BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP
CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU

TÊN

TÀI:

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN
OLIGOSACCHARIDES BẰNG CELLULASE QUY MƠ 50 LÍT

CHỦ NHIỆM

TÀI

KS. NGUYỄN HỒNG THẢO LY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 12/2015

i


TÓM TẮT
ề

: N
ế

.M

ố
COS . C

cellula
ế

ố

ế

ế
o

.

C), pH (5, 5.5

ế

5
. Kế

o

ế

C, pH


ố

. S

ế

ố

ề

ữ

ề

ố

ố

COS

. Kế
:

o

C

:
:


H:

COS

kDa, DD>80%. T

ề

COS

ổ

.

ii

ề

<
ử

ổ FTIR


ABSTRACT
P j

S
w


w
f

January to December of 2015. The purpose of this

research was to determine appropriate conditions for hydrolysis chitosan using cho
cellulase to make chitosan oligosaccharide (COS). We carried out affective factors to
hydrolysis processing such as dilution ratio of enzyme (50, 75, 100, 125 times),
temperature (50, 55, 60, 65oC), pH (5, 5.5, 6, 6.5) and time (from 0.5h to 6h) with
laboratory scale. Results show that 100 times dilution enzyme, 60°C, pH 6 and
hydrolysis time under 5.5 hours were approciate in labotory scale. Response surface
methodology – RSM was applied with parameters to determine optimum conditions for
isolative processing COS at 50 liters scale. Experimental results show that COS with
molecular weight <20 kDa, degree of deacetylation, DD>80% were isolated at 75 times
enzyme dilution, pH 5.5, 60oC, 3 h hydrolysis time. FTIR spectrum of COS shows that
its structure did not change to compare to chitosan.

iii


MỤC LỤC

Trang

TÓM TẮT ........................................................................................................................ii
ABSTRACT ................................................................................................................... iii
MỤC LỤC……………………………………………………………………………...iv
DANH S CH C C CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................vi
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................vii
DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................... viii

THÔNG TIN Ề TÀI ...................................................................................................... 1
MỞ ẦU .......................................................................................................................... 2
C

: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4

1.1. Tổng quan về chitosan, chitooligosaccharide ........................................................ 4
1.1.1. Chitosan .................................................................................................................. 4
1.1.1.1.

L

1.1.1.2.

C u trúc chitosan ............................................................................................. 4

1.1.1.3.

deacetyl hóa c a chitosan .......................................................................... 6

c sử nghiên c u chitosan .......................................................................... 4

1.1.2. Chitooligosaccharide .............................................................................................. 6
1.1.2.1.

Gi i thi u về chitooligosaccharide .................................................................. 6

1.1.2.2.

C


1.1.2.3.

Th y phân chitosan thành chitooligosaccharide b ng enzyme cellulase ...... 10

n chitooligosaccharide t chitosan ......................... 8

1.2. M t số ng d ng c a chitosan, chitooligosaccharide .......................................... 12
1.3. Những nghiên c
C
2.1. Th

c ............................................................... 16

: N I DUNG NGHI N CỨU ........................................................................ 20
m nghiên c u ........................................................................... 20

2.2. V t li u nghiên c u ................................................................................................. 20
. . . ố

ng nghiên c u........................................................................................... 20

iv


2.2.3. Thiết b thí nghi m ............................................................................................... 21
2.3. N i dung nghiên c u ............................................................................................ 21
2.3.1. N i dung 1: Nghiên c
. . . .T


n COS ................................................. 21

: K o sát

ng c a ho

cellulase thích h p cho th y

phân chitosan .................................................................................................................. 21
2.3.1.2. T

:K

ều ki n nhi

2.3.1.3. T

:K

ều ki n pH thích h p cho th y phân chitosan ......... 23

2.3.1.4. T

: K o sát th i gian thích h p cho th y phân chitosan ............... 24

C

thích h p cho th y phân chitosan . 22

: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 30


3.1.1. Kh o sát

ng c a ho

cellulase thích h p cho th y phân chitosan ..... 30

3.1.2. Kh

ều ki n nhi

3.1.3. Kh

ều ki n pH cho th y phân chitosan .................................................... 32

3.1.4. Kh o sát th i gian tố

cho th y phân chitosan ............................ 31

y phân chitosan c a cellulose ................................. 33

3.2. Tố

thu nh n COS ................................................ 35

3.3.

n ph m COS ...................................................................... 38

3.3.1. X

3.3.2. X

deacetyl hóa b
nh khố

...................................... 38

ng phân tử c a COS b ng sắc ký gel GPC (Gel Permeation

chromatography) ............................................................................................................ 40
C

: KẾT LUẬN VÀ Ề NGHỊ .......................................................................... 51

4.1. Kết lu n ................................................................................................................ 51
4.2. Kiến ngh . ............................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 52
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 56
X

LÝ SỐ LIỆU ........................................................................................................... 72

v


DANH SÁCH CÁC CH
VI T TẮT
cs
COS
FTIR

GPC
UV - VIS
DD
MW
NMR

VI T TẮT

THU T NG
C
Chitooligosacchride
Fourrier Transformation InfraRed –
Gel Permeation chromatography – ắ ý
Ultraviolet–visible spectroscopy – quang
VIS
Degree of deacetylation –
Molecular weight – ố
ử
Nuclear magnetic resonance – ổ

vi

ổ ồ
ổ ử

FTIR
ế UV -


DANH SÁCH BẢNG

S

T

ả

H
1.1

u

Trang

ồ

Ying và cs,
7

2010)
T

2.1

s

ồ
21

phân chitosan


2.2

T

ề

2.3

T

ề

2.4

T

24

2.5

T

26

3.1

H

30


3.2

Ả

ề

3.3

Ả

ề

3.4

L

22
H

23

31
H

ắ

ử

gian


Ả

33
H

3.5

ế

ồ
35

COS
H

3.6

ồ

3.7

Kế

ố

ế

K ố

ố


ồ

ế
COS

36

ANOVA

37

COS

38

3.8
3.9

32

ử

COS

vii

39



DANH SÁCH HÌNH
S

T

1.1

C

1.2

S

1.3

C

3.1

H

3.2

Ả

3.3

ả

Trang


C
ồ

5

COS

Jeon và Kim (2000)

ế

10
11

ắ

khác nhau
ề

Ả

30
32

H

ắ

33


3.4

H

ử

3.5

P ổ FTIR

COS

ữ

3.6

P ổ FTIR

COS

ữ

3.7

P ổ FTIR

COS

ữ


3.8

Ả

3.9

K

COS ố

Sclerotium sp

46

3.10

K

COS ố

Fusarium sp

47

3.11

Q

3.12


S

34
42
H

43
44

ế

COS

COS

cellulase

COS

45

ẻ

48
50

viii



THÔNG TIN
1. Tên ề

TÀI

:“N
.

.C

ề

.C

: KS. N
:T

.T
.M

T

N
:

.K

H
P


: 155.015.000 ồ

C

.

:
ẻ
.
ề

Q
B

N

– 12/2015

S
.S

L

:
.

ọ .

1


ế


MỞ ẦU
ế

Chitin (poly Nù

ế

ỏ

ỏ

. . ..
.
ử

.

C

ọ
K
ố

ế

ố


ế
ề

converting enzyme

angiotensin I

ế
ế

ế
…
K

2005; Tsai và cs
ồ

.H

ế

ố

ế

ố

…
ề


ế

R j

.C

ọ

ử
ố

ọ

ỏ

in vitro

;

in vivo (Quin và cs

ề

ế

.Ở
ề
ố

.

T

ố
ố. C

chitooligosaccharides thì
ố ề

ế

V

ề

COS

ế

ế

ề

ố

.

2


T


V
ồ

ố

ế

ử

ọ

ế

ọ

ĩ
ế

ế

.. . …
ẻ

ữ

ọ

.M


ế

COS . C

ế

ồ

ồ

ố

ố

…T

ế

COS
ữ
R

ố

V

N

ĩ
COS


X

ề
ế

COS
ế

.

ế.

3

.


C ươ

1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổ

qua về chitosan, chitooligosaccharide

1.1.1. Chitosan
Lược sử


1.1.1.1.
L

cứu c tosa

ử

ắ

ữ

ế

8

ọ R
.

ắ
ọ
ế

ế

ế

ù

9


ữ

ĩ

.

ữ

ế

XX

ề

ố
ọ (Thatte, 2004).

T

ề

ọ

.T

ề

.D

ế


ề

ế

ắ

ử

ề

ề
ĩ

ề
1.1.1.2.

:

ế

.V

ọ

ọ

ề

ố


Thatte, 2004).

Cấu trúc c tosan
ỗ

Chitin (C8H13O5N)n

N-acetyglucosamin hay 2 –
.C

acetmino-2-deoxyl-βữ

ọ

ề
ế

ọ
.C

ỏ

ố

ù .

4



Hình 1.1. C

C

C

.C
N- acety
–

ỗ

.C

ọ

D

.K

ử

.N
K

é

ù
ồ


ử

.V
ũ

ề

ề
ọ

ử

.N
– OH

C6 .

ọ
K

ắ

Thomas, 2007; Matsugor và cs, 1998).

5

C3


Nhóm –NH2


ọ

ế

ế
ế

ử

–NH2

ữ

ỗ

(Jae Young Je và Se Kwon Kim, 2006). K

ử

ọ

ế

ố
ộ deacety

ế hóm

ẽ


ố

ử

ử
1.1.1.3.

ọ

.

óa của c tosa
-acetylamido-2-deoxy-D-glucopuranose và nhóm
.

2-amino-2-deoxy-Dế

ý

ọ

ọ

é

ẹ

f


.

ũ

ế

K

ế

DD≥

%

–NH2
ử

ỡ

ử

ế

ử

ử

ữ
ữ


ử

ử

(Sajomsang và cs, 2009).

1.1.2. Chitooligosaccharide
1.1.2.1.

Gớ t

u về c too

osacc ar de
ế

Chitooligosaccharide (COS)
ọ

ử<
ọ

D
.

ọ

ử

COS


ử
.K

ắ

COS

ề

–NH2

.D
COS

ọ nên

ề trong ĩ

ọ

6

ọ

ử

ề
ỹ


ý
.


Tọ

ử

COS

ế

ế

ọ

ế

ế
ọ

ắ

ọ

ố

ử

ề


COS

ù

ổ MALDI-TOF. Yong Chae và cs (2004) n

COS

ế
ố

ố :

COS 8 D

COS

MW <

.C

co-2 và in vivo
ữ

ọ

ử

ế


D

D

.

COS

COS

ế

ế

ề

Matsugor và cs, 1998). Ngoài ra COS

-2 (Seiichi
:

é

ế
ố . COS

gia vào quá trình hình
ồ


ồ

ũ

ố . COS có

ố

ố

ố
ồ

họ
Bả

ề

.

1.1. H

ồ

Ying và cs, 2010)

Cây trồ

Loạ


K ả ă

T

B

76,49 – 87,5

Sâm

B

>90

Cà chua

B

Tiêu

B

78,58 – 90

Cà tím

B

93,18 – 100


C

B

ố ữ

B

ố

ố

ắ

B

ắ
ũ

é

B

D

B

k ểm sốt

84,47 –88,24


Ew

.

78,62 – 85
63,60 – 64,2

B

D

tham

31,13 – 58,8
ố

B

81,71 – 85,40

ắ

71,34 – 86,26

7

(%)



Táo

B

76,68 – 93,85

B

75,10 – 100

Cây bông

B

é

Ngô

B

23,90 – 45,35

Lúa

B

71,41 – 92

B


23,90 – 26,5

Các p ươ

1.1.2.2.
H

85,50 – 87,2

p áp t u

ậ c too

ề

osacc ar de từ c tosa

COS

P

:

ọ : Dù

HC , HNO2, acid phosphoric

H3PO4 (Hasegawa và cs, 1993), acid hydrofloric (Defaye và cs, 1994).
P


: Dù

P

Gomes và cs, 2014).

ọ : Dù
 P ươ

C

C

p áp óa ọc

T

ử
ử

ề

HC

I

.N
R

V


9
ữ

.A

ắ

ế

ữ

ử

.T
COS
 P ươ

ế
K

Rajapaks, 2005; Xia và cs, 2008).

p áp c

u ạ

C

ắ


ế

ử

.C ế

ử
ề

ử

. Tù

Sionkowska và cs
ọ

ọ

.

ế

.T

ế

ố
ữ


ế .C

8

ề

ế
ố


.C

ế
ổ ồ

ố. N

ổ

C-O-C

 Phươ

p áp s

ế

.

ọc


T

:

ế D-D glycosidic

ắ

ữ

.C

ề

.H

loài v

c vào
ế D-D glucosidic (Xia và cs,

2008).
T

:

ắ

ử


ử
. T
ù

ử

ử

K

ọ

Rajapaks, 2005; Xia và cs,

2008).
Dùng bể phản ứng:
ử

G

COS
é

ta sử
ỡ

ế

.I

%

45oC, pH 5 t

98

ố

DD 89% ử

ố

Bacillus pumilus BN-262 là

.V
%

ề

99
ề

o

H

C ử

Bacillus sp (Xia và cs, 2008).
Dùng cột phản ứng:

COS

T

ố
n

.T

ữ

COS
ố

9


ề

H

ổ

–

o

ề

C. Tuy nhiên,


ế

(Kim, Rajapaks,

2005; Xia và cs, 2008).
Dùng bình phản ứng kết hợp màng siêu lọc:
COS

S

ồ

ố

ọ .C
. Hỗ
COS

ọ

ù

ọ .T

ọ
J

K


ử

ọ

.M

%

M
N HCO3. S
ọ

H ế
ọ UF

ác nhau 10 kDa, 5 kDa, 3 kDa và 1 kDa (Kim, Rajapaks, 2005;

, 2008; Xie và cs, 2009).

Hình 1.2. S
1.1.2.3.

ề
ỗ

ử

Xia

ọ .


ồ

COS

T ủy p â c tosa t à

J
c too

 Enzyme cellulase

10

osacc ar de ằ

K

(2000)

e zyme ce u ase


C

ắ
ử
ồ

glucanase


ố

ế β-1,4-O.C

ề
hay

ố

ế
carboxymethyl

cellulase

β-G

-β-1,4-

(CMCase),

exo-β-1,4-glucanase

β-D-

hay

. Mỗ

ế


ố
(Yu Xie và cs, 2010).

H

ế
ồ

.
ố

ề

ồ

D-

ế

ế β-1,4-

C2

. Ở

ế
ữ

enzyme –


–NH2 và nhóm –OH

C2

(Lin và cs, 2008).

Hình 1.3. C

ế

B

ố

ế
ế

ỡ

ế

ử

ù

. C

ế
:


ỡ

ề

.E

11

ẽ ắ

ỗ


–

.

C

β –

ẽ

ắ

rasaccharide hay disaccharide thành

monosaccharide.
C


ử

ế. T

ử

2

COS

– 6 và có ọ

ử

D

. Qin và Du (2002), Qin và cs
ế

8

ử
COS

Trichoderma viride và Trichoderma ressei

ố

.H


ế
K

998

Trichoderma viride và Trichoderma ressei ũ
ề
COS
1.2.

Một s ứ
C

ế
dụ

COS

ọ

ử

8% (Xia và cs, 2008).

của chitosan, chitooligosaccharide

COS

ọ

.C

ế

ọ
ề

.T

COS
 Ứ

ề
dụ

c tosa , COS tro

ọ .

ảo quả t ực p ẩm

S

.

D

COS
.Ả


ọ
ố

K

ế

ử

ử

ồ

T

ọ
ọ

ử

.

12

ử

D
ế



Cũ

ố

COS

ế

R

tính kháng oxy
D

8

ố COS

ọ

ử8

ử

:
ọ COS

ọ COS.
D

COS ũ

: COS

ọ

ố

ý

ử

ử
Penicillium digitatum, Penicillium
ề

italicum, Botrydiplodia lecanidion, Botrytis cinerea
.
N

ử

kháng oxy hóa. Màng f
ế
ữ
ố
ỞM

Aider, 2010).
ắ

ỏ


.T
ắ

ử
ế

ắ

. Kế

và
.V

COS
8

Aspergillus

ế COS

ũ

ù

ế

ế
ố


ề ử

(Siripatrawan và Harte, 2010).
 Ứ

dụ

ố
ắ

(Kostenyuk và cs, 2002).
C

COS

của c tosa , COS tro

13

t ực p ẩm c ức ă


T

ữ

ỡ
ỏ

ố


.T

iotics, prebiotics và biogenics. COS
ề

.

P

ữ
ố

ỏ . T

N ử

.
COS

f

v

ồ

–

f


COS

ố

ồ

L. casei và L. brevis (Park và cs, 2011).
T

ọ
.J

K

99

in vivo
ù

alci
 Ứ

dụ

COS

MW

của c tosa , COS tro


y ọc và s

ọ
COS

ổ
ổ

ố

.V

ế

ố

ồ

.H

ế
ố

COS

.H
õ

(Choi và cs, 2011).


COS
ề

COS. S

ế

.T

ỏ

N

ọc
ế

ế

COS

.

ố

9%
COS
ố

.B


14

ố

%


õ

9%

ố

.

C
ẳ

ố

COS.

COS kích

Bifido bactieria
ỏ

ố

.N


ế Bifido bactieria
.C
ỏ COS

(Borel và cs, 2006).
T

ù
ố

COS

c

ế

ế

. COS

ỏ

.M

ố
ỏ

ace


ắ

ẽ

ỏ

. COS

ắ

ữ
ồ
ữ

ồ

ố

.V

ồ

COS

ố

(Hwang và cs, 2009).
COS

ế


ề

ế
ố

.N

COS

ù

ố

ế

ế

(Shen và cs, 2009).

H

COS
.T

nhà nghiên c
8

p


COS

ọ

Y

ử

–J

ề
J

ế

ố

.H
COS

ề

15

ế

ố:


ử


ố

K

ý

ọ

ế

Số

.
COS.

ế

ế

. COS

ổ

ổ
ế

ế.N

COS


ế DNA
ỏ

ố

.V
é

(Kim và Rajapakse, 2005).

N ữ
N

RNA

ỏ

ế
cứu tro

 Tro

ổ

ử

ử
1.3.


ế

và

oà

ước

ước
999

N

A

Dũ

N

Tế T ắ

%

oligoglucosamine có dp=8-

ọ .
N

Q ố Hế


ế

ế

ồ
ồ
ử ý

ố

ế

ố

ế

ẽ

ử ý

8

.T

9

ố

88%


%

ố

. Sử

ổ

... ẽ

ử
ố

Lactobacillus
...

E. coli
.N

ử

ẽ
ọ

ổ

...

16


ọ

ế
ử


N

A

Dũ

ế
.
P

T

L H

ồ

N

Q ố Hế

è
A

Ng


ế

Dũ

Võ T

.

P

K
ế

Fusarium oxysporum
. Kế

là salicyden-

ố ồ

ế ố

%
P

T

ế


Hồ

-COS

MIC

-0,03%.

8

COS
ử

-COS
.

Võ T

M

H

T

T

K

C
ố


C

L

.T

COS
ố

ồ

COS

. Số

-

ố

ọ

9

ồ

ố

...


ố

COS

ũ

ố

.

ổ

ồ

COS

ử ý COS. C
-

.Ở

ử ý COS ề
COS

ồ

ố

COS ồ
 N oà

T ế

ố

8-

ũ

%. N

8

ử ý

%.
ước
ế

ế

ế C

–C
8 9

ữ
R

17


ế
C

XIX