. Nội dung 1: Thu thập, đánh giá một số mẫu giống lan Hồng thảo (Dendrobium) về
hình thái ....................................................................................................................... 24
2.3.2. Nội dung 2: Xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn gen cho một số mẫu giống lan Hoàng
thảo dựa trên chỉ thị phân tử DNA barcode ................................................................. 26
2.3.3. Nội dung 3. Xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn gen cho các mẫu giống lan Hoàng thảo
thu thập dựa trên chỉ thị phân tử SSR .......................................................................... 31
2.3.4. Nội dung 4. Lưu trữ in vitro một số mẫu giống lan Hoàng thảo có giá trị ................ 33
2.3.5. Nội dung 5. Thiết lập cơ sở dữ liệu hình thái và di truyền một số giống lan Hồng

thảo phục vụ cơng tác bảo tồn ..................................................................................... 34
2.3.6. Nội dung 6: Xử lý số liệu, viết báo cáo tổng kết, nghiệm thu đề tài .......................... 34
i


Chương 3. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC .................................................................................. 35
3.1. Nội dung 1: Thu thập, đánh giá một số mẫu giống lan Hồng thảo (Dendrobium) về
hình thái ....................................................................................................................... 35
3.2. Nội dung 2. Xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn gen cho một số giống lan Hoàng thảo dựa
trên chỉ thị phân tử DNA barcode ................................................................................ 38
3.3. Nội dung 3. Xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn gen cho các giống lan Hoàng thảo thu thập
dựa trên chỉ thị phân tử SSR ........................................................................................ 86
3.4. Nội dung 4. Lưu trữ in vitro một số mẫu giống lan Hồng thảo có giá trị ................... 91
3.5. Nội dung 5. Thiết lập cơ sở dữ liệu hình thái và di truyền một số giống lan Hoàng
thảo phục vụ công tác bảo tồn ..................................................................................... 93
3.6. Nội dung 6: Xử lý số liệu, viết báo cáo tổng kết, nghiệm thu đề tài ............................. 94
Chương 4. KẾT LUẬN ...................................................................................................... 95
4.1. Kết luận ......................................................................................................................... 95
4.2. Kiến nghị ....................................................................................................................... 97
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 98
PHỤ LỤC 1 ........................................................................................................................... 2
PHỤ LỤC 2 ........................................................................................................................... 8
PHỤ LỤC 3 ......................................................................................................................... 10
PHỤ LỤC 4 ......................................................................................................................... 13
PHỤ LỤC 5 ......................................................................................................................... 25
PHỤ LỤC 6 ......................................................................................................................... 39
PHỤ LỤC 7 ......................................................................................................................... 51
PHỤ LỤC 8 ......................................................................................................................... 60
PHỤ LỤC 9 ......................................................................................................................... 64
PHỤ LỤC 10 ....................................................................................................................... 66

PHỤ LỤC 11 ....................................................................................................................... 69
PHỤ LỤC 12 ....................................................................................................................... 70
PHỤ LỤC 13 ....................................................................................................................... 64
PHỤ LỤC 14 ....................................................................................................................... 80
PHỤ LỤC 15 ....................................................................................................................... 85

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BOLD:
CBOL:
COI:
cpDNA:
CTAB:
DNA:
iBOL:
ITS:
PCR:
nrDNA:
AFLP:
UBND:
SSR:
STRs:
PCR:
RFLP:
RAPD:
ISSR:

The Barcode of Life Data System

Consortium for the Barcode of Life
Cytochrome oxidase I
Chloroplast DNA
Cetyltrimethylammonium bromide
Deoxyribonucleic acid
The International Barcode of Life
Internal transcribed spacer
Polymerase chain reaction
Nuclear DNA
Amplified Fragment Length Polymorphism
Ủy ban nhân dân
Simple Sequence Repeats
Short Tandem RepeatsPolymerase chain reaction
Restriction Fragment Length Polymorphism
Randomly Amplified Polymorphic DNA
Inter-simple sequence repeat

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các kỹ thuật chỉ thị DNA ...................................................................................... 8
Bảng 1.2. Thống kê một số kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng để đánh giá mối
quan hệ di truyền ở lan Dendrobium ........................................................................... 16
Bảng 2.1. Một số mẫu giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) dự kiến thực hiện trong nghiên
cứu................................................................................................................................ 25
Bảng 2.2. Một số trình tự primer dự kiến sử dụng trong nghiên cứu .................................. 27
Bảng 2.3.Thành phần phản ứng PCR (20 µL/phản ứng) ..................................................... 29
Bảng 2.4.Chu kỳ nhiệt ......................................................................................................... 29
Bảng 2.5. Một số primer SSR dự kiến thực hiện trong nghiên cứu ..................................... 31

Bảng 3.1. Danh sách các giống lan Hoàng thảo thu thập .................................................... 35
Bảng 3.2. Kết quả đo OD mẫu DNA tổng số của mẫu giống lan được ly trích bằng phương
pháp CTAB cải tiến điều kiện nghiền mẫu và tủa DNA khác nhau ............................ 39
Bảng 3.3 . Kết quả khuếch đại 12 vùng chỉ thị phân tử DNA barcode với 38 cặp primer
đặc hiệu cho từng marker ............................................................................................. 43
Bảng 3.4. Kết quả giải trình tự thành cơng của vùng gen rbcL, matK, psbK-psbI, ITS ..... 47
Bảng 3.5. Kết quả so sánh trình tự rbcL của 45 mẫu lan với các trình tự trên NCBI ......... 49
Bảng 3.6. Vị trí sai khác của 45 mẫu giống lan Dendrobium dựa trên vùng gen rbcL ....... 54
Bảng 3.7. Kết quả so sánh trình tự matK của 45 mẫu lan với các trình tự trên NCBI ........ 58
Bảng 3.8. Vị trí sai khác của 45 mẫu giống lan Dendrobium dựa trên vùng gen matK ...... 61
Bảng 3.9. Kết quả so sánh trình tự psbK-psbI của 45 mẫu lan với các trình tự trên NCBI 65
Bảng 3.10. Vị trí sai khác của 45 mẫu giống lan Dendrobium dựa trên vùng gen
psbK-psbI ..................................................................................................................... 68
Bảng 3.11. Kết quả so sánh trình tự ITS của 45 mẫu lan với các trình tự trên NCBI ......... 72
Bảng 3.12. Vị trí sai khác của 45 mẫu giống lan Dendrobium dựa trên vùng gen ITS ....... 75
Bảng 3.13. Kết quả sàng lọc primer SSR cho 45 mẫu lan nghiên cứu ................................ 86
Bảng 3.14. Kết quả phân tích 45 mẫu giống lan dựa trên 18 chỉ thị phân tử SSR .............. 88

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Hình ảnh một số mẫu giống lan Dendrobium thu thập được .............................. 36
Hình 3.2. Cây phân nhóm di truyền của 41 mẫu giống lan dựa trên đặc điểm hình thái .... 38
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8%........................................... 40
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại vùng chỉ thị phân tử DNA barcode
rbcL với 2 cặp primer đặc hiệu cho từng marker. A/ primer rbcL1-F và rbcL724-R;
B/ primer matK-KIM3-F và matK-KIM1-R; C/ primer psbK-psbI-F và psbK-psbI-R;
D/ primer ITS-F và ITS-R ............................................................................................ 45
Hình 3.5. Cây phân loại của các mẫu giống lan dựa trên trình tự DNA của vùng rbcL. A/

Phân pát sinh loại giữa các trình tự nghiên cứu, B/ Cây phát sinh lồi giữa các trình
tự nghiên cứu kết hợp với các trình tự đã nghiên cứu trước đây ................................. 57
Hình 3.6. Cây phân loại các mẫu giống lan dựa trên trình tự DNA của vùng matK. A/
Phân pát sinh loại giữa các trình tự nghiên cứu, B/ Cây phát sinh loài giữa các trình
tự nghiên cứu kết hợp với các trình tự đã nghiên cứu trước đây ................................. 64
Hình 3.7. Cây phân loại các mẫu giống lan dựa trên trình tự DNA của vùng psbK-psbI.
A/ Phân pát sinh loại giữa các trình tự nghiên cứu, B/ Cây phát sinh lồi giữa các
trình tự nghiên cứu kết hợp với các trình tự đã nghiên cứu trước đây ........................ 70
Hình 3.8. Cây phân loại các mẫu giống lan dựa trên trình tự DNA của vùng ITS. A/ Phân
pát sinh loại giữa các trình tự nghiên cứu, B/ Cây phát sinh lồi giữa các trình tự
nghiên cứu kết hợp với các trình tự đã nghiên cứu trước đây ..................................... 84
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại chỉ thị SSR OA15 với cặp mồi OA15F và OA15-R trên 45 mẫu lan ...................................................................................... 87
Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loài của 45 mẫu lan dựa trên chỉ thị phân tử SSR ........... 90
Hình 3.11. Hình ảnh 10 giống lan giả hạc được lưu trữ trong điều kiện in vitro tại Trung
tâm Công nghệ Sinh học .............................................................................................. 93

v


MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước có mức độ đa dạng sinh học cao với nhiều lồi đặc hữu,
trong đó lan rừng Việt Nam được đánh giá là rất đa dạng và phong phú, với nhiều
lồi rất đẹp và có giá trị kinh tế. Đây là nguồn gen quý phục vụ công tác lai tạo để tạo
ra nhiều giống lan mới đặc sắc. Lan Hoàng thảo (Dendrobium) là loài cây ra hoa
quanh năm, thích hợp cho vùng có khí hậu nhiệt đới, có giá trị kinh tế cao và rất được
thị trường ưa chuộng. Đặc biệt, nhiều loài lan Hoàng thảo có sức sống mạnh, dễ thích
nghi với điều kiện khí hậu TP. HCM, đồng thời cây có khả năng kháng bệnh cao. Tuy
nhiên, đa số các giống lan Dendrobium đang được nuôi trồng ở TP. HCM là các giống
được nhập nội từ Thái Lan. Trong khi các nhà vườn trồng lan đang sở hữu các giống
lan Hoàng thảo rừng đã được thuần hóa có giá trị, nhập nội hay do tự lai tạo mà chưa

được đánh giá và khai thác một các hiệu quả. Trong đó, các giống lan rừng thuần hóa
có giá trị như Giả hạc, Long tu, Đại ý thảo, Trầm và nhiều giống đã được lai tạo và
chọn lọc với chất lượng tốt, mang nhiều đặc tính nổi trội. Tuy nhiên, hiện nay các
giống lan rừng Việt Nam đang bị khai thác bừa bãi và chưa có chính sách bảo tồn
triệt để của nhà nước ta nên phần lớn các lồi lan đang có nguy cơ bị tiêu diệt và mất
nguồn gen quý. Các nhà vườn trồng lan thường xuyên chọn lọc, lai tạo các giống lan
trong khi chưa biết chính xác nguồn gốc giống, chưa được phân tích đánh giá và thiếu
các đánh giá phân tích về mặt di truyền. Dó đó, việc sưu tập, lai tạo, chọn lọc giống
lan rừng, bảo tồn nguồn gen nhằm phục vụ công tác nghiên cứu và lai tạo các giống
hoa lan phù hợp với các điều kiện khí hậu và thị hiếu người tiêu dùng là yêu cầu thiết
yếu nhằm góp phần thúc đẩy việc phát triển hoa lan trên địa bàn Thành phố Hồ Chí
Minh và các tỉnh phía Nam
Việc xác định nguồn gốc của các giống bố mẹ và đánh giá giống một cách đầy
đủ về mặt hình thái và di truyền là một trong những yêu cầu bắt buộc và cực kỳ quan
trọng trong công tác lai tạo giống và sản xuất giống cây trồng. Trong đó, việc phân
loại truyền thống dựa trên các đặc tính hình thái đang được sử dụng mang lại hiệu
quả chưa cao, chưa đảm bảo tính chính xác và tốn nhiều thời gian và công sức. Các

1


marker phân tử như DNA barcode, SSR được sử dụng trong công tác đánh giá nguồn
gen, xác định mối quan hệ di truyền, nguồn gốc bố mẹ và đánh giá giống đã và đang
mang lại những kết quả khả quan và đầy triển vọng khi rút ngắn thời gian lai tạo đồng
thời có thể đánh giá và xác định một cách chính xác nguồn gốc các giống lai tạo cũng
như bảo hộ giống mới. Ngoài ra, việc đảm bảo lưu trữ và bảo tồn nguồn gen các giống
lan bố mẹ đã chọn lọc song song với các phân tích hình thái và di truyền cũng là một
trong những yêu cầu bắt buộc của công tác lai tạo và nghiên cứu phát triển các giống
lan mới cũng như các giống lan quý, có giá trị kinh tế.
Trên cơ sở đó, đề tài “Đánh giá, xác định bằng chỉ thị phân tử DNA và hình

thái kết hợp bảo tồn một số giống lan Hồng thảo (Dendrobium spp.) có giá trị”
được thực hiện với mục tiêu xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử DNA kết hợp hình thái
để đánh giá mối quan hệ di truyền, lưu trữ và bảo tồn nguồn gen các giống lan Hồng
thảo nhằm phục vụ cơng tác nghiên cứu, lai tạo giống và khai thác một cách có hiệu
quả một số giống lan có giá trị.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về phong lan
Họ lan hay họ Phong lan (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực vật

có hoa, thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm. Đây là một trong
những họ lớn nhất của thực vật, và phân bổ nhiều nơi trên thế giới, nhưng tập trung
chủ yếu ở vùng nhiệt đới (Atwood 1986);(Dressler 1993) . Theo thống kê của vườn
thực vật hoàng gia Kew, họ lan gồm 880 chi và gần 22.000 lồi được chấp nhận,
nhưng số lượng chính xác vẫn chưa được xác định rõ, có thể nhiều tới 25.000 loài.
Số lượng loài lan cao gấp 4 lần số lượng lồi động vật có vú hay hơn 2 lần số lượng
loài chim. Lan chiếm khoảng 6–11% số lượng loài thực vật có hoa (Chase 2005)).
Bên cạnh đó, khoảng 800 loài lan mới được bổ sung thêm mỗi năm. Trong họ lan,
các chi lớn nhất là Bulbophyllum (khoảng 2.000 loài), Epidendrum (khoảng 1.500
loài), Dendrobium (khoảng 1.400 loài) và Pleurothallis (khoảng 1.000 loài).
Orchidaceae phân bố rộng khắp trên thế giới, chung có thể có mặt trong mọi mơi
trường sống ngoại trừ các sa mạc và sơng băng. Các lồi này phần lớn được tìm thấy
ở khu vực nhiệt đới, chủ yêu là Châu A, Nam Mỹ và Trung Mỹ. Ở các vĩ độ cao hơn
vùng Bắc cực, ở miền nam Patagonia …cũng đã tìm thấy chúng. Orchidaceae phân
bố rộng khắp như: châu Đại Dương 50-70 chi, Châu Âu và ôn đới Châu Á 40 – 60

chi, Bắc Mỹ 20- 25 chi, Châu Âu và ôn đới châu Á 40 - 60 chi, Bắc Mỹ 20 - 25 chi
(De Hert, Jacquemyn et al. 2011).
Châu Á nói chung và vùng Đơng Nam Á nói riêng là hai khu vực tập trung nhiều
lan nhất, Việt Nam nằm trong khu vực này chính vì thế mà lan Việt Nam vô cùng
phong phú và đa dạng về chủng loại cũng như màu sắc. Có thể nói lan rừng Việt Nam
không chỉ thu hút những người yêu vẻ đẹp hoa lan trong nước mà còn thu hút những
người yêu Lan trên toàn thế giới với những nét đặc trưng riêng biệt của chúng.
Theo Phạm Hoàng Hộ (1993), hiện nay lan rừng Việt Nam có khoảng hơn 750
lồi với những nét đặc trưng khác nhau. Với sự phong phú về chủng loại cũng như
màu sắc như thế, khó có thể lột tả được hết những đặc điểm riêng của chúng. Mỗi
lồi lan rừng sẽ có những u cầu về điều kiện sinh thái nhất định, ngoại trừ một số

3


loại lan có thể thích nghi được với các điều kiện sống khác nhau và mỗi loại thường
sinh sống tại một nơi thích hợp.
Theo Trần Hợp (2000) do điều kiện địa lý và sinh thái của Việt Nam hết sức đa
dạng và trải dài từ Bắc tới Nam với nhiều kiểu khí hậu đặc trưng khác nhau, lan rừng
Việt Nam có rất nhiều những loại lan đặc hữu, quý. Lan rừng Việt Nam có nhiều màu
sắc khác nhau như cam (Ascocentrum minitaum), màu đỏ của loài Huyết Nhung, hồng
của Hồng lan hay sắc màu trắng xanh của loài Mỹ Dung Dạ Hương…. Có thể nói lan
rừng Việt Nam với những sắc màu đa dạng như thế, nếu được lai tạo thì Việt Nam sẽ
có một tổ hợp lan rất phong phú về sắc màu. Đó là chưa kể đến những sắc màu có
sẵn trong tự nhiên như lồi Đi cáo (Aerides multiflora), Ngọc điểm (Rhyncholius
parishii), Long nhãn kim điệp (Dendrobium annamensis), v.v. Không chỉ riêng về
sắc đẹp, xét về độ bền của những lồi lan rừng Việt Nam có nhiều giống nở lâu với
khoảng thời gian khác nhau. Có lồi nở trên 2 tháng (Mỹ Dung Dạ Hương, Huyết
Nhung, Hoàng lan, Hồng lan) những cũng có loại nở trung bình từ 1 – 2 tuần (Long
tu, Kim điệp, Đuôi cáo, Ngọc điểm) những cũng có những lồi có thời gian nở một

ngày như Thạch hộc…Xét về kích thước thì Phong lan rừng Việt Nam có những kích
thước khác nhau tỳ theo từng lồi. Một số lồi có kích thướt bé như các giống của
Eria. Các lồi có kích thước trung bình cũng có một số có kích thước lớn hơn 10 cm
như Hạc Đĩnh, Huyết Nhung, Mỹ Dung hay Dạ Hương…Ngồi ra, lan rừng Việt
Nam có ưu thế mạnh về hương thơm, so với các lồi lan lai thì lan rừng có kích thướt
bé hơn nhưng lại có hương thơm vơ cùng hấp dẫn. Một số ít lồi có hương thơm có
thể kể đến chính là Mỹ Dung Dạ Hương, Hạc Đỉnh, Đuôi Cáo, Ngọc Điểm…
Theo Nguyễn Thiện Tịch (2001), phần lớn lan rừng việt Nam là phong lan.
Chúng sống bám trên các cây cao và cây phụ sin. Vì rễ của chúng chỉ bám vào bề mặt
của vỏ cây và không lấy thức ăn trong mô cây gỗ. Do vậy khi tách cây lan ra khỏi
thân cây, cành cây mà chúng bám thì có thể trồng chúng sống được. Rễ cây phong
lan chỉ bám trên bề mặt cây gỗ những vẫn phát triển tốt là nhờ cấu tạo đặc biệt của
chúng trong việc giữ nước và hấp thu nước cùng hòa tan các chất khác. Dựa vào đặc
điểm rễ có thể chia các cây lan phụ sinh này ra hai nhóm: phong lan và bán phong
lan.

4


Lan Hoàng thảo (Dendrobium) phân bố khắp nơi trên thế gới, các chi phong
phú và đa dạng, theo ước tính có hơn 1400 lồi và nhiều nhất vẫn là Bullbopllyllum.
Ở các nước nhiệt đới Châu Á đặc biệt là khu vực Đông Nam Á tập trung nhiều và đa
dạng nhất là chi Dendrobium. Vì là họ lan có nhiều chi nhỏ nên khơng có bất cứ thống
nhất nào về hình thức của hoa, cây. Đồng thời đây là giống hoa lan có điều kiện sinh
trưởng đa dạng. Có loại phù hợp vơi khí hậu Nhiệt đới, lại có hoa ưa Hàn đới, Ôn
đới…Tuy nhiên, Dendrobium sinh trưởng và phát triển tốt với điều kiện tự nhiên khó
khăn. Hoa của nhóm lan này tươi lâu nhất đồng thời cũng dễ dàng lai tạo nhất trong
tất cả các loài lan. Dendrobium được chia làm hai nhóm chính dựa trên điều kiện inh
trưởng là nhóm ưa nóng và nhóm ưa lạnh. Ở Việt Nam chủ yếu là nhóm ưa nóng, một
vài nhóm ưa lạnh thường sinh trưởng ở vùng núi hoặc các cao nguyên.

Với những đặc điểm trên có thể thấy lan rừng Việt Nam là nguồn lợi nhuận có
thể mang đến hiệu quả kinh tế cao nếu được khai thác hợp lý cũng như lai giống.
Khơng chỉ mang vẻ đẹp mà cịn có thể thu ngoại tệ từ những giống lan. Có thể nói
lan rừng Việt Nam là một trong những tặng phẩm vô giá mà thiên nhiên đã ban tặng
cho vùng núi rừng. Tuy nhiên, nguồn gen này chưa được khai thác cũng như quản lý
và khai thác hợp lý. Một ví dụ điển hình có thể nhận thấy chính là lồi lan hài
Paphiopedilum delenatii, do khơng có kế hoạch khai thác, bảo tồn không hợp lý nên
Việt Nam chưa thể khai thác thương mại hóa lồi hoa này.
1.2. Một số marker phân tử DNA dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Trong nơng nghiệp nói chung và trong ngành hoa kiểng nói riêng, một trong
những mục tiêu chính của nhà chọn tạo giống cây trồng là cải tiến các giống cây trồng
bị thiếu một hoặc nhiều tính trạng bằng cách chọn lọc và lai chéo các giống đó với
những giống mang các tính trạng mong muốn. Trong lai tạo giống truyền thống, việc
chọn tạo giống bao gồm việc lai các bộ gen của các cá thể với nhau, tiếp theo là lựa
chọn các tổ hợp lai trong số các sản phẩm phân ly. Như vậy, đây là một quá trình
nhiều thời gian và rất tốn kém, trải qua nhiều lần lai, nhiều thế hệ, và lựa chọn kiểu
hình cẩn thận, ngoài ra sự liên kết giữa các gen mục tiêu các gen mong muốn có thể
gây khó khăn cho quá trình chọn tạo giống. Sự ra đời của cơng nghệ đánh dấu DNA
(công nghệ chỉ thị phân tử)dựa trên DNA bộ gen cùng với sự phát triển của các loại

5


chỉ thị phân tử kết hợp với các mục tiêu chọn tạo giống phân tử đã mở ra cơ hội cho
các nhà chọn tạo giống cây trồng và di truyền học vượt qua những thách thức và trở
ngại trong lai tạo giống truyền thống.
Hiện nay, chỉ thị phân tử đang được sử dụng rộng rãi để đánh dấu các vị trí và
các vùng trong bộ gen trong một số chương trình chọn giống và lai tạo giống cây
trồng. Các chỉ thị phân tử này liên kết chặt chẽ với nhiều tính trạng nơng học cũng
như các tính trạng kháng bệnh đối với các loại cây trồng chính (Jain, Brar et al. 2002,

Gupta and Rustgi 2004, Phillips and Vasil 2013). Một số chỉ thị phân tử như: (i) đa
hình chiều dài các giới hạn (RFLP), (ii) đa hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên
(RAPD), đa hình chiều dài các đoạn khuyếch đại (AFLP) và microsatellite hoặc các
đoạn trình tự lặp lại đơn giản (SSR), và (iii) đa hình nucleotide đơn (SNP). Những
chỉ thị phân tử này có thể được tạo ra với số lượng lớn và đã được chứng minh là rất
hữu ích cho nhiều mục đích khác nhau trong việc cải thiện các giống cây trồng. Chẳng
hạn, chúng đã được sử dụng rộng rãi để xây dựng các bản đồ di truyền phân tử, sự
liên quan của các chỉ thị này với các gen/tính trạng di truyền số lượng có vai trị trong
việc kiểm sốt các tính trạng quan trọng và đã được sử dụng trong một số trường hợp
để lựa chọn gián tiếp bằng marker (MAS). Một số ứng dụng khác nhau của chỉ thị
phân tử bao gồm giới thiệu gen mục tiêu thông qua sự lai chéo, mơ tả đặc tính của
nguồn giống bố mẹ, chẩn đốn di truyền, mơ tả đặc tính của các giống chuyển gen,
nghiên cứu cấu trúc bộ gen và phân tích phát sinh loài (Jain, Brar et al. 2002). Đối
với các ứng dụng trong lai tạo giống, chỉ thị phân tử SSR được chứng minh và khuyến
khích sử dụng trong chọn giống cây trồng do khả năng liên kết tính trạng cao (Gupta
and Varshney 2000). Chỉ thị phân tử SSR đã cho thấy ưu thế về tính đa hình cao, tính
ổn định, độ tinh cậy, cũng như khả năng tự động hoá hơn khi so sánh với các chỉ thị
phân tử khác (Shariflou, Hassani et al. 2001). Trong khi đó, chỉ thị phân tử DNA
barcode cho thấy tính chính xác trong đánh giá và xác định nhiều cây trồng khác nhau
với sự nhanh chóng và tin cậy nhất định. DNA barcode là một phương pháp mới để
xác định nhanh chóng bất kỳ lồi nào dựa trên trình tự DNA được tách chiết từ một
mẫu mô nhỏ của sinh vật.
1.2.

Tổng quan một số chỉ thị phân tử DNA

6


1.2.1. Giới thiệu chung về chỉ thị phân tử DNA

Các chỉ thị di truyền là các chỉ thị thể hiện sự khác biệt giữa các cơ thể hoặc các
loài khác nhau. Các chỉ thị này không thể hiện cho các gen mục tiêu mà chỉ là dấu
hiệu hoặc như là “cờ đánh dấu”. Chỉ thị di truyền bao gồm cả chỉ thị hình thái và chỉ
thị phân tử (isozyme, protein, DNA). Tất cả chỉ thị di truyền đều chiếm một vị trí đặc
biệt trong nhiễm sắc thể (NST) và được gọi là locus. Các chỉ thị di truyền thường liên
kết với gen và được di truyền theo quy luật di truyền. Chỉ thị phân tử thường được
hiểu là chỉ thị DNA, các chỉ thị này chỉ nằm gần hay liên kết với gen và khơng có
hoặc ít ảnh hưởng đến kiểu hình (Thành 2015)
Chỉ thị di truyền có thể chia thành hai loại: chỉ thị truyền thống và chỉ thị DNA.
Chỉ thị truyền thống gồm chỉ thị hình thái (đây là những tính trạng hoặc đặc điểm
hình thái như màu hoa, kiểu hình hạt, đặc điểm sinh trưởng, sự biến đổi sắc tố v.v.),
chỉ thị tế bào (đặc trưng cấu trúc của nhiễm sắc thể) và chỉ thị sinh hóa (các isozyme,
protein và các chất trao đổi chất). Chỉ thị DNA là những thay đổi trong phân tử DNA
và được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau về phương pháp và kỹ thuật xác
định sự đa hình. Các chỉ thị DNA được sử dụng rộng rãi nhất do số lượng chỉ thị
không hạn chế. Chỉ thị DNA được hình thành từ các loại đột biến DNA khác nhau
như thay thế (đột biến điểm), sắp xếp lại (thêm vào hoặc bớt đi nucleotide) hoặc các
sai sót trong sao chép các đoạn DNA lặp lại liền kề. Các chỉ thị DNA thường nằm ở
các vùng không phiên mã. Khác với các chỉ thị hình thái và sinh hóa, chỉ thị DNA
không giới hạn về số lượng, không ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và giai đoạn
phát triển của cây. Chỉ thị DNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di
truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền,
nhận biết gen và trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết
giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi
trường, năng suất và phẩm chất giống (Thành 2014)
Theo thống kê từ một cuộc khảo sát các cơng trình ứng dụng kỹ thuật phân tử
vào nghiên cứu sinh học quần thể, từ năm 1979 đến nay đã có hàng ngàn nghiêncứu
về di truyền quần thể trên nhiều đối tượng khác nhau, trong đó có hơn 300 nghiên
cứu đã sử dụng các marker phân tử như RFLP, RAPD, DAF,SSR, ISSR, AFLP…


7


làm công cụ nghiên cứu. Sự gia tăng sử dụng các kỹ thuật này vào đầu thập niên 90
đã chứng minh vai trò to lớn của chúng trong việc cung cấp những thơng tin hữu ích
về cấu trúc di truyền quần thể.
Bảng 1.1. Các kỹ thuật chỉ thị DNA
Kí hiệu
Tên Tiếng Anh
Kỹ thuật không sử dụng PCR
Restriction Fragment Length
RFLP
Polymorphism
Restriction Endonuclease
REF
Fingerprinting
Kỹ thuật sử dụng PCR
Amplified Fragment Length
AFLP
Polymorphism
Randomly Amplified Polymorphic
RAPD
DNA
AP-PCR Arbitrarily primed PCR
Amplification Refractory Mutation
ARMS
System
Arbitrary Signatures from
ASAP
Amplification

SPAR
Single Primer Amplification Reaction
SPLAT
Single Polymorphic Amplification Test
Sequence-Specific Amplification
S-SAP
Polymorphisms
Amplified Sequence Length
ASLP
Polymorphism
Cleaved Amplification Polymorphic
CAPS
Sequence
CAS
Coupled Amplification and Sequencing
DAF
DNA Amplification Fingerprint
Selective Amplification of
SAMPL
Polymorphic Loci
Kỹ thuật chỉ thị dựa trên các tiểu vệ tinh
ISSR
Inter-Simple Sequence Repeats
ISTR
Inverse Sequence-Tagged Repeats
MP-PCR Microsatellite-Primed PCR
Randomly Amplified Hybridizing
RAHM
Microsatellites
RAMPs

Randomly Amplified Microsatellite
Polymorphisms
VNTR

Variable Number Tandem Repeats

Các kỹ thuật chỉ thị PCR các chuỗi đặc trưng
STS
Sequence-Tagged-Site
Sequence Characterised Amplification
SCAR
Regions
SSLP
Single Sequence Length Polymorphism

8

Tên Tiếng Việt
Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế
Lấy dấu cắt hạn chế
Đa hình độ dài nhân bản chọn lọc
DNA đa hình được nhân bản ngẫu
nhiên
PCR với mồi ngẫu nhiên
Hệ thống đột biến chịu nhiệt nhân bản
Các dấu hiệu ngẫu nhiên từ nhân bản
Phản ứng nhân bản với mồi đơn
Phép thử nhân bản đa hình đơn
Đa hình nhân bản chuỗi đặc trưng
Đa hình độ dài chuỗi nhân bản

Chuỗi đa hình nhân bản được cắt hạn
chế
Giải trình tự và nhân bản kết hợp
Dấu nhân bản DNA
Nhân bản chọn lọc các locus đa hình
Chuỗi lặp lại đơn giản giữa
Chuỗi lặp lại ngược được đánh dấu
PCR với mồi tiểu vệ tinh
Tiểu vệ tinh lai được nhân bản ngẫu
nhiên
Đa hình tiểu vệ tinh được nhân bản
ngẫu nhiên
Số lượng thay đổi các chuỗi lặp lại
liền kề
Vị trí chuỗi đánh dấu
Vùng nhân bản chuỗi được mơ tả
Đa hình độ dài chuỗi đơn giản


SSR
Simple Sequence Repeats
STMS
Sequence-Tagged Microsatellite Site
Các kỹ thuật chỉ thị gen nhảy
REMAP Retrotrasposon-Microsatellite
Amplified Polymorphism
Retrotrasposon-Based Insertion
RBIP
Polymorphism
Inter- Retrotrasposon Amplified

IRAP
Polymorphism
TD
Transposable Display
Các kỹ thuật chỉ thị nhân khác
ITS
Internal Transcribed Spacer
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
OLA
Oligonucleotide Ligation Assay
Single Stranded Conformation
SSCP
Polymorphism
ASO
Allele Specific Oligonucleotide
ASH
Allele-Specific Hybridization
Các kỹ thuật chỉ thị lục lạp
cpSSR
Chloroplast Simple Sequence Repeats
RFLPA
Restriction Fragment Length
cpDNA
Polymorphism Analysis cpDNA
trnAs
Chloroplast Transfer RNAs
Công nghệ hỗ trợ hiện đại
DarT
Diversity array Technology

NGS
Next-geneation sequencing

Các chuỗi lặp lại đơn giản
Vị trí chuỗi tiểu vệ tinh đánh dấu
Đa hình tiểu vệ tinh gen nhảy ngược
được nhân bản
Đa hình sự gắn dựa trên gen nhảy
ngược
Đa hình gen nhảy ngược giữa được
nhân bản
Biểu lộ gen nhảy
Vùng đệm trong được sao mã
Đa hình nucleotide đơn
Phân tích gắn Oligonucleotide
Đa hình cấu tạo sợi đơn
Oligonucleotide đặc trưng allen
Lai allen đặc trưng
Chuỗi lặp lại đơn giản lục lạp
Phân tích đa hình độ dài đoạn cắt giới
hạn
Các RNA vận chuyển lục lạp
Công nghệ sắp xếp đa dạng
Giải trình tự thế hệ thứ hai

(Nguồn: Thành (2014))
Trong số các marker phân tử, marker RFLP được sử dụng đầu tiên trong việc
lập bản đồ gen của con người, sau đó được cải biến để ứng dụng cho việc lập bản
đồ(mapping) ở cây trồng. RFLP là thể đa hình đáng tin cậy nhất, có thể được dùng
cho những phân tích chính xác về kiểu gen.

Marker RFLP có khả năng sử dụng rất phong phú, vì là marker có đặc tính đồng
trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp, nhưng quy trình thực hiện
phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số
lượng và chất lượng rất cao. Do đó, người ta có xu hướng sử dụng những marker đơn
giản hơn trên cơ sở phản ứng PCR.
Kỹ thuật RAPD ra đời sau kỹ thuật RFLP, tuy khả năng tạo đa hình tương đương
với kỹ thuật RFLP nhưng quy trình thực hiện đơn giản hơn, chi phí thấp hơn,thu kết
quả nhanh hơn, giúp các nhà khoa học có thể thu được sự đa hình DNA tại rất nhiều
locus. Vì các mồi sử dụng trong kỹ thuật RAPD ngắn nên dễ dàng tìm được các trình

9


tự tương đồng trên DNA bộ gen. Do đó, tính đa hình thu được từ RAPD là khá cao
vì khi có bất kỳ sự thay đổi một base nitơ nào thì sẽ nó sẽ ngăn cản sự bắt cặp giữa
mồi và DNA mạch khn. Do tính hiệu quả nên RAPD nhanhchóng có vị trí xứng
đáng trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền một số giống cây trồng một và hai lá
mầm như lúa, chuối, dứa, cà chua, cacao…Khái niệm chọn tạo giống phân tử
(molecular breeding) hình thành trên cơ sở chức năng chẩn đoán của các kỹ thuật sinh
học phân tử, trong đó có kỹ thuật RAPD. Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi để
phân tích tính đa hình của DNA.RAPD và fingerprinting được sử dụng trong các vấn
đề liên quan đến sinh sản và huyết thống.Gần đây, việc sử dụng kỹ thuật minisatellite
và microsatellite dần dần tăng lên. Tuy nhiên, chi phí xây dựng thư viện DNA vẫn là
nhân tố giới hạn của nhiều phịng thí nghiệm muốn sử dụng hai kỹ thuật này. Các kỹ
thuật DNA sử dụngcác marker phân tử như SSCP, DAF, cũng đã được áp dụng vào
các nghiên cứu quần thể và đã cung cấp sự lựa chọn mới.
1.2.2. Chỉ thị phân tử DNA barcode
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một
phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi
là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thơng

tin về hệ gen (ADN) trong và ngồi nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy
mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN)
khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen (Schindel and Miller (2005); Park
(2007); Kress and Erickson (2012); Paula (2013); Schindel and Miller (2005))
Năm 2003, Paul Hebert nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada,
đề nghị "DNA barcode" như một cách để xác định loài. DNA barcode sử dụng một
chuỗi gen rất ngắn từ một phần của bộ gen và mang ý nghĩa nhận dạng như mã vạch
của các sản phẩm hàng hóa với các sọc màu đen đang được sử dụng rộng rãi tại các
siêu thị. Về nguyên tắc, hai mặt hàng có thể trông rất giống nhau nhưng nguồn gốc
xuất xứ hay có thành phần khác nhau sẽ mang các mã vạch khác biệt. Phương pháp
DNA barcode nhằm hiện đại hóa việc phân loại theo truyền thống và dùng tính đa
dạng của các phân tử DNA như một phương tiện để nhận biết và xác định các sinh
vật.

10


Theo Pires và Marinoni (2010) vì các chuỗi DNA là duy nhất cho từng lồi,
chúng có thể được xem như di truyền "mã vạch" và có tiềm năng để giải quyết những
vấn đề cố hữu đối với loại phân loại thực hành cho đến nay. Với một biến thể của bốn
nucleotide (A, T, C, G) tại mỗi điểm, như vậy có đến 4n (trong đó "n" tương ứng với
số lượng nucleotide được khảo sát) mã đối với bất kỳ cho một đoạn trình tự DNA
nhất định. Ví dụ, với việc khảo sát 15 vị trí nucleotide khác nhau cho một đoạn DNA
có thể xác định được 1 tỷ (415) lồi. Việc nhận dạng này ở bước đầu (đánh giá sơ bộ
ban đầu) có thể được thực hiện một cách nhanh chóng và với chi phí thấp mà khơng
cần một chun gia phân loại trong nhóm nghiên cứu (mặc dù việc xác định sau cùng
cần sự đánh giá của chuyên gia). Ngoài ra, một lợi thế của phương pháp này là khả
năng nhận dạng cá thể tại bất kỳ giai đoạn phát triển và khả năng phân biệt giữa các
lồi có hình thái giống hệt nhau.
DNA barcode là phương pháp phổ biến để xác định lồi có thể sử dụng những

mẫu có vùng DNA đáng tin cậy cũng như những mẫu có DNA suy thối cao ,đang
được ứng dụng rộng rãi trên thế giới nhằm phục vụ công tác phân loại, đánh giá đa
dạng sinh học và bảo tồn nguồn gen. Kỹ thuật này dựa trên bản chất di truyền và tiến
hóa của sinh vật (trình tự DNA của các gen trong sinh vật) giúp xác định nhanh sinh
vật trong hệ thống phân loại đồng thời xác định các mối quan hệ cũng như nguồn gốc
giữa các sinh vật khảo sát phục vụ công tác bảo tồn và lai tạo giống. DNA barcode
đang được sử dụng để giải quyết câu hỏi về sinh thái và tiến hóa cơ bản từ động vật
và nấm nguyên sinh vật, tảo và thực vật. Các kết quả của nghiên cứu gần đây, cho
thấy các marker DNA barcode của thực vật được lựa chọn là vùng rbcL và matK cộng
với hai khu vực bổ sung trnH - psbA và vùng ITS đã cho thấy mức độ phù hợp cho
sự phân biệt loài đối với thực vật (Jalil, Annuar et al. 2015, Kress, García-Robledo et
al. 2015, Paula 2013). Một số vùng được kiểm tra cho việc sử dụng như là vùng mã
vạch: các vùng lạp thể không mã hóa như trnH-psbA, trnL intron, trnL-F, atpF-atpH,
psbK-psbI, vùng rps4; các vùng lạp thể mã hóa như accD, ndhJ, rpoB, rpoC1 và ycf5,
ribulose-bisphosphate carboxylase (rbcL), maturase K (matK), ndhF, 23S rDNA và
atpB, vùng trong nhân khơng mã hóa như Internal Transcribed Spacer (ITS bao gồm
ITS1 và ITS2).

11