ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

VŨ NGỌC HOÀNG

ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA 2 BỘ KIT
XÉT NGHIỆM CHUẨN ĐOÁN SARS-COV-2
ĐƯỢC SỬ DỤNG PHỔ BIẾN Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số

: 8420201

TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2022

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


Cơng trình được hồn thành tại
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Minh Xuân

Phản biện 1: TS. Ngơ Thái Bích Vân
Phản biện 2: TS. Phạm Trần Vĩnh Phú

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp
thạc sĩ Công nghệ Sinh học họp tại Trường Đại học Bách khoa
vào ngày 7 tháng 7 năm 2022

Có thể tìm hiểu luận văn tại:
− Trung tâm Học liệu và truyền thông, Trường Đại học Bách khoaĐHĐN;
− Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đại dịch COVID-19, là một đại dịch đang diễn ra trên phạm vi toàn
cầu do Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gây ra. Sars-CoV-2 có tên đầy
đủ là hội chứng hơ hấp cấp tính nghiêm trọng coronavirus 2 để phân
biệt với Sar-Cov-1 diễn ra vào năm 2002 cũng bắt nguồn từ Trung
Quốc. Cho đến nay vẫn chưa có thuốc và cách chữa trị hữu hiệu đối
với COVID-19. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các triệu chứng của
bệnh có thể không xuất hiện trong 2 tuần bị nhiễm virus, tuy nhiên
người bệnh vẫn có thể lây lan virus trong thời gian này.[1]
Trong tình hình chung của thế giới và nhu cầu cấp thiết tại Việt
Nam, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã tiến hành nghiên cứu phát
triển các kit sàng lọc nhanh COVID-19. Trong đó 2 bộ kit đã được Bộ
Y tế cấp phép sử dụng trong các phòng xét nghiệm COVID-19 ở Việt
Nam hiện nay là bộ kit của công ty Việt Á và công ty Sao Thái Dương.

Nhằm khẳng định tính hiệu dụng của 2 bộ kit trong thực tế sử dụng ở
các phòng xét nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá giá trị sử
dụng của 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đốn Sars-CoV-2 được sử dụng
phổ biến ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài nhằm mục đích: “Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kít xét
nghiệm chuẩn đốn Sars-CoV-2 bằng kỹ thuật Real-Time RT-PCR
được sử dụng phổ biến ở Việt Nam là kit của công ty cổ phần công
nghệ Việt Á và của công ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất, nhằm

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


2

khẳng định hiệu quả sử dụng của các kit sàng lọc trong điều kiện thực
tế ở phòng xét nghiệm”.
Mục tiêu cụ thể của đề tài bao gồm:
- Đánh giá về giá cả, và sự thuận lợi trong thao tác cho các kỹ thuật
viên trong điều kiện thực tiễn.
- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thường gặp trong phòng xét
nghiệm: như sự mất mẫu do quá trình tách chiết khi sử dụng các bộ kit
tách chiết khác nhau, sự ảnh hưởng do ngoại nhiễm sản phẩm.
- Đánh giá khả năng sử dụng 2 bộ kit trong trường hợp thực hiện
việc gộp mẫu với số lượng mẫu gộp khác nhau.
- Đánh giá việc nhiễm máu có thể xảy ra trong quá trình lấy mẫu
đến sự phát hiện Sars-Cov-2 của 2 bộ kit.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1. Đối tượng nghiên cứu
➢ Mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân được lấy mẫu và xét nghiệm
Sars- CoV- 2 tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử thuộc Trung tâm
Kiểm soát bệnh tật Quảng Nam.
➢ 2 Bộ Kit xét nghiệm chuẩn đốn Sars- CoV- 2: Bộ kít
LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR của Cơng ty Cổ phần
Cơng nghệ Việt Á; Bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai
Duong của công ty cổ phần Sao Thái Dương.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Các nghiên cứu này được tiến hành ở quy mơ phịng thí nghiệm
nhằm đánh giá lại và so sánh hiệu quả của 2 bộ kit với những yếu tố

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


3

có thể ảnh hưởng đến kết quả RT-PCR nhưng vẫn chưa được công bố
bởi các nhà sản xuất.
4. Phương pháp nghiên cứu
Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong việc lấy
mẫu, bảo quản mẫu, gộp mẫu và xét nghiệm mẫu bằng phản ứng
Realtime RT- PCR nhằm phát hiện Vi rút Sars- CoV- 2 được Bộ Y tế
quy định.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài sử dụng các phương pháp và công cụ sinh học phân tử hiện
đại như Reverse transcription- polymerase chain reaction trên máy…

Kết quả thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm chuyên dụng nhằm
đưa ra kết quả có độ tin cậy cao.
Ngồi ra, các kết quả của đề tài cung cấp thêm các thơng tin khoa
học có giá trị về 2 bộ kit sàng lọc Sars-CoV-2 được phát triển ở Việt
Nam, bao gồm: khả năng bảo tồn mẫu, khả năng loại bỏ sự ngoại nhiễm
sản phẩm, và loại bỏ sự ức chế phản ứng PCR do việc nhiễm mẫu máu
tồn tại trong quá trình lấy mẫu.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các thơng tin khoa học được cung cấp trong đề tài nhằm đưa ra các
khuyến cáo trong việc sử dụng các bộ kit ở điều kiện thực tế, và trong
quá trình đánh giá kết quả thu nhận được, từ đó đảm bảo tính chính
xác của các kết quả xét nghiệm.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Đại dịch COVID-19

Đại dịch COVID-19 là một đại dịch bệnh truyền nhiễm với tác
nhân là virus SARS-CoV-2 và các biến thể của nó đang diễn ra trên
phạm vi toàn cầu.[15] Khởi nguồn vào cuối tháng 12 năm 2019 với tâm
dịch đầu tiên tại thành phố Vũ Hán thuộc miền Trung Trung Quốc đại
lục, bắt nguồn từ một nhóm người mắc viêm phổi khơng rõ ngun

nhân. Giới chức y tế địa phương xác nhận rằng trước đó họ đã từng
tiếp xúc, chủ yếu với những thương nhân buôn bán và làm việc tại chợ
bán buôn hải sản Hoa Nam. Các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến
hành nghiên cứu và phân lập được một chủng coronavirus mà Tổ chức
Y tế Thế giới lúc đó tạm gọi là 2019-nCoV, có trình tự gen giống
với SARS-CoV trước đây với mức tương đồng lên tới 79,5%.[16][17][18]
Ngày 11 tháng 3 năm 2020, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ra tuyên
bố gọi "COVID-19" là "Đại dịch toàn cầu".[21]
Những ảnh hưởng trên toàn thế giới của đại dịch COVID-19 hiện
nay bao gồm: thiệt hại sinh mạng con người, sự bất ổn về kinh tế và xã
hội,[23] tình trạng bài ngoại và phân biệt chủng tộc đối với người gốc
Trung Quốc và Đông Á, việc truyền bá thông tin sai lệch trực tuyến và
vũ khí sinh học.[24]
1.2. Tình hình dịch bệnh Covid-19 trong nước và thế giới
1.2.1. Tình hình dịch bệnh Covid-19 trên thế giới

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


5

Tính đến ngày 11/3/2022, chạm ngưỡng 2 năm sau khi Tổ chức Y tế
thế giới tuyên bố COVID-19 là “đại dịch tồn cầu”, thế giới có hơn 450
triệu ca mắc, 6,01 triệu ca tử vong.
1.2.2. Tình hình dịch bệnh Covid-19 trong nước
Tại Việt Nam, tính đến sáng 11/3/2022, Việt Nam có hơn 5,26 triệu
ca nhiễm, đứng thứ 20/225 quốc gia và vùng lãnh thổ, cịn tính về số ca
mắc trên 1 triệu dân thì nước ta đứng thứ 130 (bình quân cứ 1 triệu

người có 53.253 ca mắc). [25]
1.3. Tổng quan về vi rút SARS-CoV-2
1.3.1. Tên gọi
Virus corona gây hội chứng hơ hấp cấp tính nặng 2, viết tắt SARSCoV-2 (tiếng Anh: Severe acute respiratory syndrome corona virus
2),[26] trước đây có tên là virus corona mới 2019 (2019-nCoV) và cũng
được gọi là virus corona ở người 2019 (HCoV-19 hoặc hCoV-19), là
một chủng coronavirus gây ra bệnh viêm đường hô hấp cấp do virus
corona 2019 (COVID-19),[27] xuất hiện lần đầu tiên vào tháng 12 năm
2019, trong đợt bùng phát đại dịch COVID-19 ở thành phố Vũ Hán,
Trung Quốc và bắt đầu lây lan nhanh chóng, sau đó trở thành một đại
dịch toàn cầu.
1.3.2. Vi rút SARS-CoV-2

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


6

1.3.2.1. Cấu trúc
Mỗi virion SARS-CoV-2 có đường kính 60–140 nanomet (2,4 ×
10−6–5,5 × 10−6 in);

[40].

SARS-CoV-2 bao gồm và 4 loại protein cấu

trúc khác nhau: N, S, E và M. Protein N, hoặc nucleocapsid, bao bọc
bộ gen, trong khi các protein S (gai), E (vỏ) và M (màng) bao gồm lớp

vỏ kép lipid xung quanh. [41] Đặc biệt là protein S, cho phép virus lây
nhiễm vào tế bào thông qua thụ thể ACE-2 trên màng tế bào và sau đó
dung hợp với màng. Điều này làm cho cấu trúc protein này và thụ thể
tế bào chủ của nó trở thành mục tiêu lý tưởng cho các phương pháp
điều trị.
1.3.2.2. Bộ gene
SARS-CoV-2 có bộ gen RNA mạch đơn, tuyến tính, cảm nhận
dương, dài khoảng 30.000 base. [44] Bộ gen của virus là RNA sợi dương
có thể hoạt động như RNA thơng tin (mRNA) và được dịch mã trực
tiếp thành protein trong tế bào chủ của chúng. Các chất trung gian RNA
sợi âm cũng được tạo ra bởi các CoV đóng vai trị như khuôn mẫu cho:
tổng hợp RNA bộ gen sợi dương, sau đó được đóng gói bởi các protein
cấu trúc để lắp ráp virion con; và các bản phiên mã RNA dưới hệ gen.
Bộ gen của nó có khuynh hướng ít các nucleotide cytosine (C) và
guanine (G), giống như các coronavirus khác.
1.3.2.3. Chu kỳ nhân bản của virus
Nhiễm virus bắt đầu khi các phần tử virus liên kết với các thụ thể
tế bào trên bề mặt vật chủ. Các thí nghiệm mơ hình protein trên protein
đột biến của virus đã sớm gợi ý rằng SARS‑CoV‑2 có đủ ái lực với
enzym chuyển đổi angiotensin 2 (ACE2) trên tế bào người để sử dụng
chúng như một cơ chế xâm nhập tế bào.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


7

Protein, serine 2 (TMPRSS2), protease xuyên màng, là yếu tố

cần thiết cho sự xâm nhập của SARS ‑ CoV ‑ 2. [49] Protein neuropilin
1 (NRP1) của tế bào chủ có thể hỗ trợ virus xâm nhập vào tế bào vật
chủ bằng cách sử dụng ACE2. Sau khi virion SARS ‑ CoV ‑ 2 gắn vào
tế bào đích, TMPRSS2 của tế bào sẽ cắt mở protein đột biến của vi rút,
để lộ một peptid dung hợp trong tiểu đơn vị S2 và thụ thể chủ là ACE2.
Sau khi dung hợp, một endosome hình thành xung quanh virion, ngăn
cách nó với phần cịn lại của tế bào chủ. Virion thốt ra khi độ pH của
endosome giảm xuống hoặc khi cathepsin, một cysteine protease của
vật chủ, phân cắt nó. Sau đó, virion giải phóng RNA vào tế bào và
buộc tế bào sản xuất và phổ biến các bản sao của vi rút, vi rút lây nhiễm
sang nhiều tế bào hơn.
1.3.3. Phát sinh loài và các biến thể
Có hàng nghìn biến thể của SARS-CoV-2, có thể được nhóm lại
thành các nhóm lớn hơn nhiều. Một số danh pháp phân nhánh khác
nhau đã được đề xuất. Nextstrain chia các biến thể thành năm nhóm
(19A, 19B, 20A, 20B và 20C), trong khi GISAID chia chúng thành
bảy (L, O, V, S, G, GH và GR). [50]
Một số biến thể đáng chú ý của SARS-CoV-2 đã xuất hiện vào cuối
năm 2020. Tổ chức Y tế Thế giới hiện đã tuyên bố năm biến thể cần
quan tâm, đó là: [51]
• Alpha: Lineage B.1.1.7 xuất hiện ở Vương quốc Anh vào tháng 9
năm 2020, với bằng chứng về khả năng lây truyền và độc lực gia tăng.
Các đột biến đáng chú ý bao gồm N501Y và P681H.

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


8


• Beta: Lineage B.1.351 xuất hiện ở Nam Phi vào tháng 5 năm
2020, với bằng chứng về khả năng lây truyền gia tăng và thay đổi tính
kháng nguyên, với một số quan chức y tế công cộng đưa ra cảnh báo
về tác động của nó đối với hiệu quả của một số loại vắc xin. Các đột
biến đáng chú ý bao gồm K417N, E484K và N501Y.
• Gamma: Lineage P.1 xuất hiện ở Brazil vào tháng 11 năm 2020,
cũng với bằng chứng về khả năng lây truyền và độc lực gia tăng, cùng
với những thay đổi về tính kháng nguyên. Mối quan tâm tương tự về
hiệu quả của vắc-xin cũng đã được nêu ra. Các đột biến đáng chú ý
cũng bao gồm K417N, E484K và N501Y.
• Delta: Lineage B.1.617.2 xuất hiện ở Ấn Độ vào tháng 10 năm
2020. Cũng có bằng chứng về sự gia tăng khả năng lây truyền và thay
đổi tính kháng ngun.
• Omicron: Lineage B.1.1.529 xuất hiện ở Botswana vào tháng 11
năm 2021.
Các biến thể đáng chú ý khác bao gồm 6 biến thể khác do WHO chỉ
định đang được điều tra và Cụm 5, xuất hiện trong số chồn ở Đan Mạch
và dẫn đến chiến dịch diệt chồn khiến nó gần như tuyệt chủng. [51]
1.4. Vai trị của xét nghiệm và các yếu tố ảnh hưởng đến kết
quả xét nghiệm Sars-CoV-2 bằng kỹ thuật Real Time RT-PCR
1.4.1. Real Time RT-PCR
Tế bào, ở tất cả các sinh vật điều hòa sự biểu hiện gen bằng chu kỳ
phiên mã gen (RNA sợi đơn): Số lượng gen biểu hiện trong tế bào có
thể được đo bằng số lượng bản sao phiên mã RNA của gen đó có trong

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ



9

mẫu. Để phát hiện và định lượng rõ ràng sự biểu hiện gen từ một lượng
nhỏ RNA, cần phải khuếch đại bản sao gen. Phản ứng chuỗi
polymerase (PCR) là một phương pháp phổ biến để khuếch đại DNA;
đối với PCR dựa trên RNA, mẫu RNA đầu tiên được phiên mã ngược
thành DNA bổ sung (cDNA) với enzym phiên mã ngược, nên còn được
gọi là PCR phiên mã ngược (RT-PCR, Reverse Transcription
Polymerase Chain Reaction).
Tiếp theo, để khuếch đại một lượng nhỏ DNA, phương pháp tương
tự được sử dụng như trong PCR thơng thường cần có khn mẫu DNA,
ít nhất một cặp mồi cụ thể, deoxyribonucleotide triphosphat, dung dịch
đệm thích hợp và DNA polymerase bền nhiệt. Một chất được đánh dấu
bằng fluorophore được thêm vào hỗn hợp này trong một máy tuần hồn
nhiệt có chứa các cảm biến để đo huỳnh quang của fluorophore sau khi
nó đã được kích thích ở bước sóng yêu cầu cho phép đo tốc độ tạo ra
cho một hoặc nhiều sản phẩm cụ thể. Điều này cho phép đo tốc độ tạo
ra sản phẩm khuếch đại ở mỗi chu kỳ PCR. Do đó, dữ liệu được tạo ra
có thể được phân tích bằng phần mềm máy tính để tính tốn biểu hiện
gen tương đối (hoặc số bản sao mRNA) trong một số mẫu. PCR định
lượng cũng có thể được áp dụng để phát hiện và định lượng DNA trong
các mẫu để xác định sự hiện diện và sự phong phú của một chuỗi DNA
cụ thể trong các mẫu này. [5] Phép đo này được thực hiện sau mỗi chu
kỳ khuếch đại, và đây là lý do tại sao phương pháp này được gọi là
PCR thời gian thực (realtime PCR, tức là PCR tức thì hoặc đồng thời).
1.4.2. Yếu tố ảnh hưởng kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật
Real Time RT-PCR

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


Lưu hành nội bộ


10

Phương pháp xét nghiệm bằng kĩ thuật Realtime RT-PCR được coi
là tiêu chuẩn vàng để khẳng định ca bệnh nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu
cao. Tuy nhiên, các phòng xét nghiệm cần lưu ý các yếu tố kĩ thuật có
thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. Các nguyên nhân gây âm tính
giả có thể do chất lượng mẫu khơng đạt, thời gian lấy mẫu, hay hóa
chất sử dụng. Các nguyên nhân gây dương tính giả thường liên quan
đến thao tác của kĩ thuật viên cũngnhư hóa chất, trang thiết bị. Nhận
định tốt các nguyên nhân này sẽ giúp phòng xét nghiệm làm tốt hơn
trong phiên giải kết quả, đồng thời đảm bảo chất lượng xét nghiệm để
phục vụ chống dịch hiệu quả hơn. Dưới đây là tác động của từngyếu tố
có thể dẫn đến kết quả âm tính giả và dương tínhgiả của xét nghiệm PCR
chẩn đốn SARS-CoV-2. [53]
1.5. Ngoại nhiễm sản phẩm PCR, gây dương tính giả

trong phòng xét nghiệm Sinh học phân tử.
1.5.1. Vấn đề ngoại nhiễm sản phẩm PCR và khả năng phòng
ngừa ngoại nhiễm sản phẩm PCR của các bộ kít xét nghiệm SarsCoV-2.
Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức đối với các phịng thí
nghiệm sinh học phân tử. Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học đã có
thể giải quyết vấn đề này một cách khá hữu hiệu, đó là trong thành
phần dNTP có bổ sung thêm một ít dUTP. Các sản phẩm PCR tạo ra
sẽ luôn tồn tại một số vị trí là U thay vì T, các vị trí U này sẽ có thể xử
lý phân hủy bằng enzme UNG. Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật
(template) sẽ không chứa U, vì vậy ủ PCR mix với enzyme UNG trước


THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


11

khi chạy phản ứng PCR sẽ giúp phân cắt toàn bộ các DNA ngoại nhiễm
mà không ảnh hưởng đến template.
1.5.2. Cách khử nhiễm và loại bỏ dương tính giả trong phản
ứng PCR tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử.
- Cách thức: Phun/ xịt khu vực làm PCR/ thiết bị với 10% thuốc
tẩy, sau đó để yên trong 15-30 phút. Tiếp theo lau sạch thuốc tẩy bằng
nước sạch.
- Thời gian: Quy trình lau rửa này nên được thực hiện trước và sau
mỗi lần làm PCR. Bạn có thể lên lịch vệ sinh các thiết bị và khu vực
làm PCR hàng tuần, đây cũng là một cách rất hữu hiệu để ngăn chặn
việc nhiễm trong phản ứng PCR.
1.6. Sự tương tác của các thành phần trong máu đối với phản
ứng PCR.
Hiện nay, trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, người ta đã phát
hiện ra một số hóa chất có thể ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng
này. Những chất ức chế PCR có thể ảnh hưởng đến tốc độ hoặc gây
nhiễu phản ứng bằng cách gắn trực tiếp vào DNA/ RNA đích, làm mất
hoạt tính enzym DNA polymerase hoặc gây mất tác dụng hoạt hóa của
ion Mg2+ trong quá trình phản ứng, … [56]
Việc phát hiện và khắc phục ảnh hưởng của các chất ức chế phản
ứng PCR cho phép các phịng thí nghiệm sinh học phân tử lựa chọn tốt
các mẫu hơn, thu được tỷ lệ khuếch đại thành cơng cao hơn và hiệu

quả của phịng thí nghiệm được cải thiện hơn. [56]

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


12

1.7. Giới thiệu về 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán SARS-CoV2 do Việt Nam sản xuất
Việt Nam sản xuất 2 bộ kít xét nghiệm và đã được Bộ Y tế cấp phép
sử dụng trong các phòng xét nghiệm COVID-19 đó là:
+ Một là: Bộ kit của cơng ty Việt Á (ra mắt ngày 5-3-2020 và đến
ngày 24/4/2020, được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận và đánh
giá đạt chuẩn quốc tế.
+ Hai là bộ kít của Cơng ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất đã
được Bộ Y tế Việt Nam cấp số lưu hành vào ngày 7/5/2020. Bộ kit là
kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Viện Kiểm định Quốc
gia Vaccine và sinh phẩm y tế và Đại học Bách khoa Hà Nội, sau đó
chuyển giao cơng nghệ cho cơng ty cổ phần Sao Thái Dương.

CHƯƠNG 2:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Sơ đồ nghiên cứu

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ



13

Với mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, chúng tôi thực hiện các phương
pháp nghiên cứu tương ứng được trình bày cụ thể theo sơ đồ sau:
Đánh giá sơ bộ 2 bộ kít
(quy trình, thời gian, chi
phí…)

So sánh Ct và CV của 2 bộ
kít
2 bộ
kít
xét
nghiệm
chuẩn

Đánh giá khả năng phịng
ngừa ngoại nhiễm sản

Đánh
giá 2
bộ kít

Khảo sát sự thay đổi chu kỳ
ngưỡng khi gộp mẫu
Kiểm tra sự tương tác của
phản
ứng PCR do nhiễm
mẫu máu
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

2.2. Đối tượng, thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân được lấy mẫu, xét nghiệm
Sars- CoV- 2 và lưu mẫu tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử thuộc
Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Quảng Nam.
- 2 Bộ Kit xét nghiệm chuẩn đoán Sars- CoV- 2 Việt Nam sản xuất.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong việc lấy

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


14

mẫu, bảo quản mẫu, gộp mẫu và xét nghiệm mẫu bằng phản ứng
Realtime RT- PCR nhằm phát hiện Vi rút Sars- CoV- 2 được Bộ Y tế
quy định.
2.3.1. Phương pháp biện luận kết quả
Mẫu dương tính khi có đường khuyếch đại dạng log và linear, máy
hiển thị giá trị ct (<40).
Mẫu âm tính khi khơng có đường khuyếch đại, máy không hiển thị
giá trị ct mà hiển thị: non detectable.
Mẫu nghi ngờ khi có đường khuyếch đại rất muộn, khơng rõ ràng
(giá trị ct>40). Đối với những mẫu này cần lặp lại xét nghiệm.
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Dùng các phần mềm xử lý số liệu như Excel, SPSS, để xử lý kết
quả thu được. Để so sánh tìm sự khác biệt giữa 2 bộ kit, paired sample
t-test được sử dụng.

Số liệu thí nghiệm là kết quả trung bình cộng của ít nhất 3 lần lặp
lại. Kết quả thí nghiệm được xử lý để thu giá trị trung bình và giá trị
độ lệch chuẩn trên phần mềm Excel. Giá trị hệ số biến thiên CV được
tính tốn dựa trên cơng thức dưới đây:
𝐶𝑉% =

𝑆𝐷
× 100%
𝑋̅

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá quy trình thực hiện, thời gian tiến hành, chi phí
và một số chỉ số khác của 2 bộ kit

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


15

Từ 2 quy trình xét nghiệm của 2 bộ kít, chúng tơi tiến hành so sánh,
đánh giá 2 bộ kít thông qua các chỉ số: phương pháp tách chiết RNA,
vùng gen phát hiện, đối chứng, thời gian thực hiện, chi phí v.v… cho
một xét nghiệm theo như nội dung trong bảng dưới đây:

Các chỉ
tiêu

Phươ

ng pháp
tách chiết
RNA

Thời
gian thực
hiện 01
xét
nghiệm

Bộ kít Việt Á

Bộ kít Sao Thái
Dương

Phương pháp
Phương pháp
tách chiết hữu cơ
ly tâm, sử dụng
màng
lọc

- Thời gian
tách chiết: 50-60
phút;
- Thời gian
chạy phản ứng: 73
phút;

- Thời

tách chiết:
phút;
- Thời
chạy phản
110’

gian
20-25

Yêu cầu kỹ
thuật của WHO
dành cho kit
phát hiện SarsCoV-2
bằng
nucleic acid
Tùy chọn

- 4-5 giờ
- Lý tưởng là <
3.5 h

gian
ứng:

Tổng thời gian:
Tổng thời gian:
123-133 phút.
130-135 phút.

- Gen mục

- Gen mục
Vùng
tiêu: N1, N2 là 2
gene phát tiêu là gen N;
vùng gen đặc hiệu

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

- Ít nhất hai mục
tiêu độc lập trên

Lưu hành nội bộ


16

- Kênh màu
FAM xác định
trình tự mục tiêu
SARS-CoV-2,
màu TEXAS
RED xác định
SARS- like
coronaviruses,
màu HEX xác
định chứng nội.

cho SARS-CoV-2
và N3 (gen chung
phát hiện các

novel
coronaviruses,
trong đó có
SARS-CoV-2);
- Kênh màu
ROX xác định gen
N1, màu HEX xác
định gen N2, màu
FAM xác định gen
N3, Cy5 xác định
chứng nội.

Đối
chứng
âm

- Đi kèm
trong bộ kit

- Đi kèm
trong bộ kit

- Phải có

Đối
chứng
dương

- Đi kèm
trong bộ kit


- Đi kèm
trong bộ kit

- Phải có

hiện (mồi
– primer)

Giới
hạn phát
hiện
(LOD)

≤ 5 copy/ µL,
đối với loại bệnh
phẩm đường hơ
hấp trên hoặc
đường hơ hấp
dưới

≤ 5 copy/ µL,
đối với loại bệnh
phẩm đường hô
hấp trên hoặc
đường hô hấp
dưới

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


bộ gen SARSCoV-2.
- Tuy nhiên, ở
những khu vực
có sự lây lan
SARS-CoV-2
lớn, một vùng
gen phát hiện có
thể được chấp
nhận với một
mục tiêu phân
biệt duy nhất.

- Có thể chấp
nhận:
Tương
đương với 10³
copy/ mL ở bất
kỳ loại mẫu
bệnh
phẩm
đường hô hấp
nào.
- Mong muốn:
Tương đương
với 10² copy/mL

Lưu hành nội bộ


17


với mẫu bệnh
phẩm như ở trên
và bệnh phẩm
đường hô hấp
dưới và phân.
Tỉ lệ
sai sót

Chưa tìm thấy
cơng bố

Chưa tìm thấy
cơng bố

<5%

Độ
chụm

Chưa tìm thấy
cơng bố

Chưa tìm thấy
cơng bố

- Độ chụm (lặp
lại trên cùng một
mẫu): CV< 3%
- Độ chụm (lặp

lại trên cùng một
mẫu tách chiết
được thực hiện
bởi nhiều người
khác
nhau):
CV<5%

Thể
tích mẫu

200 µl mẫu ban
đầu được lấy trong
ống falcon chứa
3ml mơi trường
vận chuyển virus

200 µl mẫu ban
đầu được lấy trong
ống falcon chứa
3ml môi trường
vận chuyển virus

Một lần lấy mẫu
và mẫu đã chứa
trong dịch bảo
quản
(theo
hướng dẫn lấy
mẫu)


Tùy từng thời
điểm mà giá niêm
yết của công ty
khoảng từ 470 đến
540 nghìn đồng
trên 1 sản phẩm.

Tùy từng thời
điểm mà giá niêm
yết của cơng ty
khoảng từ 300 đến
385 nghìn đồng
trên 1 sản phẩm.

Chi
phí cho 1
xét
nghiệm

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


18

Khả
năng
tương

thích với
các thiết
bị
Realtime
PCR

Tương thích
với các hệ thống
xét nghiệm RTPCR

Tương thích
với các hệ thống
xét nghiệm RTPCR

Thích hợp tối
thiểu với các hệ
thống real time
PCR

2-8oC đối với
sinh phẩm tách
chiết, -20oC±-5oC
đối với sinh phẩm
chạy phản ứng.

Từ -25 đến 25oC

Điều
kiện bảo
quản


2-8oC đối với
sinh phẩm tách
chiết, -20oC±-5oC
đối với sinh phẩm
chạy phản ứng.

Độ ổn
định khi
sử dụng
ở các
điều kiện
được
kiểm sốt
(nhiệt độ
và ẩm
ướt)
Hạn
sử dụng
của kit /
thuốc thử
khi sản

Chưa tìm thấy
Chưa tìm thấy - Từ 10 ° C đến
cơng bố
cơng bố
35 ° C; không bị
ảnh hưởng bởi độ
ẩm. Sự ổn định

của bộ kit sau khi
mở là 30–60
ngày.

12 tháng

12 tháng

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

> 12 tháng

Lưu hành nội bộ


19

xuất
(tháng)
3.2. So sánh chu kỳ ngưỡng (Ct) và CV trên cùng một mẫu
dương tính được chuẩn bị từ 2 bộ kit.
Ct value (threshold cycle value) được gọi là giá trị chu kỳ ngưỡng.
Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại một thời điểm thiết bị Real-time RT-PCR
bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng PCR
vượt qua cường độ huỳnh quang nền, hay là số chu kỳ máy phải chạy
để phát hiện được tín hiệu huỳnh quang từ mẫu bệnh phẩm.

Hình 3.4: Biểu đồ so sánh giá trị Ct trung bình của các mẫu khi
được phân tích bằng các kit khác nhau. Độ sai lệch giữa 3 lần
chạy trên cùng một mẫu được thể hiện bằng độ lệch chuẩn. **, giá

trị p < 0.01 bằng kiểm định paired sample t-test
Kết quả trên cho thấy, có sự khác biệt nhỏ nhưng có ý nghĩa thống
kê về giá trị Ct của mẫu được xét nghiệm bằng kit Việt Á và kit Sao
Thái Dương (Hình 3.4). Sử dụng phép kiểm định paired sample t-test
để đánh giá sự khác biệt giữa 2 bộ kit cho giá trị p = 0.00079. Tuy

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


20

nhiên, sự khác biệt này là không đáng kể, chỉ từ 1-2 Ct và cao hơn ở
kit Việt Á.
Độ chụm cho biết sự sai khác trong các lần lặp lại trên cùng một
mẫu, và được thể hiện qua hệ số biến thiên (CV%).
Bảng 3.2 Độ chụm và khoảng tin cậy của độ chụm của 3 kit XN
Khoảng tin

CV (%)

Khoảng tin CV (%) đã

cậy 95%

cậy 95%

điều chỉnh


của CV%

của CV%

(Adj.CV)

đã được
điều chỉnh

Việt Á
Sao Thái
Dương
WHO

1.35

0.95 - 1.76

1.41

1.01 - 1.82

1.26

0.99 - 1.52

1.31

1.04 - 1.58


0.65

0 - 1.38

0.67

0 - 1.4

Kết quả cho thấy giá trị CV% của cả 3 loại kit đều nhỏ hơn 3% theo
như yêu cầu của WHO về kit xét nghiệm Sars-CoV-2, và khoảng tin
cậy 95% cũng nằm trong giới hạn cho phép. Tuy vậy, so với kit của
WHO thì giá trị CV của các kit được sản xuất tại Việt Nam có giá trị
tương đối lớn, gần như gấp đôi. Nhưng khi so với các kit khác đã được
công bố như The RADI COVID-19 Detection Kit có giá trị CV từ 0.692.21, thì các kit của Việt Nam vẫn đảm bảo.
3.3. Đánh giá khả năng phòng ngừa ngoại nhiễm sản phẩm
PCR của 2 bộ kit

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


21

Đối với phương pháp gây nhiễm loại 01: Mẫu gây nhiễm là sản
phẩm từ phản ứng RT-PCR cho kết quả dương tính với vi rút SarsCoV-2 ở Ct 20,32.
Bảng 3.3: Kết quả đối với mẫu gây nhiễm loại 1
LẦN 1

LẦN 2


LẦN 3

VIỆT Á

>40

>40

>40

SAO THÁI
DƯƠNG

>40

>40

>40

Đối với phương pháp gây nhiễm loại 02: Mẫu gây nhiễm RNA
ban đầu cho kết quả dương tính với vi rút Sars-CoV-2 ở Ct 20,32.
Bảng 3.4: Kết quả đối với mẫu gây nhiễm loại 2
LẦN 1

LẦN 2

LẦN 3

VIỆT Á


23.15

24.98

24.41

SAO THÁI
DƯƠNG

24.52

25.36

24.16

3.4. Khảo sát sự thay đổi về số chu kỳ nhiệt khi gộp 4, gộp 9,
gộp 14 mẫu âm tính với 1 mẫu dương tính Sar-CoV- 2
Bảng 3.5: Bảng giá trị Ct của các mẫu gộp sau phản ứng
Realtime RT-PCR bằng bộ kít Việt Á.
Sinh phẩm Việt Á (TB±độ lệch chuẩn)

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


22

Mẫu

dương tính
ban đầu
(A1)
Gộp 5
mẫu
(1 dương
và 4 âm)
(A2)
Gộp 10
mẫu
(1 dương
và 9 âm)
(A3)
Gộp 15
mẫu
(1 dương
và 14 âm)
(A4)

MẪU 1

MẪU 2

MẪU 3

MẪU 4

MẪU 5

12.27±


14.13±

18.78±

24.98±

29.91±

0.16

0.21

0.12

0.23

0.15

15.28±

17.32±

21.51±

26.60±

31.33±

0.21


0.2

0.18

0.07

0.22

16.65±

18.63±

23.16±

27.75±

32.11±

0.15

0.28

0.11

0.12

0.24

17.61±


19.14±

24.89±

28.88±

33.17±

0.28

0.32

0.22

0.24

0.24

Bảng 3.6: Bảng giá trị Ct của các mẫu gộp sau phản ứng
Realtime RT-PCR bằng bộ kít Sao Thái Dương.
Sinh phẩm Sao Thái Dương (TB±độ lệch chuẩn)

Mẫu
dương tính

MẪU 1

MẪU 2


MẪU 3

MẪU 4

MẪU 5

16.22±

17.37±

23.99±

23,70±

25,75±

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.

Lưu hành nội bộ


23

ban đầu
(B1)
Gộp 5
mẫu
(1 dương
và 4 âm)
(B2)

Gộp 10
mẫu
(1 dương
và 9 âm)
(B3)
Gộp 15
mẫu
(1 dương
và 14 âm)
(B4)

0.12

0.22

0.1

0.08

0.18

19.01±

20.00±

25.84±

25,28±

27,83±


0.21

0.22

0.14

0.14

0.18

20.35±

21.61±

26.77±

26,85±

28,15±

0.22

0.24

0.16

0.22

0.12


21.24±
0.21

23.32±
0.23

28.04±
0.12

27,97±
0.25

29,06±
0.32

Kết quả trên cho thấy, các bộ kit vẫn hoạt động cho các mẫu gộp
thậm chí cho các mẫu gộp lớn 15 mẫu. Tuy việc gộp mẫu làm gia tăng
giá trị Ct, nhưng vẫn nằm trong vùng phát hiện dương tính (Ct<40).

3.5. Kiểm tra sự tương tác của phản ứng RT-PCR do nhiễm
mẫu máu
Bảng 3.7: Bảng kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR mẫu
gây nhiễm máu bằng bộ kít Việt Á .
Sinh phẩm Việt Á
MẪU 1

MẪU 2

THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG.


MẪU 3

Lưu hành nội bộ