BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC VĂN LANG
====

Đề tài:

KỸ THUẬT ĐƠNG LẠNH
TINH TRÙNG
Nhóm: 03
Lớp: K20S2, Khoa CNSH
GVHD: ThS.Trần Thị Minh
Năm học: 2016-2017

Thành viên


Nguyễn Ngọc Anh Thư
Huỳnh Yến Phượng
Trần Thị Hồng Đào
Phạm Tuấn Anh
Trần Nguyễn Quỳnh Như
Hồ Thị Xuân Viên
Trương Thị Ngọc Anh
Lê Thị Thùy Anh
Phạm Hoàng Tố Quyên


Nợi dung
I. Khái niệm - Mục đích..................................................................................................4
II.

Đặc điểm sinh học của tinh trùng.............................................................................5

III.

Bảo quản tinh trùng..................................................................................................6

Bước 1: Chuẩn bị tinh trùng...........................................................................................6
Phương pháp Swim Up.........................................................................................6
Phương pháp gradient nồng độ.............................................................................8
Bước 2: đông lạnh tinh trùng........................................................................................10
Môi trường đông lạnh.........................................................................................10
Cách 1: Hạ nhiệt độ chậm..........................................................................................11
Cách 2: Phương pháp thủy tinh hóa...........................................................................14
IV.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của đông lạnh tinh trùng....................15

V. Một số thành công của phương pháp đông lạnh tinh trùng.....................................15


KỸ THUẬT ĐƠNG LẠNH TINH TRÙNG
I.

Khái niệm - Mục đích

1. Khái niệm:
Đông lạnh tinh trùng là kỹ thuật bảo quản tinh trùng ở nhiệt đợ cực thấp để có thể lưu trữ
tinh trùng trong mợt thời gian dài.
2. Mục đích:
- Động vật: nhằm lai tạo đàn giống với năng suất cao hơn cũng như lưu trữ và bảo tồn lâu

dài nguồn gen quí hiếm.
- Người: lưu trữ khả năng sinh sản trong 1 thời gian dài.
3. Đối tượng nào cần được đông lạnh tinh trùng?
- Những bệnh nhân ung thư có thể quyết định trữ lạnh tinh trùng trước khi bắt đầu điều trị
bệnh vì họ sẽ phải xạ trị, hóa trị. Tất cả nam giới được chuẩn đốn ung thư tinh hồn đều
được khun đi trữ tinh trùng vì trước khi điều trị bệnh nhân đã có lượng tinh trùng ít hơn
bình thường, hóa trị, xạ trị ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh sản của bệnh nhân.
- Người đàn ơng muốn triệt sản có thể lấy tinh trùng ra để bảo quản phịng khi muốn có
con sau này.
- Trữ lạnh cho vợ điều trị hiếm muộn. Trữ lạnh tinh trùng sẽ được chỉ định để tránh
trường hợp vợ đã chọc hút noãn hay đã chuẩn bị noãn mà khơng có tinh trùng để sử dụng.
- Người làm cơng việc liên quan đến mơi trường đợc hại có thể ảnh hưởng đến chất lượng
tinh trùng. Hiện nay tình trạng ô nhiễm môi trường, thực phẩm bẩn và lối sống không
lành mạnh cũng ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng sinh sản.
- Các trường hợp hiến tinh trùng sẽ được trữ lạnh trong ngân hàng tinh trùng để cung cấp
cho những trường hợp có nhu cầu xin tinh trùng.
4. Điều kiện để được đông lạnh tinh trùng?
Theo quy định, người cung cấp mẫu tinh trùng để đông lạnh phải dưới 40 tuổi, gia đình 3
đời khơng mắc bệnh di truyền. Anh ta phải được xét nghiệm HIV, viêm gan, giang mai,
đặc biệt là xét nghiệm nhiễm sắc thể. Trên nguyên tắc, mỗi người chỉ được hiến một lần
và đảm bảo giữ kín thơng tin cá nhân.


II.

Đặc điểm sinh học của tinh trùng

Tinh trùng dài khoảng 50 - 60 µm và có 3 phần: đầu, thân và đuôi.

Đầu tinh trùng

Giống như giọt nước dẹt. Đầu tinh trùng chứa nhân. Nhân chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bợi
gồm 23 nhiễm sắc thể trong đó có 1 nhiễm sắc thể giới tính (X hoặc Y). Khoảng 2/3 đầu
tinh trùng được bao phủ bởi thể cực đầu. Thể cực đầu chứa nhiều enzyme như
hyaluronidase, neuramidase và các proterase khác, các enzyme này có tác dụng tiêu hủy
các chướng ngại vật xung quanh trứng và lớp màng ngoài của trứng để tinh trùng xâm
nhập vào bên trong trứng và thụ tinh trứng.
Thân tinh trùng
Thân tinh trùng chứa nhiều ti thể thực hiện chức năng chuyển hóa để cung cấp ATP cho
sự vận động của tinh trùng.
Đuôi tinh trùng
Đuôi vận động giúp đẩy tinh trùng tiến về phía trước. Đi mỏng và thon dần giúp cho
tinh trùng có thể quẫy đi và di chuyển được thuận lợi.
- Sức sống của tinh trùng phụ thuộc áp suất thẩm thấu, độ pH, nhiệt đợ, ánh sáng và các
chất hóa học có trong tinh dịch. Là cơ sở để chế ra dung dịch bảo tồn có thành phần và
điểu kiện tương tự như tinh dịch


III.

Bảo quản tinh trùng

Bước 1: Chuẩn bị tinh trùng
Chuẩn bị tinh trùng là dùng các biện pháp kỹ thuật để tách tinh trùng ra khỏi tinh dịch, là
kỹ thuật dùng để thu nhận được tinh trùng có chất lượng tốt.
Tại sao phải tách tinh trùng ra khỏi tinh dịch?
Phần tinh dịch có chức năng trung hịa và bảo vệ tinh trùng khỏi môi trường acid của âm
đạo, ổn định và nuôi dưỡng tinh trùng. Tuy nhiên người ta thấy rằng nó cũng có những
ảnh hưởng xấu tới khả năng thụ tinh của tinh trùng, như làm giảm sức sống, độ di đợng
của tinh trùng, tinh dịch cịn chứa chất ngăn chặn sự hoạt hóa của đầu tinh trùng, chứa
các loại vi khuẩn gây bệnh thường trú trong đường sinh dục nam ...

Thông thường tinh trùng được chuẩn bị bằng 2 phương pháp là swim up và gradient.
 Phương pháp Swim Up

o Nguyên tắc: Chỉ những tinh trùng di động tốt sẽ tự bơi lên trên thốt khỏi lớp tinh
dịch phía dưới.


o Điều kiện thực hiện:
+ Mẫu tinh trùng di động tốt.
+ Độ nhớt không cao.
o Môi trường sử dụng: Ferticult Flushing
o Phương pháp thực hiện:
+ Cho vào ống nghiệm 1,5ml môi trường cấy.
+ Cho 1ml tinh dịch thật nhẹ nhàng xuống dưới đáy lớp môi trường.
+ Đặt ống nghiệm trong tủ cấy 45 - 60 phút, nghiêng 45 để tăng bề mặt tiếp xúc giữa lớp
tinh dịch và môi trường nuôi cấy.
+ Dùng Pipette pasteur hút khoảng 0,7-1ml môi trường trên, cho vào ống nghiệm 5ml đã
có sẵn 2ml mơi trường ni cấy, trợn đều.
+ Đem ly tâm 1200 vịng/phút trong 10 phút.
+ Hút bỏ phần mơi trường phía trên, chừa lại 0,3-0,4ml cặn.
+ Trộn đều phần cặn, lấy 1 giọt cho vào buồng đếm kiểm tra mật độ và đợ di đợng.
+ Phần cịn lại có thể sẵn sàng thực hiện kỹ thuật.
o Ưu điểm:
+ Đơn giản, dễ làm, rẻ tiền
+ Tinh trùng thu được có chất lượng cao (>90% tinh trùng di đợng).
+ Tinh trùng có tỷ lệ hình dạng bình thường cao, ít lẫn chất cặn và tế bào khác.
Nhựơc điểm.
+ Chỉ áp dụng được với những mẫu tinh trùng tương đối tốt.
+ Không thu được hết số tinh trùng di động.
 Phương pháp gradient nồng độ

- Là phương pháp dùng để tách tinh trùng có khả năng di động ra khỏi tinh dịch và cặn tế
bào dựa trên khả năng lọc qua các thang nồng độ khác nhau.
- Trong phương pháp này, tinh dịch được ly tâm trên thang nồng độ chứa các hạt silica
dạng keo, chính các hạt này giúp phân tách các tinh trùng dựa trên tỉ trọng của chúng.


O Điều kiện:
+ Thực hiện được với các mẫu tinh trùng yếu
+ Độ nhớt cao

o

Phương pháp:

- Pha các dung môi percoll đẳng trương 40% và 80%.
- Cho 2 lớp dung môi percoll 40% và 80% vào ống nghiệm: mỗi lớp 1.5ml, lớp 80% ở
dưới.
- Cho khoảng 1,5ml tinh dịch lên trên 2 lớp percoll thật nhẹ nhàng.
- Ly tâm 1500 vịng/ 1’ trong 15 phút. Tinh trùng bình thường có tỷ trọng lớn sẽ tập trung
dưới đáy ống nghiệm. Các tinh trùng chết, dị dạng, di động kém và các thành phần trong
tinh dịch có tỷ trọng nhỏ hơn sẽ ở trên.
+ Thu cặn và rửa tinh trùng.


Cách rửa tta

- Cặn thu được cho vào ống nghiệm mới chứa 2ml mơi trường.
- Ly tâm 1000 vịng/1’.
- Hút bỏ lớp môi trường ở trên, trộn lại với môi trường mới.
- Rửa 2 lần với môi trường cấy để loại bớt percoll.

-

Ưu điểm:

+ Đơn giản, dễ thực hiện.
+ Thực hiện được với những mẫu tinh trùng yếu.
o Nhược điểm:
+ Tinh trùng thu được yếu so với tinh trùng trong phương pháp Swim up
Bước 2: đông lạnh tinh trùng
 Môi trường đông lạnh
Thành phần môi trường bảo quản bao gồm:
- Đường: cung cấp chất dinh dưỡng cho tinh trùng sống và vận động, bảo vệ màng tinh
trùng, tránh hiện tượng tinh trùng bị tụ dính. Có thể dủng đường glusoce, fructose,
sacarose…
- Muối: duy trì áp suất thẩm thấu cho tinh trùng và có tác dụng đệm để ổn định pH môi
trường. Thường dùng muối natricitrat, natrikalitartrat... Muối Trilon B (EDTA-B2) dùng
để bảo tồn tinh dịch lợn ở 0C
- Chất kháng sinh: vi sinh vật phát triển rất nhanh trong tinh dịch làm thay đổi đặc điểm
lý hóa mơi trường sống của tinh trùng và cướp chất dinh dưỡng làm tinh trùng bị chết
nhanh chóng. Bổ sung chất kháng sinh vào mơi trường là cần thiết. Tuy nhiên chất kháng
sinh đó về định tính, định lượng phải vơ hại với tinh trùng. Người ta thường bổ sung các
chất kháng sinh như penicillin, streptomycin, tetracyline...
- Chất chống đông lạnh: ở nhiệt độ thấp, q trình sống và vận đợng, trao đổi chất của
tinh trùng bị ức chế nên kéo dài được thời gian sống của tinh trùng ngoài cơ thể. Song


nhiệt độ thấp dễ làm tinh trùng bị sốc. Để bảo tồn tinh dịch cần bổ sung chất chống lạnh
vào mơi trường
+ Lịng đỏ trứng gà: chứa nhiều lecitine (7%) là 1 lipit có tác dụng bảo vệ tinh trùng,
chống lại hiện tượng sốc lạnh, làm tăng độ nhớt, độ dinh dưỡng cho mơi trường. Lecitine

có khả năng chống lạnh cho tinh trùng là do cấu trúc phần tử của nó có 1 phần ưa nước
và 1 phần kị nước, phần ưa nước bị hydrat hóa, phần kỵ nước khơng bị hydrat hóa và liên
kết với nhau tạo thành 1 hệ lưới vi thể trong dung dịch làm giảm hệ số tăng nhiệt trong
mơi trường. Do đó mà tinh trùng đỡ bị sốc nhiệt
+ Glycerin: sự có mặt của glycerin làm hệ số truyền nhiệt bị giảm đi nhiều. Glycerin
còn có tác dụng bảo vệ màng tế bào, ngăn ngừa hiện tượng mất nước, giúp tế bào tránh
hiện tượng hóa đá trong điều kiện lạnh sâu
Môi trường đông tinh thường hay dùng là Sperm freeze. Đây là một chất bảo quản đơng
lạnh có nồng đợ cao, được sử dụng để hạn chế những ảnh hưởng của quá trình làm lạnh
lên tế bào. Sperm freeze có khả năng tan trong nước, tạo liên kết hydro với phân tử nước
và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào thay thế cho nước bên trong tế bào, giúp
làm giảm hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào và giảm tổn thương gây nên bởi
tinh thể nước đá.
 Có 2 cách đông lạnh tinh trùng
Cách 1: Hạ nhiệt độ chậm
Đông lạnh tinh trùng trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196C. Ở nhiệt độ này, tế bào tinh trùng
sẽ bị ngưng họat động – “chết giả” – và tất cả họat động chủ yếu là tạm dừng cho đến khi
rã đông. Sau rã đông, tinh trùng sẽ được “hồi sinh” – quay trở về trạng thái trước khi trữ.
Trữ lạnh tinh trùng không làm thay đổi hay thiệt hại về mặt di truyền.


1. Đánh giá mẫu tinh dịch
- Tinh trùng thu được được đặt trong tủ ấm để mẫu ly giải, thông thường khoảng 30 phút.
- Mẫu tinh trùng được kiểm tra cẩn thận trong phịng lab với điều kiện vơ trùng. Mẫu đạt
chuẩn có thể đơng tinh sẽ được thơng báo cho chủ nhân để hoàn thiện hồ sơ trước khi đặt
vào bình bảo quản.  
2. Bổ sung mơi trường đơng tinh
Cho từng giọt môi trường vào tinh dịch với tỉ lệ 1:1. Cẩn thận nghiêng ống tinh dịch mỗi
lần nhỏ môi trường. Đóng nắp thật chặt và lắc đều 20 lần, khơng để tạo bọt.
3. Để ở nhiệt độ phịng

4.
Đánh số, tên người đông lạnh tinh trùng vào cryotube. Sau khi tạo thành hỗn dịch đồng
nhất, hỗn dịch này được cho vào cryotube
5. Đông lạnh
Làm lạnh chậm với nitơ lỏng để tránh hiện tượng sốc nhiệt, giảm sự hình thành tinh thể
bên trong tế bào, giảm tổn thương bào quan. Đặt cryotube thẳng đứng trên 1 tấm xốp, tấm
xốp được để trong bồn nito lỏng, tốc độ làm lạnh khoảng 10 0 C/phút


(nếu sử dụng máy hạ nhiệt đợ tự đợng thì khơng cần thực hiện bước này vì tốc đợ
làm lạnh đã được cài đặt sẵn)
6. Trữ lạnh tinh trùng
Sau khi mẫu được làm lạnh xuống -50C hoặc -80C sẽ được cho vào nitơ lỏng -196C để
trữ lạnh lâu dài.

Đây là mợt mẫu đơng tinh trong bình nito lỏng. Chúng được đánh số, tên cẩn thận.

Mỗi tuýp nhỏ chứa khoảng 1,8 ml tinh trùng. Khi cần để thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong


ống nghiệm, các bác sĩ chỉ cần sử dụng một tuýp nhỏ như vậy. Chi phí mỗi lần thực hiện
kỹ thuật đơng tinh là 1,5 triệu đồng. Phí gia hạn đông tinh hàng năm là 1,5 triệu đồng.

Phương pháp hạ nhiệt đợ chậm có thể dẫn đến hình thành tinh thể nước đá bên trong tế
bào khi hạ nhiệt độ từ -50C đến -150C. Đây chính là nguyên nhân gây vỡ màng trong
suốt hoặc vỡ tế bào. Chính vì vậy mà phương pháp thủy tinh hóa (hạ nhiệt đợ nhanh) dần
thay thế phương pháp này
Cách 2: Phương pháp thủy tinh hóa
- Thủy tinh hóa là q trình làm lạnh tinh trùng với thời gian rất nhanh. Trong suốt quá
trình hạ nhiệt đợ tồn bợ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng

khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh, đặc biệt khơng có sự hình thành tinh thể đá bên
trong mẫu tế bào cũng như mơi trường bên ngồi trong q trình đơng lạnh. Mẫu tinh
trùng được nhúng trực tiếp vào nito lỏng, không qua q trình hạ nhiệt đợ theo từng bước
như trong đơng lạnh chậm. Tốc độ làm lạnh của phương pháp này rất lớn, khoảng 20002500C và sử dụng chất bảo vệ đông lạnh với nồng độ cao hơn chất bảo vệ đông lạnh của
phương pháp hạ nhiệt độ chậm
- Ưu điểm: nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao gấp 4-5 lần so với nồng độ chất bảo vệ
đông lạnh sử dụng trong phương pháp đông lạnh chậm trước đây => giúp cho quá trình
khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn. Kết quả là khơng có sự hình thành tinh thể
đá bên trong tế bào, nhờ đó mà tế bào có thể tránh được những tổn thương màng, bào
quan do tinh thể đá gây ra. Phương pháp này cho tỉ lệ sống sau rã đông cao hơn rất nhiều
so với phương pháp hạ nhiệt đợ chậm
- Nhược: Địi hỏi người thực hiện phải thuần thục chính xác trong kỹ thuật cao
So sánh 2 kĩ thuật
Hạ nhiệt độ chậm
Thủy tinh hóa
Lượng nito cần sử dụng
10 lít
0.5 lít
Thời gian
Khoảng 2 giờ (quá trình
15-20 phút
mất nước cần được diễn ra
từ từ để hạn chế sự hình
thành tinh thể đá. Do đó
thời gian để hồn tất q
trình đơng lạnh có thể kéo
dài gấp 10 lần so với
phương pháp thủy tinh hóa)
Hệ thống hạ nhiệt tự đợng
Cần (Để có thể đảm bảo

Khơng
được tốc độ hạ nhiệt, người
ta cần trang bị hệ thống hạ
nhiệt đợ tự đợng. Chi phí
đầu tư cho hệ thống này rất
cao, chưa kể đến chi phí


Tỷ lệ sống sau rã đơng
IV.

bảo trì và sửa chữa hàng
năm)
Thấp hơn phương pháp
thủy tinh hóa

Cao hơn phương pháp hạ
nhiệt độ chậm

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của đông lạnh tinh trùng

Các yếu tố giúp tinh trùng tồn tại sau khi đông lạnh:
- Chất lượng của tinh trùng:
Số lượng tinh trùng di chuyển tốt trước khi tiến hành đơng lạnh nhiều sẽ làm tăng tỷ lệ
sống sót của tinh trùng.
- Thành phần môi trường:
Gồm chất đệm, chất chống lạnh cho tinh trùng (để tăng khả năng kháng lạnh, hạn chế tối
đa hiện tượng sốc nhiệt)… Nếu pha chế môi trường không phù hợp sẽ làm giảm hoạt lực,
tăng tỷ lệ chết của tinh trùng.
- Nhiệt độ đông lạnh

Việc giảm nhiệt độ sẽ gây ra một số thay đổi và xuất hiện trạng thái hóa băng cả bên
trong lẫn bên ngồi tế bào. Đặc biệt là việc hóa băng bên trong tế bào có thể sẽ làm cho
tinh trùng chết. Do đó, việc điều chỉnh giảm nhiệt đợ mợt cách thích hợp sẽ giúp cho tinh
trùng khơng bị chết
V.

Một số thành công của phương pháp đông lạnh tinh trùng

1. Cậu bé sinh ra từ tinh trùng "già" nhất thế giới
Alex Powell – cha đứa bé – bị mắc bệnh ung thư, cần phải hóa trị. Việc điều trị này có thể
khiến anh bị vơ sinh. Chính vì thế, Alex quyết định sẽ đông lạnh tinh trùng năm 15 tuổi
để có thể có con sau này. 23 năm sau, tinh trùng được “rã đông”, thụ tinh nhân tạo. Bé
trai Xavier Powell được kỷ lục Guinness công nhân là đứa bé ra đời từ tinh trùng nhiều
tuổi nhất thế giới.
2. Chồn chân đen được sinh ra từ tinh trùng đông lạnh
Những con chồn đang bên bờ vực tuyệt chủng được thụ tinh nhân tạo bằng tinh trùng
đông lạnh của hai con đực đã chết.
(hình) Chồn chân đen 2 tuần. Chồn con sinh ngày 21/6/2008, là con của chồn mẹ 2 năm
tuổi và chồn bố đã chết năm 2000. Đông lạnh tinh trùng giúp cho việc bảo tồn và gây
giống các lồi thú có nguy cơ tuyệt chủng.


3. Xây dựng ngân hàng tinh trùng
Nhiều ngân hàng tinh trùng đã được xây dựng, điển hình như ngân hàng tinh trùng Cryos
International ở Đan Mạch. Ngân hàng này đã gửi tinh trùng đến 80 quốc gia và hơn
27.000 em bé đã được sinh ra nhờ những người hiến tặng.