ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM

TRIỆU BÍCH HUỆ

PHÂN TÍCH VAI TRỊ CỦA CÁC YẾU TỐ ĐIỀU HỊA HOẠT
ĐỘNG (CRE) TRÊN VÙNG PROMOTER
CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN LÚA
Ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Tiến Dũng

Thái Nguyên – 2022


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập của
riêng tơi và nhóm nghiên cứu được sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS.
Nguyễn Tiến Dũng. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong luận văn này là
trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Tơi xin
hồn tồn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình.
Thái Nguyên, ngày 08 tháng 1 năm 2022
Học viên

Triệu Bích Huệ

ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân
thành và sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Tiến Dũng đã tận tnh hướng dẫn và dìu
dắt tơi trong suốt q trình nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái
Nguyên và các thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy và tạo điều kiện cho
tôi học tập và thực hiện luận văn.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học
– Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã truyền dạy kiến thức và
kỹ năng cho tơi trong suốt q trình học tập tại trường, tạo điều kiện thuận
lợi để tôi có thể thực hiện tốt luận văn của mình.
Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cùng
tập thể lớp Công nghệ sinh học K27, nhóm sinh viên trong phịng thí nghiệm
Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, những
người đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tơi trong
suốt q trình học tập và hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 08 tháng 1 năm 2022
Học viên

Triệu Bích Huệ


3

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT..............................................v DANH
MỤC

BẢNH.................................................................................................

vi

MỞ

ĐẦU.....................................................................................................................1
1.
Đặt
vấn
...............................................................................................................1

đề

2.
Mục
đích
cứu...............................................................................................2

nghiên

3. Ý nghĩa của luận văn……………………………………………………………...2
3.1 Ý nghĩa khoa học………………………………………………………………..2
3.2 Ý nghĩa thực tễn……………………………………………………….………..3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4

1.1.
Hoa
.................................................................................................................4
1.2.
Gen
kiểm
sốt
q
phấn..................................................4

trình

phát

triển

lúa
của

1.3.
Gen
promoter...................................................................................................5

và

1.3.1.
....................................................................................................................5
1.3.2.
............................................................................................................6


hạt

Gen
Promoter

1.4. Vai trò của yếu tố điều hòa CRE..........................................................................9
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................11
2.1.
Đối
tượng,
phạm
.........................................................................11

vi

nghiên

cứu

2.1.1.
Đối
tượng
cứu......................................................................................11

nghiên

2.1.2.
Phạm
vi
cứu.........................................................................................11


nghiên


4

2.2.
Địa
điểm
và
thời
......................................................................11

gian

nghiên

cứu

2.2.1.
Địa
điểm
nghiên
.......................................................................................11

cứu

2.2.2.
Thời
gian

nghiên
......................................................................................11

cứu

2.3.
Vật
liệu,
hóa
chất,
...............................................................11

thiết

bị

nghiên

cứu

2.3.1.
Vật
liệu
nghiên
.........................................................................................11

cứu

2.3.2.
Hóa

..........................................................................................................12

chất


5

2.3.3. Thiết bị thí nghiệm ..........................................................................................12
2.4. Nội dung nghiên cứu
..........................................................................................13
2.4.1. Nội dung 1: Phân tích trình tự promoter để xác định các yếu tố CRE ...........13
2.4.2. Nội dung 2: Thiết kế vector chuyển gen .........................................................13
2.4.3. Nội dung 3: Chuyển gen vào cây Arabidopsis................................................13
2.5. Phương pháp nghiên
cứu....................................................................................13
2.5.1. Nghiên cứu sàng lọc gen chuyên biệt hạt
phấn...............................................13
2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số.............................................................13
2.5.3. Phương pháp khuyếch đại promoter bằng kỹ thuật PCR................................14
2.5.4. Phương pháp tnh sạch sản phẩm PCR ...........................................................15
2.5.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter
...........................................15
2.5.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
.........................16
2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp
.................................................16
2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid
.....................................................................17
2.5.9. Phương pháp định lượng DNA .......................................................................18
2.5.10. Phương pháp xác định trình tự

......................................................................19
2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS......................................................................19
2.5.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
...............21
2.5.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis
..........................................21
2.5.14. Phương pháp đánh giá hoạt động của
promoter..........................................22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................................24
3.1. Phân tích trình tự promoter để sàng lọc các yếu tố CRE ...................................24
3.2. Biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn..................................................................29
3.3. CRE phổ biến trên vùng promoter RMP1..........................................................30
3.4. Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen RMP1del ::GFP/GUS.......................33


6

3.5. Vai trò của CRE với khả năng biểu hiện của gen RMP1 ở hạt phấn.................34
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................37
4.1. Kết luận ..............................................................................................................37
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................38


7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TỪ VIẾT TẮT

VIẾT ĐẦY ĐỦ


AS

Acetosyringone

ARN pol

RNA polymerases

bp

Base pair

CaMV

Cauliflower mosaic virus

CRE

Cis regulatory element

DNA

Deoxyribonucleic acid

MS

Murashige Skoog

OD


Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

RMP

Rice Microspore pollen Promoter

RMPdel

Rice Microspore pollen Promoter Deletion

RNAi

RNA interference

GFP

Green Fluorescent Protein

kb

Kilo base

TSS

Transcription start site



8

DANH MỤC BẢNH
Bảng 1.1. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất
lợi.............10
Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu....................................................12
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR ................................................................14
Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid...................................................17
Bảng 3.1. Các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP .........................................26
Bảng 3.2. Các yếu tố CRE chuyên biệt mô trên promoter RMP ..............................27
Bảng 3.3. Danh sách các CRE phổ biến trên promoter RMP1 .................................31


vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc mơ phỏng hoa lúa..............................................................................4
Hình 1.2. Cấu trúc gen.....................................................................................................6
Hình 2.1. Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dịng ...................16
Hình 2.2. Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR ..............................20
Hình 2.3. Phương pháp cắt phân đoạn promoter để phân tích CRE .............................21
Hình 3.1. Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến trên promoter RMP.............28
Hình 3.2. Tần số xuất hiện của các yếu tố CRE phổ biến .............................................28
Hình 3.3. Biểu hiện của gen RMP1 ở cơ quan sinh sản bằng phần mềm
RiceEXPro .....................................................................................................................29
Hình 3.4. Mô phỏng biểu hiện của gen RMP1 ở cơ quan sinh sản
bằng phần mềm eFP
......................................................................................................29

Hình 3.5. Tần số xuất hiện các CRE phổ biến (A) và vị trí phân bố của
Pollen1LETAT52 và (B) trên promoter RMP1............................................................32
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng lọc
khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR-RMP1del ::GFP/GUS (A)
và vector chuyển gen pKG7-RMP1del ::GFP/GUS (B) ...............................................34
Hình 3.7. Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR với cặp mồi GUS-F/GUS-R..35
Hình 3.8. Biểu hiện của gen GUS ở cụm hoa cây chuyển gen......................................36



1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Promoter là trình tự nucleotide nằm trước gen phía đầu 5’ tính từ điểm
khởi đầu phiên mã (TSS), đóng vai trị quan trọng trong việc điều khiển hoạt
động phiên mã vì vậy nó được xem như một trong những yếu tố chủ đạo trong
nghiên cứu biểu hiện gen. Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc
promoter theo các hướng điều khiển khác nhau theo mục đích nghiên cứu,
bao gồm: (i) promoter cảm ứng (inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt
động trong điều kiện nhất định; (ii) promoter cơ định (constitutve promoter)
điều khiển gen hoạt động liên tục ở tất cả các mẫu mô; (iii) promoter chuyên
biệt (specific promoter) điều kiển gen hoạt động ở mẫu mơ nhất định. Trong
số các nhóm trên, promoter cơ định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng
phổ biến nhất [6], [10], [43].Tuy nhiên, những promoter này thường tạo ra các
kiểu hình khơng mong muốn do hoạt động khơng định hướng của gen gây ra.
Vì thế, để khắc phục điều này các nhà khoa học có xu hướng sử dụng các
promoter chuyên biệt để điều khiển các gen ở các mơ, bộ phận theo chủ đích
[33].
Hạt phấn là cơ quan sinh sản quan trọng của cây trồng, liên quan trực

tiếp đến năng suất. Đến nay đã có nhiều gen liên quan đến quá trình phát
triển của hạt phấn được xác định và đánh giá ở lúa như OsSCP, OsCP1, OSIPA
[41], [60]. Promoter chuyên biệt hạt phấn có tính ứng dụng cao như: (i) tạo các
dịng bất dục đực phục vụ cho sản xuất hạt lai khi promoter này kết hợp với
một gen gây bất dục như barnase hoặc bất hoạt gen liên quan quá trình trao
đổi chất bằng công nghệ RNAi (RNA interference) [5], [40] (ii) ứng dụng để
kiểm sốt các gen liên quan đến q trình tổng hợp đường, tinh bột, hóc mơn
sinh trưởng nhằm tăng cường sức chống chịu của hạt phấn trong điều kiện bất
lợi như hạn hán, nóng, lạnh, hay các stress mơi trường khác [28]; (iii) ngoài ra
promoter này cũng


2

là công cụ lý tưởng để nghiên cứu chức năng gen, protein liên quan đến quá
trình phát triển hạt phấn ở thực vật [18].
Nhìn chung, các promoter chuyên biệt thường có mặt của các yếu tố điều
khiển hoạt động Cis (Cis Regulatory Elements-CRE) chun biệt cho mơ hay tế
bào. Ví dụ, khi phân tích trình tự promoter chun biệt hạt phấn của gen ở cây
cà chua nhóm nghiên cứu của Twell đã tìm thấy một số yếu tố có vai trị chính
đến hoạt động của promoter như GTGANTG10, POLLEN1LeLAT52 [46]. Các yếu
tố này cũng được tm thấy ở một số promoter chuyên biệt hạt phấn khác như
OsSCP, OSIPA, OsLPS10 và OsLPS11 [1], [20], [26]. Ngồi vai trị của các yếu tố
này, một số nghiên cứu cho thấy các motf mới hay trình tự bảo thủ cũng chi
phối hoạt động chuyên biệt của promoter.
Nhằm cung cấp nguồn vật liệu (promoter) tốt cho các nghiên cứu liên
quan đến hạt phấn, gần đây chúng tôi đã phân lập và đánh giá 20 promoter
chuyên biệt hạt phấn ở giai đoạn sớm (RMP1 đến RMP9) và muộn (OsLPS1
đến OsLPS11) ở cây lúa. Mặc dù các promoter này đã được đánh giá ở cây lúa
và Arabidopsis nhưng cần phải được phân tích chi tiết hơn nữa để xác định vai

trò của các yếu tố CRE, các motf mới hay trình tự bảo thủ chi phối hoạt động
chuyên biệt hạt phấn. Dựa trên phương pháp phân tích đột biến mất đoạn kết
hợp với chuyển gen chúng tôi sẽ tến hành “Phân tích vai trị của các yếu tố
điều hòa hoạt động (CRE) trên vùng promoter chuyên biệt hạt phấn lúa”. Kết
quả nghiên cứu không chỉ xác định được vai trò của các yếu tố CRE mà còn là
cơ sở để tối ưu hóa kích thước promoter, tạo nguồn vật liệu tốt cho các nghiên
cứu chọn tạo giống đáp ứng biến đổi khí hậu ở Việt Nam.
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá vai trị của CRE trên promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa
(Oryza satva L.) nhằm cung cấp các thông tin về promoter chuyên biệt hạt
phấn để phục vụ cho công tác nghiên cứu.


3

3. Ý nghĩa của luận văn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp các dữ liệu khoa học về vai trò các yếu tố CRE đến hoạt động
của promoter chuyên biệt hạt phấn lúa đáp ứng lại điều kiện bất lợi, đặc biệt
là tập trung vào điều kiện khô hạn.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Phân tích vai trị của các yếu tố điều hòa hoạt động (CRE) trên vùng
promoter chuyên biệt hạt phấn lúa (Oryza satva L) góp phần nâng cao hiệu
quả cơng tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất
cao, có khả năng thích ứng với stress của môi trường, phù hợp với điều kiện
canh tác lúa vùng khô hạn và cơ cấu sản xuất lúa chịu stress như nắng nóng,
nhiệt độ cao ở Việt Nam.


4



5

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hoa lúa
Lúa là cây tự thụ phấn, hoa được cấu tạo gồm hai bộ phận chính: cơ
quan sinh sản đực (nhị) và cơ quan sinh sản cái (nhụy). Nhụy hoa bao gồm có
đầu nhụy, chỉ nhụy và noãn. Đầu nhụy làm nhiệm vụ tiếp nhận hạt phấn và kết
nối với nỗn thơng qua ống nhụy. Noãn nằm ở đế hoa sau khi thụ tnh sẽ phát
triển thành hạt.
Cơ quan sinh sản đực bao gồm 6 chỉ (tua nhị) mang 6 bao phấn. Mỗi nhị
gồm 2 phần là chỉ nhị và bao phấn. Ở giai đoạn trưởng thành, hạt phấn được
giải phóng khỏi bao phấn và tiếp xúc với nhụy. Bao phấn gồm 2 phần chứa hạt
phấn được liên kết với nhau bởi vách ngăn. Trước khi hoa nở, nhị và nhụy
được bao bọc bởi vỏ hạt.

Hình 1.1. Cấu trúc mơ phỏng hoa lúa
1.2. Gen kiểm sốt q trình phát triển của hạt phấn
Nghiên cứu đầu tên về biểu hiện gen ở hạt phấn lúa được Parnell
(1921) quan sát khi nhuộm với iod [27]. Tiếp đến là Brink và MacGillivray
(1924) cũng tến hành thí nghiệm tương tự ở hạt phấn ngơ [8]. Q trình
phát triển của hạt


phấn gồm 2 giai đoạn: tiểu bào tử (microspore) và giai đoạn hạt phấn trưởng
thành (pollen). Hầu hết các nghiên cứu sàng lọc gen liên quan cũng được tập
trung ở hai giai đoạn này[33].Cho tới nay có rất nhiều gen liên quan đến quá
trình phát triển của hạt phấn được sàng lọc. Honys và cộng sự (2006) đã xác

định được 3.500 gen biểu hiện ở hạt phấn của cây Arabidopsis. Một số gen đã
được đánh giá như MORI/GEMI, TIO, MSP1, MSP2 và MSP3 [32]. Theo dự
đốn có khoảng 13.977 gen biểu hiện ở hạt phấn cây Arabidopsis [4], [7],
[43]. Trong đó, 11,565 gen biểu hiện ở giai đoạn tiểu bào tử, 7.235 gen biểu
hiện ở giai đoạn hạt phấn trưởng thành. Tỷ lệ gen đặc hiệu ở các giai đoạn
này lần lượt là 6,9 và 8,6% [4].
Ở lúa, Endo và cộng sự (2004) xác định được 259 gen chuyên biệt cho
bao phấn. Mức độ biểu hiện của các gen thay đổi theo từng giai đoạn phát
triển của hạt phấn [13]. Lu và cộng sự (2006) một số nghiên cứu trước đây cho
rằng có 26 gen tăng mức độ biểu hiện ở giai đoạn hình thành nhị hoa [23]. Wei
và cộng sự (2010) chia làm 5 giai đoạn: tiều bào tử đơn nhân, hai nhân, ba
nhân chưa hoàn chỉnh, hoàn chỉnh và giai đoạn hạt phấn nảy mầm [68]. Phân
tích microarray cho thấy có khoảng 22.000 đến 25.062 nhân tố phiên mã được
phát hiện trong quá trình hình thành và phát triển hạt phấn [68]. Trong đó có
khoảng 1.000 gên chuyên biệt hạt phấn được tm thấy, bao gồm 453 gen ở giai
đoạn ba nhân, 184 gene ở giai đoạn đơn nhân, 78 gene ở giai đoạn phân bào
giảm phân và 291 gene ở giai đoạn hạt phấn trưởng thành [33].
1.3. Gen và promoter
1.3.1. Gen
Mendel (1865) là người đầu tiên đưa ra khái niệm nhân tố di truyền.
Johansen (1909) đã đề xuất thuật ngữ gen để chỉ nhân tố di truyền xác định
một tính trạng nào đó. Sau đó, Morgan trong những năm 1920 đã cụ thể hóa
khái niệm về gen, khẳng định nó nằm trên nhiễm sắc thể và chiếm một locus
nhất định, gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng.


Vào những năm 1950, DNA (deoxyribonucleic acid) được chứng minh là
vật chất di truyền. Mơ hình cấu trúc DNA của Watson và Crick được đưa ra và
lý thuyết trung tâm (central dogma) ra đời. Gen được xem là một đoạn DNA
trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một polypeptide hay RNA.

Cuối những năm 1970, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở sinh vật
eukaryote cho thấy có những đoạn DNA khơng mã hóa cho các amino acid
trên phân tử protein. Vì thế, khái niệm về gen một lần nữa được điều chỉnh
như sau: Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide, nó
bao gồm cả phần phía trước là vùng 5’ khơng dịch mã (5’ untranslation) hay
cịn gọi là vùng ngược hướng (upstream) và phía sau là vùng 3’ khơng dịch mã
(3’ untranslaton) hay cịn gọi là vùng cùng hướng (downstream) của vùng mã
hóa cho protein, và bao gồm cả những đoạn khơng mã hóa (intron) xen giữa
các đoạn mã hóa (exon).
Vùng mã hố


Hình 1.2. Cấu trúc gen
1.3.2.
Promoter
Promoter là trình tự nucleotide cần thiết để ARN pol bám vào khởi động
quá trình phiên mã. Trình tự này nằm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã ở
các hệ gen của sinh vật nhân sơ. Trong khi đó promoter ở hệ gen của sinh vật
nhân chuẩn thường gồm vị trí nhận biết bởi ARN pol và các trình tự đặc biệt
nhận biết bởi yếu tố phiên mã [2].
Trình tự cơ bản của promoter (code promoter) thường gồm các
nucleotide ở vị trí -10 đến vài nucleotde sau vị trí khởi đầu phiên mã đối với
gen ở sinh vật nhân sơ hoặc gồm các nucleotde ở vị trí - 40 đến + 20 đối với
gen của sinh vật nhân chuẩn. Hầu hết các trình tự gen sinh vật nhân sơ và nhân
chuẩn đều có chứa một đoạn ngắn giàu A- T gọi là hộp TATA. Hộp TATA thường
ở vị trí - 10 ở promoter sinh vật nhân sơ nhưng phân bố ở vị trí - 25 ở
promoter sinh vật nhân


chuẩn. Khi promoter chỉ có trình tự cơ bản thì mức độ phiên mã xảy ra rất

thấp, tuy nhiên sẽ tăng lên rất nhiều khi có thêm trình tự nằm phía trước trình
tự cơ bản. Trình tự thứ hai này thường nằm ở vị trí - 35 đối với gen sinh vật
nhân sơ, hoặc vị trí - 70 đến - 90 ở gen sinh vật nhân chuẩn [2].
Promoter của gen ở sinh vật nhân chuẩn mã hóa cho protein được nhận
biết bởi ARN pol II khi mà hầu hết các yếu tố phiên mã đã có mặt ở promoter.
Phiên mã ở sinh vật nhân chuẩn cũng địi hỏi các trình tự tăng cường enhancer
đặc thù cho từng gen hoặc nhóm gen, có thể nằm phía trước, sau hoặc ngay
trong gen để tăng cường mức độ phiên mã trên promoter [2].
a. Promoter khơng đặc hiệu
Promoter khơng đặc hiệu hay cịn gọi là promoter cơ định (constitutive
promoter) tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gen ở tất cả hoặc hầu như
tất cả các loại mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển
của sinh vật. CaMV35S promoter điều khiển sự biểu hiện ARN 35S được phân
lập từ virut khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ điển
hình của nhóm promoter này. CaMV là một virus dạng sợi đôi ở thực vật thuộc
họ cải. Hệ gen của virus này là một phân tử DNA vịng sợi kép có kích thước
8kb với ba qng ngắt là sợi đơn, hai bản phiên mã mARN chính (19S và 35S)
và sáu khung đọc mở được mã hóa bởi DNA. Sự phiên mã xảy ra từ tiểu nhiễm
sắc thể vịng và khơng tiếp hợp trong nhân của tế bào thực vật và DNA virion
được tổng hợp trong tế bào chất thông qua sự phiên mã ngược của mARN
35S. CaMV35S promoter là trình tự có kích thước vào khoảng 350 bp nằm ở
phía đầu của mARN
35S ( -343 đến +8, với vị trí Cap ở +1), trong đó khoảng 250 bp gối lên 3% đoạn
kết thúc của gen V1, khung đọc mở cuối cùng trong 6 khung đọc mở lớn. Có 3
vùng trên promoter, promoter trung tâm chứa hộp TATA (vị trí từ - 46 đến +8)
và hai vùng chính khác có chức năng tăng cường. Vùng A (- 90 đến – 46) chủ
yếu cần cho biểu hiện ở rễ và vùng B (- 343 đến – 90) cần cho biểu hiện ở lá
[12]. Tiểu vùng của vùng B (B1 đến B5) có thể được nhận dạng dựa trên những



tương tác khác biệt với những nhân tố phiên mã khác nhau. Tuy nhiên, vùng
B hoàn


chỉnh cho phép biểu hiện đa dạng hơn so với trường hợp kết hợp các tiểu
vùng. Vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây
bệnh của CaMV mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây [12]. Các nghiên
cứu cho thấy việc loại bỏ hộp TATA làm mất khả năng gây nhiễm. Hai vùng tăng
cường tách biệt liên quan đến khả năng gây nhiễm đã được xác định là (- 207
đến – 150) và (- 95 đến – 56). Vùng tăng cường thậm chí có thể hoạt động
theo hướng ngược chiều [24].
b. Promoter đặc hiệu
Promoter đặc hiệu chuyên biệt (specific promoter) với các yếu tố Cis
chuyên biệt điều khiển gen hoạt động ở mẫu mô nhất định. Sự biểu hiện đặc
hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gene giới hạn ở một hoặc một vài mô
(hạn chế về không gian – spatial limitation) hoặc ở một vài giai đoạn phát triển
(đặc hiệu thời gian – temporal limitaton). Cần nhấn mạnh rằng khơng có một
promoter hoàn toàn đặc hiệu: các promoter dường như hoạt động ở một số
mô, trong khi ở một số mô khác không hoặc chỉ hoạt động yếu. Hiện tượng
này được biết đến là sự biểu hiện yếu. Promoter đặc hiệu mô (tissue specific
promoter): Các loại promoter đặc hiệu mô chỉ điều khiển biểu hiện gen ở
những mơ nhất định, ví dụ promoter đặc hiệu rễ [22], promoter đặc hiệu bó
mạch thực vật, promoter đặc hiệu hoa [9], [31], [42], [50]. Thuộc nhóm
promoter này có promoter điều khiển biểu hiện gen mã hóa sucrose synthase.
Sucrose synthase là một trong những enzyme quan trọng tham gia vào mọi
hoạt động sống của tế bào. Ở lúa, người ta đã phát hiện được ba gen cùng mã
hóa cho sucrose synthase (Rsuc1, Rsuc2, Rsuc3) [34]. Tuy nhiên mức độ biểu
hiện của các gen này ở các mơ là khác nhau. Gene Rsuc2 khơng có tính đặc
hiệu mô cao. Gen Rsuc3 đặc hiệu cao ở hạt [34]. Chỉ có gen Rsuc1 biểu hiện
đặc hiệu ở bó mạch, rễ, mầm. Kích thước của gen Rsuc1 là 8167 bp, trong đó

kích thước của vùng 5’ tương đối lớn, chiếm khoảng
3 kb. Promoter của Rsuc1 chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như
hộp
TATA, hộp CCAAT…và các trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gen đặc
hiệu bó mạch như hộp ASL, hộp GAGA.… [34].


c. Promoter cảm ứng
Là promoter cảm ứng với môi trường (environmentally inducible
promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong các điều kiện nhất định. Chẳng
hạn trong các điều kiện cực đoan (stress) như hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá
thấp, oxy hóa cao, nồng độ muối quá cao…các gen chống chịu thường biểu hiện
với tốc độ rất nhanh. Vì vậy vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu trúc
promoter của chúng và các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen
thông qua việc nhận biết và hoạt hóa q trình khởi động phiên mã được đặc
biệt quan tâm [3].
Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc promoter theo các
hướng điều khiển khác nhau tùy mục đích nghiên cứu, bao gồm: (i) promoter
cảm ứng(inducible promoter) chỉ điều khiển gen hoạt động trong điều kiện
nhất định; (ii) promoter cơ định (constitutive promoter) điều khiển gene hoạt
động liên tục ở tất cả các mẫu mô; (iii) promoter chuyên biệt (specific
promoter) điều khiển gen hoạt động ở mẫu mơ nhất định. Trong số các nhóm
trên, promoter cơ định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phổ biến
nhất [6], [10], [44]. Tuy nhiên những promoter này thường tạo ra kiểu hình
khơng mong muốn do hoạt động khơng định hướng của gen gây ra. Vì thế để
khắc phục điều này các nhà khoa học có xu hướng sử dụng các promoter
chuyên biệt để điều khiển các gen ở các mơ, bộ phận theo chủ đích [3].
1.4. Vai trò của yếu tố điều hòa CRE
Yếu tố điều hòa cis định vị trên vùng điều hòa của promoter, là vị trí nhận
biết của yếu tố phiên mã, tham gia điều hòa biểu hiện của gen đáp ứng với các

điều kiện bất lợi [1]. Việc phát hiện ra yếu tố điều hịa cis (cis regulatory
element, CRE) nằm trong trình tự của promoter của gen được coi là một thành
công trong việc giải mã tồn bộ cơ chế điều hịa phiên mã của gen. Rất nhiều
kết quả thu được gần đây đã khẳng định sự tham gia của CRE trong con
đường dẫn truyền tín hiệu điều khiển các q trình sinh học diễn ra trong tế
bào. Nhiều nghiên cứu liên quan đến CRE đã cung cấp những dẫn liệu khá đầy
đủ về chức năng của chúng vào sự phát triển của cây trồng. Một số yếu tố điều
hòa cis quan trọng đã


được tm ra như ABRE cảm ứng với ABA, MYBRS và MYCRS đáp ứng hạn, DRE
và LTRE cảm ứng với nhiệt độ… (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi
Yếu tố điều
hịa cis

Trình tự bảo thủ

Chức năng

ABRE

CCACGTGG

MYBRS

(A/C)ACC(A/T)A(A/C)C

Tham gia vào q trình đáp ứng với
ABA.

Tham gia vào quá trình đáp ứng hạn.

MYCRS

CACATG

Tham gia vào quá trình đáp ứng sớm
với

DRE
LTRE

TACCGACAT
ACCGACA;CCGAAA;
GTCGAC

điều
kiện hạn
Liên quan
đếnvà
sựcảm
đápứng
ứngvới
vớiABA.
điều
kiện mặn, hạn và nhiệt độ thấp.
Yếu tố đáp ứng nhiệt độ thấp, điều
hòa

Đặc trưng của các promoter hoạt động cảm ứng stress là có mang các

yếu tố hoạt hóa cis (cis-acting element) đóng vai trị là vị trí liên kết với nhân tố
phiên mã (được kích hoạt bởi các tín hiệu stress) để điều hòa biểu hiện của các
gen liên quan Các yếu tố hoạt hóa Cis đáp ứng điều kiện stress được chia
thành 3 nhóm, bao gồm (1)nhóm liên quan tới con đường điều hòa phụ thuộc
hormone ABA như yếu tố cis ABRE (chứa motf –T/CACGTGG với trình tự lõi
ACGT), MYCRS (trình tự nhận biết MYC - CANNTG), MYBRS (trình tự nhận biết
MYB – A/TAACCA và C/TAACG/TG)…, (2) nhóm khơng phụ thuộc ABA như yếu
tố cis DRE (có trình tự lõi A/GCCGAC)… và (3) liên quan đến cả hai con đường
trên như yếu tố cis NAC (có chứa trình tự lõi CATGTG), ZFHDRS (chứa một motf
bảo thủ TT/AAATT)...[1].


CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây lúa Oryza satva L. và cây Arabidopsis thaliana.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Đánh giá vai trò của các yếu tố CRE trên promoter chuyên biệt hạt phấn từ
cây lúa Oryza satva L.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Cơng nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2020 đến tháng 6/2021.
2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu thực vật: Giống lúa Oryza sativa L. do Phịng thí nghiệm Sinh
học phân tử - Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại

học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên cung cấp.
- Các vật liệu khác:
Cấu trúc vector tách dòng pDONR201
Hệ thống vector chuyển gen pKGWFS7 mang gen chọn lọc kanamycin.
Mồi sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 2.1)
 Chủng vi khuẩn chuyển gen E.coliDH5α của hãng Invitrogen và vi
khuẩn Agrobacterium do phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Cơng nghệ
Sinh học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
cung cấp.