Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy cadmium ở lúa TBR225
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (12.98 MB, 9 trang )
Vietnam J. Agri. Sci. 2022, Vol. 20, No. 9: 1220-1229
Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(9): 1220-1229
www.vnua.edu.vn
Ngơ Thị Vân Anh1, Nguyễn Anh Minh2, Phạm Thu Hằng2,
Phạm Phương Ngọc2, Lê Quỳnh Mai3, Phạm Xuân Hội2, Nguyễn Duy Phương2*
1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
2
Viện Di truyền Nông nghiệp
3
Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
*
Tác giả liên hệ:
Ngày nhận bài: 06.08.2022
Ngày chấp nhận đăng: 27.09.2022
TĨM TẮT
Cadmium (Cd) có độc tính rất cao đối với hầu hết các sinh vật sống, bao gồm cả con người. Lúa gạo chứa hàm
lượng Cd vượt ngưỡng (0,2 mg/kg - QCVN 8- 2:2011/BYT) là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc Cd.
OsNRAMP5 thuộc họ NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) đã được xác định có liên quan tới quá
trình vận chuyển nhiều kim loại như sắt (Fe), kẽm (Zn), đồng (Cu), mangan (Mn) và Cd ở lúa. Để phục vụ nghiên cứu
chức năng OsNRAMP5, chúng tôi đã đánh giá biểu hiện của gen đích và thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 (Clustered
Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Cas9) gây đột biến bất hoạt OsNRAMP5 của giống
lúa chủ lực TBR225. Bằng phương pháp xử lý nhân tạo trong dung dịch trồng thủy sinh có bổ sung Cd, OsNRAMP5 đã
được chứng minh tăng cường biểu hiện ở mô rễ lúa TBR225. Một phần trình tự chứa ExonI của OsNRAMP5 dài 0,29kb
đã được phân lập để phục vụ thiết kế sgRNA (single guide RNA) cho hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5. Cấu
trúc biểu hiện sgRNA mang hai trình tự crRNA (CRISPR RNA) nhận biết ExonI OsNRAMP5 đã được ghép nối vào vector
nhị thể pCas9. Vector tái tổ hợp đã được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự Nu. Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho cải
tiến chất lượng giống lúa chủ lực TBR225 bằng cơng nghệ chỉnh sửa hệ gen.
Từ khóa: Bất hoạt gen, Cadmium, CRISPR/Cas9, OsNRAMP5, TBR225.
Designing CRISPR/CAS9 System
for Knocking out OsNRAMP5 Related to Cadmium Accumulation in Rice Variety TBR225
ABSTRACT
Cadmium (Cd) is highly toxic to most living organisms, including humans. Rice with excessive Cd (> 0,2 mg/kg QCVN 8-2:2011/BYT) is one of the leading causes of Cd poisoning, threatening human health. Several genes
belonging to the NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) family are related to metal
accumulation in plants; in which OsNRAMP5 has been identified to be involved in the transport of various metals
such as iron (Fe), zinc (Zn), copper (Cu), manganese) Mn and Cd in rice. In order to identify the function of
OsNRAMP5 in elite rice variety TBR225, we evaluated the expression of the targeted gene and designed Clustered
regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9 (CRISPR/Cas9) system for editing TBR225
OsNRAMP5. The increase of OsNRAMP5 expression was observed in the root tissues of TBR225 rice plant in the
Cd-treatment experiment using hydroponic culture. A sequence containing the ExonI region of OsNRAMP5 with a
size of 0.29kb was isolated from the total DNA of TBR225 to design single guide RNAs (sgRNA) for OsNRAMP5editing CRISPR/Cas9 system. The sgRNA expression construct carrying two CRISPR RNA (crRNA) sequences
recognizing two different sites on the ExonI of OsNRAMP5 was ligated into the binary vector pCas9. The recombinant
vector was validated by PCR and sequencing analysis. The results serve as basis for the improvement of TBR225
rice variety with high quality by using genome editing technology.
Keywords: Cadmium, CRISPR/Cas9, Knocking out gene, OsNRAMP5, TBR225.
1220
Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng,
Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương
-
-
1221
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225
µ
µ
µ
µ
µ
µ
µ
µ
µ
µ
µl
µ
Tên
Trình tự
NRAMP5-F
GGTGTGGCTTGAGAGTTCGT
NRAMP5-R
CATGGTGACAGTGGAGTGCT
NRAMP5-RT-F
CAGCAGCAGTAAGAGCAAGATG
NRAMP5-RT-R
GTGCTCAGGAAGTACATGTTGAT
Actin-F
TGATGGTGTCAGCCACACT
Actin-R
TGGTCTTGGCAGTCTCCATT
attL-F
GTACAAAAAAGCAGGCT
attL-R
GTACAAGAAAGCTGGGT
BtgZI-crRNA1-F
TGTT[GCATCAGCTGGAGAGCTAGTG]
BtgZI-crRNA1-R
AAAC[CACTAGCTCTCCAGCTGATGC]
BsaI-crRNA2-F
GTGT[GATGATCAGCTGCTAATGA]
BsaI-crRNA2-R
AAAC[TCATTAGCAGCTGATCATC]
Ubi-F
Cas9-t-R
CCCTGCCTTCATACGCTATT
GCCTCGGCTGTCTCGCCA
Hpt-F
AAGGAGGTGATCCAGCC
Hpt-R
GAGTTTGATCCTGGCTCAG
1222
Gen đích
OsNRAMP5 [12]
Mục đích
thí nghiệm
Kích thước
(bp)
Phân lập
NRAMP5-TBR
286
RT-PCR
111
OsActin [12]
RT-PCR
230
pENTR4-V2
PCR vector tái
tổ hợp
995
crRNA1-OsNRAMP5
Thiết kế vector
21
crRNA2-OsNRAMP5
pCas9
21
PCR vector tái
tổ hợp
350
821
Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng,
Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương
µ
µ
µ
µ
µ
µ
°
°
°
∞
1223
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225
1224
Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng,
Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương
–
-
1225
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225
Kích thước (bp)
TSL
DSL
TBP
CBP
IBP
% GC
On-score
sgRNA-1
Tên
GATGATCAGCTGCTAATGA
Trình tự crRNA (5’-3’)
19
3
-
12
6
0
40%
0,7456
sgRNA-2
GAGAGAGAGCAGTGAGAGA
19
3
-
11
7
0
55%
0,0912
sgRNA-3
GAGAGAGAGAGCAGTGAGAG
20
3
-
9
3
0
55%
0,1913
sgRNA-4
GTGAGAGAGGGAGCATCAGC
20
3
-
11
3
0
60%
0,1012
sgRNA-5
GCATCAGCTGGAGAGCTAGTG
21
4
SL1
10
4
2
55%
0,3903
sgRNA-6
GAGAGAGAGAGCAGTGAGAGA
21
3
-
9
3
0
55%
0,1913
sgRNA-7
GATCATCTGCGTCGAGCTTCT
21
3
-
11
3
0
55%
0,0323
sgRNA-8
GCAGATGATCAGCTGCTAATGA
22
3
-
13
6
0
45%
0,2272
Tên
Trình tự đoạn DNA tương đồng crRNA
trong hệ gen lúa
Vị trí
Khoảng cách (bp)*
sgRNA-1
GATGATC[AGCTGCTAATGA]
E
0
OsNRAMP5
GATGAGG[AGCTGCTGATGA]
E
0
Os02g0611200
AATAATC[AGCTGCTAATCA]
-
6907
Os11g0508301
GCATCAGCT[GGAGAGCTAGTG]
E
0
sgRNA-5
-
1226
Gen đích/Mã số
OsNRAMP5
Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng,
Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương
1227
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225
→
›
µ
1228
