Khóa K04

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÂM HƯNG KIM HỒN

CƠNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ, BÌNH TUYỂN VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
CÂY MẸ ƯU TÚ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG
SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV)
CHẤT LƯỢNG CAO TẠI QUẢNG NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

LÂM HƯNG KIM HỒN

CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng,08/2022


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÂM HƯNG KIM HỒN

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ, BÌNH TUYỂN VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
CÂY MẸ ƯU TÚ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG
SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV)

CHẤT LƯỢNG CAO TẠI QUẢNG NAM

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Mã số

: 107180388

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀNG TRUNG HIẾU
TS. ĐINH XUÂN TÚ

Đà Nẵng,08/2022


i

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được bài luận văn thạc sĩ này, tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành đến
trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, ban lãnh đạo khoa Hóa và các thầy cơ thuộc bộ
mơn Cơng nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tơi có thể học tập trong suốt hơn hai năm
qua. Và đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Hoàng Trung Hiếu và
thầy Đinh Xuân Tú đã định hướng, trực tiếp dẫn dắt, hướng dẫn và hỗ trợ tận tình cho
tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị ở trung tâm Kỹ thuật Nông
nghiệp, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam đã hỗ trợ và tạo điều kiện hết sức nhiệt
tình để tơi có thể thu thập và sử dụng số liệu cho nghiên cứu này .

Sau cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến những người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn
bên cạnh ủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng như trong thời gian hoàn thành
luận văn thạc sĩ.
Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!
Đà Nẵng, ngày 28 tháng 5 năm 2022
Học viên thực hiện

Lâm Hưng Kim Hoàn

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu đánh giá, bình tuyển và xây dựng tiêu
chuẩn cây mẹ ưu tú phục vụ công tác chọn tạo giống sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv) chất lượng cao tại Quảng Nam” là cơng trình nghiên cứu
của riêng tơi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoàng Trung Hiếu và TS.
Đinh Xuân Tú. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được
ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Người cam đoan

Lâm Hưng Kim Hoàn

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


Lưu hành nội bộ


iii

Nghiên cứu đánh giá, bình tuyển và xây dựng tiêu chuẩn cây mẹ ưu tú phục
vụ công tác chọn tạo giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv) chất lượng cao tại Quảng Nam
Học viên: Lâm Hưng Kim Hoàn Chuyên ngành: Cơng nghệ Sinh học
Mã số: 8420201

Khóa: K40

Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN

Tóm tắt – Từ 15 quần thể sâm Ngọc Linh thu thập được đã qua tuyển chọn sơ bộ
bao gồm 150 cá thể, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để xây dựng bộ chỉ tiêu cây mẹ ưu
tú. Giám định mẫu sâm Ngọc Linh chuẩn theo chỉ thị phân tử cho thấy 100% mẫu sâm
chuẩn. Đánh giá sự đa dạng của quần thể qua 36 đặc điểm hình thái cho thấy quần thể có
sự đồng nhất cao. Mối quan hệ di truyền thể hiện qua hệ số tương đồng di truyền giữa 15
quần thể sâm Ngọc Linh nghiên cứu dao động từ 0,43 - 0,88. Dựa trên đặc điểm sinh
trưởng tốt nghiên cứu đã chọn ra được 4 quần thể sâm Ngọc Linh ưu tú là M1, M3, M9,
M14, và tiếp tục tuyển chọn dựa vào hàm lượng dược liệu cao đã chọn được 2 cá thể sâm
ưu tú là S1 và S6. Hàm lượng dược liệu của các mẫu sâm ưu tú được xác định cao hơn
nhiều so với dược điển Việt Nam. Đề xuất bộ tiêu chuẩn cây mẹ ưu tú có đặc điểm sinh
trưởng phát triển tốt, hàm lượng dược liệu cao bao gồm 17 chỉ tiêu.
Từ khóa – Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv, tiêu chuẩn cây mẹ
ưu tú
Research, evaluate, select and standardization of excellent mother plants for
the selection and breeding of high quality Ngoc Linh ginseng (Panax

vietnamensis Ha et Grushv) in Quang Nam
Abstract - From 15 populations of

Ngoc Linh ginseng collected through

preliminary selection, including 150 individuals, we conducted research to build a
set of excellent mother plants. Examination of standard Ngoc Linh ginseng samples
according to molecular indicators showed that 100% of standard ginseng samples.
Evaluation of the diversity of the population through 36 morphological
characteristics showed that the population had high homogeneity. The genetic
relationship shown by the genetic similarity coefficient between 15 populations of
Ngoc Linh ginseng ranged from 0.43 to 0.88. Based on good growth characteristics,
the research has selected 4 excellent populations of Ngoc Linh ginseng: M1, M3,
M9, M14, and continued to select based on high medicinal content, 2 individuals

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


iv

have been selected is S1 and S6. The medicinal content of the elite ginseng samples
was determined to be much higher than that of the Vietnamese pharmacopoeia.
Proposing a set of standards for an excellent mother plant with good growth and
development characteristics and high medicinal content, including 17 criteria.
Key words – Panax vietnamensis Ha et Grushv, mother tree standard

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


Lưu hành nội bộ


v

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài

1

2. Mục tiêu nghiên cứu

2

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3

3.1. Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................................3
3.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................................3
4. Phương pháp nghiên cứu

3

Các bước nghiên cứu được tiến hành lần lượt như sau:

3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài


4

5.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................................4
5.2. Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

5

1.1. Sâm Ngọc Linh

5

1.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển sâm Ngọc Linh ...................................................5
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh trưởng phát triển của Sâm Ngọc Linh ..........................6
1.1.3. Đặc điểm thành phần hóa học chính trong cây sâm Ngọc Linh ...........................9
1.1.4. Giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh ..................................................................12
1.2. Cơ sở lý thuyết của phương pháp PCR đa mồi (multiplex PCR)

13

1.2.1. Khái niệm .............................................................................................................13
1.2.2. Các loại phản ứng multiplex PCR .......................................................................14
1.2.3. Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR ..........................................................15
1.2.4. Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR ..........................................................15
1.2.5. Tối ưu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR ..................................16
1.2.6. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR ..............................................................18
1.3. Cơ sở lý thuyết của diện di

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


18

Lưu hành nội bộ


vi

1.3.1. Khái niệm .............................................................................................................18
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng ..........................................................................................19
1.3.3. Sự rây phân tử .....................................................................................................20
1.3.4. Điện di gel ...........................................................................................................21
1.3.5. Thiết bị cho điện di gel ........................................................................................21
1.3.6. Linh độ tương đối ................................................................................................ 22
1.3.7. Quan sát các vùng phân tách ..............................................................................22
1.4. Chỉ thị phân tử

23

1.4.1.Khái niệm và đặc điểm .........................................................................................23
1.4.2. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats)............................................................23
1.4.3. Expressed Sequence Tag (EST) ...........................................................................23
1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước có liên quan đến đề tài

224

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................25
1.5.2.Tình hình nghiên cứu ngồi nước.........................................................................27
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 29
2.1. Nguyên vật liệu


29

2.2. Phương pháp nghiên cứu

31

2.2.1. Thu thập mẫu và tách chiết ADN tổng số ............................................................32
2.2.2 Giám định mẫu sâm Ngọc Linh chuẩn bằng kỹ thuật PCR ..................................33
2.2.3. Đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển, đặc điểm hình thái ..........................34
2.2.4. Phân tích định lượng saponin trong củ sâm Việt Nam .......................................35
2.2.5. Xây dựng tiêu chuẩn cây mẹ ưu tú ......................................................................36
2.2.6. Phương pháp thống kê .........................................................................................37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 38
3.1. Kết quả thu thập và giám định mẫu sâm Ngọc Linh chuẩn bằng chỉ thị phân tử
Error! Bookmark not defined.
3.1.1. Thu thập mẫu sâm Ngọc Linh ..............................................................................38

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


vii

3.1.2. Kiểm định tính đúng giống sâm Ngọc Linh bằng kỹ thuật PCR .........................39
3.2. Kết quả đánh giá nguồn gen dựa vào đặc diểm hình thái của sâm Ngọc Linh

41


3.3. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các quần thể sâm Ngọc Linh bằng chỉ thị
EST-SSR

49

3.3.1. Xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCR .........................................50
3.3.2. Xác định allen đa hình và chỉ số PIC ..................................................................51
3.3.3. Mối quan hệ di truyền của các quần thể sâm Ngọc Linh và cây phân loại ........57
3.4. Kết quả đánh giá đặc điểm sinh trưởng của các quần thể và tuyển chọn cây mẹ 69
3.4.1. Đánh giá đặc điểm sinh trưởng ...........................................................................69
3.4.2. Đánh giá hàm lượng dược liệu của các mẫu ưu tú .............................................72
3.4.3. Đề xuất bộ tiêu chuẩn cây mẹ đầu dòng .............................................................75
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................... 77
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................... 78

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


viii

DANH MỤC VIẾT TẮT

ADN

: Deoxyribonucleic acid

KHCN


: Khoa học công nghệ

PCR

: Polemerase Chain Reaction

PIC

: Polymorphic Information Content

Pi

: Tần số xuất hiện của alen thứ i

PCA

: Principal Components Analysis

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


ix

DANH MỤC BẢNG
Số hiệu

Tên bảng


bảng

Trang

1.1

Trọng lượng sâm Ngọc Linh

8

1.2

Thành phần hoá học chung trong sâm Ngọc Linh

9

Hàm lượng của các hoạt chất chính trong bột chiết tồn phần và

12

1.3

saponin tồn phần sâm Ngọc Linh

2.1

Danh sách các mồi EST-SSR

31


2.2

Điều kiện phản ứng PCR

36

3.1

Thời gian, vị trí và đặc điểm của các mẫu sâm Ngọc Linh

41

3.2

Tỷ lệ % mẫu dựa trên các đặc điểm hình thái

46

3.3

Nhiệt độ gắn mồi cho PCR của 29 chỉ thị EST-SSR

55

Số Allen đa hình và giá trị PIC của các chỉ thị EST-SSR phân

60

3.4
3.5

3.6
3.7
3.8

tích trên 15 mẫu Sâm Ngọc Linh.
Hệ số tương đồng di truyền của các giống sâm Ngọc Linh

65

Đặc điểm sinh trưởng thân lá của một số mẫu giống sâm Ngọc

69

Linh
Đặc điểm sinh trưởng hoa, quả, hạt, rễ củ một số mẫu giống

73

Hàm lượng các hoạt chất phân tích trong mẫu giống sâm Ngọc

75

Linh

3.9

Kết quả đánh giá hàm lượng hoạt chất của từng cá thể

75


3.10

Bộ tiêu chuẩn cây mẹ đầu dòng

78

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


x

DANH MỤC HÌNH
Số hiệu hình

Tên hình

Trang

1.1

Sâm Ngọc Linh trồng dưới tán rừng

5

1.2

Một số đặc điểm hình thái của cây sâm Ngọc Linh


7

1.3

Các saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol

10

1.4

Các saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxatriol

11

1.5

Phản ứng multiplex PCR dùng nhiều khuôn

15

Phản ứng multiplex PCR để xác định sự có mặt của nhiều

20

1.6

gen

2.1


Sơ đồ các phương pháp nghiên cứu của đề tài

33

3.1

Ảnh điện di quần thể từ M1-M3

44

3.2

Ảnh điện di quần thể từ M4-M6

44

3.3

Ảnh điện di quần thể từ M7-M9

45

3.4

Ảnh điện di quần thể từ M10-M12

45

3.5


Ảnh điện di quần thể từ M13-M15

45

3.6

Biểu đồ so sánh tính trạng số lá

48

3.7

Biểu đồ so sánh tính trạng chiều dài thân

49

3.8

Biểu đồ so sánh tính trạng chiều dài củ chính

49

3.9

Biểu đồ so sánh tính trạng đường kính củ chính

50

3.10


Biểu đồ so sánh tính trạng chiều dài lá chét trung tâm

50

3.11

Biểu đồ so sánh tính trạng chiều rộng lá chét trung tâm

51

3.12

Biểu đồ so sánh tính trạng chiều rộng lá chét trung tâm

51

3.13

Biểu đồ so sánh tính trạng chiều dài cuống hoa

52

3.14

Biểu đồ so sánh tính trạng đường kính thân

52

3.15


Biểu đồ so sánh tính trạng số lượng quả

53

Biểu đồ phân tích thành phần chính (PCA - Principal

53

3.16

3.17

Component Analysis)
Biểu đồ thể hiện mối quan hệ của 150 cá thể sâm Ngọc

54

Linh

3.18

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị L39

57

3.19

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị L73

57


THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


xi

3.20

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị L111

58

3.21

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị L115

58

3.22

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị L145

59

3.23

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị L149


59

3.24

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị VES02

60

3.25

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị PVM176

60

3.26

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị Mr2U1

62

3.27

Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị PVM104

63

Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền của 15 quần thể sâm Ngọc

67


3.28

3.29

Linh được xác định bằng chỉ thị phân tử EST-SSR
Hình ảnh sắc ký đồ hàm lượng hoạt chất của một số mẫu

78

giống sâm Ngọc Linh

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Sâm Ngọc Linh là lồi thân thảo, có tên khoa học là Panax vietnamesis Ha et Grushv
thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Ngồi ra, cịn có một số tên gọi khác là sâm Việt Nam,
sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm), củ ngải rọm con hay
cây thuốc dấu của đồng bào dân tộc sống xung quanh chân núi Ngọc Linh. Cây sâm Ngọc
Linh được chính thức công bố tại Viện Thực vật Kamarov (Liên Xô cũ) bởi Hà Thị
Dung và I. V. Grushvistky với danh pháp khoa học là Panax vietnamesis Ha & Grushv
năm 1985 [1].
Các loài thuộc chi nhân sâm (Panax) đã được biết đến và sử dụng từ rất sớm trong
y học cổ truyền với tác dụng phục hồi sự suy giảm chức năng và đưa hoạt động của cơ
thể trở lại bình thường. Trong đó, loại sâm được biết và sử dụng nhiều nhất là sâm Triều

Tiên hay còn gọi là sâm Hàn Quốc (Panax ginseng C.A. Meyer), là loại thuốc bổ hàng
đầu của y học cổ truyền phương đông. Ngày nay, với các hiểu biết trên dược tính của
các lồi thuộc chi Panax, cây sâm ngày càng được sử dụng rộng rãi trong y học và các
ngành hóa mỹ phẩm.
Dược chất chính của nhân sâm Panax ginseng C.A. Meyer là ginsenoside
(triterpenic dammaranic saponin). Hai nhóm ginsenoside chính là Rb và Rg có nhóm
20(S) – protopanaxadiol và 20(S) – protopanaxatriol là nhóm sapogenin. Ginsenoside
chính của nhóm Rb là Rb1, Rb2, Rc và Rd. Ginsenoside của nhóm Rg là Re, Rf và
Rg1. Trong đó, hai ginsenoside quan trọng nhất là Rb1 và Rg1 (Tamaka và cs, 1984).
Về mặt hoá học, thân rễ và rễ củ Sâm Ngọc Linh chứa 52 saponin, trong
đó 26 sanopin thường thấy ở các loại sâm, cịn có 26 loại saponin có cấu trúc mới khơng
có ở các lồi sâm khác trên thế giới. Các saponin đóng vai trị quyết định đối với các tác
dụng sinh học, dược lý của sâm Ngọc Linh bao gồm: ngăn ngừa ung thư, bảo vệ tái tạo
tế bào gan, phục hồi chức năng thận, chống stress, giải lo âu, cải thiện trí nhớ, chống
oxy hóa và chống lão hóa, giảm đau, giải độc. [2,4, 22,23]
Sâm Ngọc Linh có những tính chất đặc biệt nổi trội, giá trị kinh tế cao với giá trị sử
dụng được xem là vượt trội hơn so với sâm Triều Tiên, sâm Trung Quốc và sâm Mỹ.
Trước thực trạng khai thác một cách triệt để của người dân, sâm Ngọc Linh đứng trước
nguy cơ tuyệt chủng và nằm trong danh mục 250 loài quý hiếm cần được bảo vệ (Sách
đỏ Việt Nam, 1996).

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


2

Cây sâm Ngọc Linh là loài dược liệu đặc biệt quý hiếm và đặc hữu của nước ta,
chỉ xuất hiện ở 2 tỉnh Quảng Nam và Kon Tum, và các huyện và xã có sâm Ngọc Linh

là Trà Linh, Trà Nam (huyện Trà My - tỉnh Quảng Nam), Ngọc Linh, Mường Hoong
(huyện Đắk Glei - tỉnh Kon Tum) và Măng Ri, Ngọc Lây, Ngọc Yêu, Tê Xăng, Đắk Na
(huyện Tu Mơ Rông - tỉnh Kon Tum). Cây sâm Ngọc Linh được chính phủ xác định là
cây sinh kế và là sản phẩm quốc gia cần được bảo tồn và phát triển, khơng chỉ để tạo ra
sản phẩm có giá trị kinh tế cao, góp phần vào cơng cuộc xóa đói giảm nghèo mà còn
bảo tồn được nguồn gen quý hiếm của đất nước. Do đó nhu cầu về nguồn giống chất
lượng để mở rộng diện tích vùng trồng rất lớn. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cây sâm
Ngọc Linh mới chủ yếu về thành phần hoạt chất và tác dụng sinh học dược lý. Gần đây,
Trương Thị Hồng Hải và cộng sự đã có nghiên cứu mơ tả tính trạng cây sâm Ngọc Linh
4 và 5 tuổi, đưa ra kết luận nên sử dụng cây 5 tuổi trở lên để nghiên cứu các đặc điểm
hình thái điển hình cho lồi sâm Ngọc Linh. Các nghiên cứu về tuyển chọn giống sâm
Ngọc Linh rất hạn chế. Hiện nay, cây sâm Ngọc Linh vẫn được trồng bán hoang dã dưới
tán rừng theo phương pháp truyền thống, công tác nhân giống từ hạt cịn gặp nhiều khó
khăn, chất lượng cây giống khơng đồng đều. Một trong các nguyên nhân là do cây mẹ
chưa được tuyển chọn và tiêu chuẩn hố. Vì vậy chúng tôi quyết định thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu đánh giá, bình tuyển và xây dựng tiêu chuẩn cây mẹ ưu tú phục vụ công
tác chọn tạo giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) chất lượng
cao tại Quảng Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung: Tuyển chọn và xây dựng tiêu chuẩn cây mẹ ưu tú (cây đầu
dòng) để phục vụ cho công tác chọn giống, nhân giống và sản xuất sâm Ngọc Linh chất
lượng cao, góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen, và xây dựng thương hiệu quốc gia
sâm Ngọc Linh.
Mục tiêu cụ thể:
- Đánh giá phân dịng các mẫu sâm Ngọc Linh theo đặc điểm hình thái thực vật học;
- Đánh giá phân loại các mẫu giống theo chất lượng dược liệu sâm Ngọc Linh;
- Xác định 1 - 2 dòng sâm Ngọc Linh ưu tú và đề xuất tiêu chuẩn lựa chọn cây mẹ đầu
dòng.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


Lưu hành nội bộ


3

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Sử dụng 150 mẫu cây sâm Ngọc Linh từ 6 năm tuổi do Trung tâm sâm Ngọc Linh
huyện Nam Trà My thu thập năm 2017, và trồng lưu giữ tại Vườn bảo tồn sâm Ngọc
Linh của Trung tâm ở xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, Quảng Nam.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Về nội dung: Đề tài tiến hành nghiên cứu các đặc điểm hình thái nơng sinh học,
và đánh giá chất lượng dược liệu thơng qua phân tích hàm lượng các saponin chính có
trong củ của cây sâm Ngọc Linh 6 năm tuổi, được thu thập tại thôn 2, thôn 3 và thôn 4
xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam.
- Giám định mẫu sâm Ngọc Linh chuẩn, đánh giá mối quan hệ về kiểu gen tại phịng
thí nghiệm Sinh học Phân tử của Trung tâm ươm tạo và hỗ trợ doanh nghiệp KHCN (bộ
KHCN).
- Phân tích hàm lượng tại phịng Phân tích và kiểm định hóa của Trung tâm ươm
tạo và hỗ trợ doanh nghiệp KHCN (bộ KHCN).
4. Phương pháp nghiên cứu
Các bước nghiên cứu được tiến hành lần lượt như sau:
- Giám định mẫu sâm Ngọc Linh thu thập được trên cơ sở phân tích PCR đa mồi
bằng chỉ thị phân tử ADN đặc hiệu theo quy trình kiểm định sâm Ngọc Linh của Trung
tâm Ươm tạo và Hỗ trợ doanh nghiệp KHCN – Bộ Khoa học và Công Nghệ.
- Thu thập số liệu về hình thái, đặc điểm sinh trưởng và phát triển của tập đoàn
mẫu giống sâm Ngọc Linh. Dựa trên số liệu thu thập đánh giá về sự đa dạng hình thái.
- Đánh giá mối quan hệ về kiểu gen của các quần thể.
- Đánh giá về sự sinh trưởng của các quần thể, lựa chọn ra một số nhóm mẫu ưu

tú.
- Định lượng hàm lượng saponin của các mẫu ưu tú, lựa chon ra những mẫu có
hàm lượng dược liệu cao.
- Xây dựng tiêu chuẩn cây mẹ ưu tú với đặc điểm là các hoạt chất dược học chính
(Rg1, MR2, Rb1 và saponin tổng số) có hàm lượng cao, cây sinh trưởng phát triển tốt,
và các đặc điểm hình thái tương ứng.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


4

5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1.

Ý nghĩa khoa học
- Kết quả của đề tài sẽ đóng góp cơ sở lý luận cho việc nghiên cứu tuyển chọn

giống sâm Ngọc Linh chất lượng cao, đánh giá mức độ đa dạng của quần thể sâm Ngọc
Linh tại Quảng Nam.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung những tư liệu khoa học về chất lượng
dược liệu củ sâm Ngọc Linh, góp phần làm phong phú thêm kho tư liệu về sâm và làm
cơ sở cho các nhà chọn tạo giống nghiên cứu.
5.2.

Ý nghĩa thực tiễn

Chọn lọc được 1-2 dịng sâm Ngọc Linh ưu tú có đặc điểm sinh trưởng phát triển

tốt, và giá trị dược liệu cao phục vụ cho công tác nhân giống, mở rộng diện tích vùng
trồng sâm Ngọc Linh, góp phần bảo vệ rừng, từng bước nâng cao đời sống của người
dân địa phương, đồng thời xây dựng thương hiệu quốc gia sâm Ngọc Linh.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Sâm Ngọc Linh

1.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển sâm Ngọc Linh
Cây sâm Ngọc Linh là cây thuốc giấu của đồng bào dân tộc Xê Đăng sống trên
vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, thân thảo sống đan xen trong
quần thể thực vật đa dạng vùng rừng núi hiểm trở, lạnh và mây mù gần như quanh
năm, khơng có dân cư.
Năm 1973, đoàn điều tra dược liệu Ban Dân Y khu 5 do dược sỹ Đào Kim Long
và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn đã phát hiện được một loài Panax mọc thành quần
thể ở độ cao 1800 m tại vùng Đắk Lây, huyện Đắk Tô, tỉnh Kon Tum và đặt tên là “sâm
Đốt trúc” với tên khoa học sơ bộ xác định là Panax articulatus L., họ nhân sâm
(Araliaceae).
Năm 1974, qua báo cáo của dược sỹ Nguyễn Thới Nhâm về kết quả phân tích
sơ bộ thành phần hóa học cây sâm Ngọc Linh so với cây sâm Triều Tiên và sâm Tam

thất. Khu ủy khu 5 đã cho bảo vệ chặt chẽ vùng sâm này và cũng từ đấy sâm Ngọc Linh
được sử dụng để chữa bệnh có hiệu quả cho các thương bệnh binh, cán bộ và nhân dân
[2].

Hình 1.1: Sâm Ngọc Linh trồng dưới tán rừng

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


6

1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh trưởng phát triển của Sâm Ngọc Linh
Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có
đường kính thân độ 4 – 8 mm, thường tàn lụi hàng năm tuy thỉnh thoảng cũng tồn tại một
vài thân trong vài năm.
- Thân rễ thường nhiều đốt, cong ngoằn ngoèo, ít khi có hình trụ thẳng, dài 3,5 10,5 cm, đường kính 0,5 - 2,0 cm. Mặt ngồi màu nâu hay màu vàng xám (tùy thuộc vào
vị trí nằm trên hay dưới mặt đất). Các thân mang lá và tương ứng với mỗi thân mang lá
là một đốt dài khoảng 0,5 - 0,7 cm, có những vết nhăn dọc, mảnh, những vết vân ngang
nổi rõ chia thân rễ thành nhiều đốt, đặc biệt có nhiều sẹo do thân khí sinh hàng năm tàn
lụi để lại. Tuy sâm chỉ có một lá duy nhất không rụng suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3
và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới có thêm 2 đến 3 lá.
- Rễ củ có dạng hình con quay dài 2,4 - 4 cm, đường kính 1,5 - 2 cm nối liền với
thân rễ, thường hợp thành bó 2 - 4 rễ củ hình thoi. Rễ củ có màu nâu nhạt, có những vân
ngang và nốt các rễ con. Thể chất nạc, chắc, khó bẻ gãy.
- Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt mọc vịng với 3 - 5 nhánh lá.
Cuống lá kép dài 6 - 12 mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài
12 -15 cm, rộng 3 - 4 cm. Lá chét phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá
có lơng ở cả hai mặt.

- Cây 4 - 5 năm tuổi có hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân, cuống tán
hoa dài 10 - 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính.
Mỗi tán có 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, màu vàng nhạt,
nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


7

Hình dạng cây sâm Ngọc Linh

Thân rễ và củ sâm Ngọc Linh

6 năm tuổi

7 năm tuổi

Hoa sâm Ngọc Linh

Quả sâm Ngọc Linh

Hình 1.2: Một số đặc điểm hình thái của cây sâm Ngọc Linh
- Quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 – 1 cm và rộng khoảng 0,5 0,6 cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả
màu đỏ cam với một chấm đen khơng đều ở đỉnh quả. Mỗi quả chứa một hạt, một số quả
chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


Lưu hành nội bộ


8

Bảng 1.1: Trọng lượng sâm Ngọc Linh [2]
Độ tuổi

Chỉ tiêu theo
dõi

4 năm 5 năm 6 năm 7 năm 8 năm 9 năm 10 năm 15 năm

1. Trọng lượng
sâm tươi trung
bình ngun rễ

16,2

18,6

23,2

25,6

27,5

28,2


30,5

32,2

4,13

4,89

6,19

6,92

7,53

7,83

8,71

9,47

tơ (g)
2. Trọng lượng
sâm khơ trung
bình (g)
Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè, do phân bố ở độ cao trên
1.800 m và thảm thực vật nguyên sinh nên môi trường luôn ẩm ướt. Cây ra hoa, quả
tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng
trên 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau.
Sâm Ngọc Linh có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ trên
thân rễ. Thông thường mỗi năm, từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ

mọc lên một thân mang lá. Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ, người ta có thể tính được tuổi
của cây sâm.
- Chu kỳ sinh trưởng của cây Sâm Ngọc Linh:
+ Từ tháng 1 đến tháng 3 xuất hiện và phát triển thân khí sinh, lá và tán hoa.
+ Từ tháng 4 đến tháng 6, cây ra hoa, hoa nở và đậu quả.
+ Từ tháng 7 đến tháng 9 quả chín và chín rộ, rải rác kéo dài tới tháng 10.
+ Từ tháng 11 đến hết tháng 12 thân khí sinh phần lớn tàn lụi (tỷ lệ không tàn lụi
khoảng trên 30%), chồi mầm mới hình thành.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


9

1.1.3. Đặc điểm thành phần hóa học chính trong cây sâm Ngọc Linh
Sâm Ngọc Linh chứa 52 tổ hợp saponin, trong đó 26 hợp chất có cấu trúc đã biết
(thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 26 saponin dammaran có cấu trúc
mới khơng bắt gặp tại các loại sâm khác trên thế giới. Sâm Ngọc Linh chứa chủ yếu các
saponin triterpen, và cũng là một trong những cây sâm có hàm lượng saponin khung
dammaran cao nhất (khoảng 12-15%) và số lượng saponin nhiều nhất so với các lồi khác
của chi Panax [1, 2]. Thành phần hóa học cơ bản trong phần trên và phần dưới mặt đất
của sâm Ngọc linh như bảng bên dưới:
Bảng 1.2: Thành phần hoá học chung trong sâm Ngọc Linh [2]
Bộ phận dùng
Thành phần khảo sát

Phần dưới mặt đất


Phần trên mặt đất

(Thân rễ và rễ củ)

(Lá và cọng thân)

Độ ẩm

7,81

9,27

Độ tro toàn phần

7,80

8,45

Độ tro sulfat

8,13

-

Độ tro không tan trong HCl

1,73

0,46


Nito tổng

0,87

-

Protid thô

5,41

-

18 chất (1,19%)

-

5,68

-

0,53 (14 chất)

-

Đường tự do

6,19

-


Đường

26,77

-

Tinh bột

2,64

-

Tinh dầu

0,05 - 0,01

-

Vitamin C

0,059

-

Saponin toàn phần (pp cân)

15,75

9,0 - 12,66


Acid amin tự do
Lipit
Axit béo

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


10

+ Thành phần hợp chất saponin
✓ Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ)
Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm Ngọc Linh
cũng như các loài sâm khác trên thế giới. Khi phân tích các hợp chất hóa học rễ củ sâm
Ngọc Linh chứa tới 52 saponin (sâm Triều Tiên có khoảng 25 saponin) bao gồm 26
saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina - ginsenoside (VG) R1 đến -R25 và 20-O-Me-G-Rh.

Hình 1.3: Các saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol [2]
Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học có
giá trị của sâm Triều Tiên cũng chiếm một tỷ lệ rất cao về hàm lượng và số lượng trong
thành phần hợp chất saponin của sâm Ngọc Linh (50/52 saponin phân lập được). Trong
đó các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với đại diện chính
là ginsenoside-Rb1, -Rb3, -Rd. Các saponin dẫn chất của protopanaxatriol gồm 17 hợp
chất với các đại diện chính là ginsenoside-Re, -Rg1, notoginsenoside-R1. Các saponin
có cấu trúc occotillol gồm 11 hợp chất với các đại diện chính là majonoside-R1 và -R2.

Hình 1.4: Các saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxatriol [2]

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


Lưu hành nội bộ


11

Theo Yamasaki (2000), các hợp chất saponin mới của sâm Ngọc Linh có một
số đặc điểm đáng chú ý như sau:
VG-R1 và VG-R2 là saponin ocotillol có nhóm acetyl trên chuỗi đường ở C-6.
VG-R3 là chất duy nhất thiếu nhóm -OH tại vị trí C-12 trong tất cả các saponin
được phân lập từ loài này.
VG-R4 là một saponin dẫn xuất của 20(S)-protopanaxatriol có mang một trong hai chuỗi
đường ở C-3, trong khi các saponin này được tìm thấy trước đây chỉ mang các chuỗi
đường ở C-6 và C-20, hoặc C-6 và C-12. VG-R5 và -R6 là hai saponin chứa cầu nối αglycoside hiếm gặp trong tự nhiên. VG-R7 là G-Rd xylosyl hố.VG-R8 một mạch, liên
kết đơi có hướng tại -OH ở C-25. Cấu trúc này có điểm tương đồng với majonoside F4,
3-O- và 20-O-diβ-d-glucoside trên cùng một nhóm aglycone. VG-R9 cũng liên kết đơi
có hướng tại C-36 và cấu trúc tương đồng với majonoside-F1.
VG-R10, -R12, -R13, -R14, -R15, -R16, -R17, -R19, -R20, -R21 là các
saponin có cấu trúc aglycon mới. VG-R13 là một glycoside đầu tiên phát hiện trong
một loài Panax có aglycon là dammarenediol. Chất này là một chất trung gian trong
quá trình sinh tổng hợp của 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)-protopanaxatriol.
Sự phân tích định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã xác định hàm lượng
các saponin chính trong sâm Ngọc Linh 5 tuổi như Bảng 1.3 .
Bảng 1.3: Hàm lượng của các hoạt chất chính trong bột chiết toàn phần và saponin toàn
phần sâm Ngọc Linh
Hoạt chất chính

Hàm lượng (%, w/w)
Bột chiết


Saponin

Majonoside-R2

8,27

22,67

Ginsenoside-Rg1

4,18

7,38

Ginsenoside-Rb1

1,71

3,7

Ginsenoside-Rd

1,57

3,7

✓ Phần trên mặt đất (thân và lá) [2]
Có 19 saponin dammaran đã được phân lập từ phần trên mặt đất của sâm Ngọc
Linh, bao gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là
vinaginsenoside-L1 đến -L8. Khác với phần dưới mặt đất, các saponin dẫn xuất của

20(S)-protopanaxadiol chiếm tỷ lệ rất cao trong thành phần saponin từ phần trên mặt
đất, đại diện chính là notoginsenoside-Fc, G-Rb3, N-Fe và VG-L2. Các saponin dẫn
xuất của 20(S)-protopanaxatriol gồm P-RS1, G-Re và G-Rg1 với tỷ lệ thấp. Ngoài ra,

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


12

cịn có các saponin có cấu trúc ocotillol với đại diện chính là VG-R1 nhưng chiếm tỷ lệ
thấp.
+ Các thành phần khác
Polyacetylene: 7 hợp chất polyacetylene đã được phân lập từ phần dưới mặt đất của sâm
Ngọc Linh.
Acid béo: 17 acid béo từ 8 - 20 cacbon, trong đó chiếm tỷ lệ lớn nhất là acid
linoleic (40,04%); acid palmitic (29,62%); acid oleic (13,26%); acid stearic (4,48%)
và acid linolenic (2,61%).
Acid amin: 18 acid amin đã được xác định. Thành phần này gồm đủ 8 acid
amin cần thiết cho cơ thể, một số acid amin có tỷ lệ rất cao như arginine 46,66%,
lysine 17,90% và tryptophan 10,20% đã được xác định có tính chống lão hố tế bào.
Các ngun tố vi lượng và đa lượng: 20 nguyên tố vi lượng và đa lượng của
phần dưới mặt đất sâm Ngọc Linh đã được xác định, trong đó bao gồm một số các
nguyên tố có tác dụng sinh học như K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se.
1.1.4. Giá trị dược liệu của sâm Ngọc Linh
+ Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: sâm Ngọc Linh liều thấp có tác dụng
kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức
chế thần kinh.
+ Tác dụng chống trầm cảm: sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống

một lần 200 mg/kg hoặc liều 50 - 100 mg/kg dùng trong 7 ngày ở chuột trắng;
majonosid-R2 tiêm màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2 và 12,5
mg/kg.
+ Tác dụng tăng sinh lực: Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng sinh lực trong thí
nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực.
+Tác dụng sinh thích ứng (adaptogenesis): Trong stress vật lý, cho chuột trắng
uống sâm Ngọc Linh liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng của
chuột đối với nhiệt độ cao (37 - 42oC) và nhiệt độ thấp (-5oC), làm kéo dài thời gian
sống thêm của chuột thí nghiệm.
Trong stress cô lập, chuột trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời
gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. Sâm Ngọc Linh liều uống 50 - 200
mg/kg hoặc hoạt chất majonosid-R2 tiêm màng bụng liều 3,1 - 12,5 mg/kg làm cho
thời gian ngủ trở lại bình thường (Nguyễn Thượng Dong và cs, 2007).
+ Tác dụng chống oxy hóa: Trên thí nghiệm in vivo dùng dịch nổi của mô não,
gan và phân đoạn vi thể gan của chuột trắng, saponin sâm Ngọc Linh ở nồng độ 0,05

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ