BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

--------

PHÂN TÍCH AURAMINE O, SUDAN I, SUDAN II TRONG
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP-HPLC SỬ DỤNG
VẬT LIỆU NANOSILICA ĐỂ XỬ LÝ MẪU

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

PHÂN TÍCH AURAMINE O, SUDAN I, SUDAN II TRONG
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP-HPLC SỬ DỤNG
VẬT LIỆU NANOSILICA ĐỂ XỬ LÝ MẪU
Chun ngành: Hóa học phân tích
Mã số: 9 44 01 18

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hà Nội - 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan luận án “Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II

trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để
xử lý mẫu” là cơng trình nghiên cứu độc lập của riêng tơi, dưới sự hướng dẫn
khoa học của PGS TS Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung
thực và chưa từng được người khác công bố trong các cơng trình khác
Tác giả luận án


1

LỜI CẢM ƠN
Luận án được hồn thành tại Bộ mơn Hóa học phân tích, Khoa Hóa
học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
Em xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc đến thầy PGS TS đã
giao đề tài và tận tình hướng dẫn khoa học cho em trong suốt q trình nghiên
cứu và hồn thành Luận án
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô Ban Giám hiệu, Phịng Sau
đại học, Bộ mơn Hóa phân tích, Bộ mơn Hóa lí, Khoa Hóa học trường Đại
học Sư phạm Hà Nội, Ban Giám hiệu, phịng Hành chính – Tổng hợp trường
Đại học Tây Bắc, các thầy cô, đồng nghiệp Bộ mơn Hóa học; Khoa Khoa học
Tự nhiên – Cơng nghệ, trường Đại học Tây Bắc đã tạo điều kiện giúp đỡ em
về thời gian và bố trí, phân cơng, sắp xếp cơng việc trong q trình thực hiện
luận án
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô Bộ môn Hóa phân tích, Khoa
Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy PGS TS Phạm
Tiến Đức đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận án
Tơi xin biết ơn những tình cảm q giá của người thân, bạn bè và đồng
nghiệp đã luôn động viên, chia sẻ, ủng hộ để tơi hồn thành luận án này


2


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
1 Tính cấp thiết và lí do của đề tài...................................................................1
2 Mục đích và nội dung chính của luận án.......................................................2
3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu.......................3
4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án...........................4
5 Bố cục của luận án........................................................................................5
CHƯƠNG 1 -TỔNG QUAN.............................................................................6
1 1 Chất màu tổng hợp.....................................................................................6
1 2 Cơ chế liên kết của chất màu với vật liệu..................................................9
1 3 Auramine O..............................................................................................11
1 3 1 Cấu tạo, tính chất...................................................................................11
1 3 2 Đặc tính sinh học và độc tính................................................................13
1 3 3 Tình hình nghiên cứu Auramine O trong thực phẩm............................15
1 4 Các hợp chất Sudan..................................................................................18
1 4 1 Cấu tạo, tính chất...................................................................................18
1 4 2 Đặc tính sinh học, độc tính của các Sudan............................................20
1 4 3 Tình hình nghiên cứu các hợp chất Sudan............................................21
1 5 Một số vấn đề khi định lượng chất màu bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao...................................................................................................26
1 5 1 Hệ số đối xứng của peak sắc ký............................................................26
1 5 2 Các vấn đề peak sắc ký.........................................................................27
1 5 3 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn và đánh giá đường chuẩn.................29
1 5 4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)....................33
1 5 5 Độ thu hồi mẫu......................................................................................34
1 6 Xử lý mẫu thực phẩm...............................................................................34
1 6 1 Khái quát, phân loại..............................................................................34
1 6 2 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ứng dụng xử lý mẫu....................................36
1 6 3 Xu hướng áp dụng kỹ thuật chuẩn bị mẫu xanh trong phân tích..........37

1 7 Vật liệu nanosilica và ứng dụng trong hấp phụ chất màu........................40


3

1 7 1 Các đặc trưng vật lý, hóa học của vật liệu hấp phụ...............................40
1 7 2 Tính tốn thống kê trong xử lý mẫu và phân tích..................................41
1 7 3 Ứng dụng vật liệu nanosilica chế tạo từ vỏ trấu trong hấp phụ làm giàu
mẫu phân tích..................................................................................................43
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM......................................................................46
2 1 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị......................................................46
2 1 1 Vật liệu, hóa chất...................................................................................46
2 1 2 Dụng cụ, thiết bị....................................................................................48
2 2 Nội dung nghiên cứu................................................................................49
2 2 1 Chuẩn bị mẫu giả...................................................................................49
2 2 2 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng HPLC........52
2 2 3 Nghiên cứu các điều kiện chiết.............................................................55
2 2 4 Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều kiện hấp phụ
tối ưu................................................................................................................59
2 2 5 Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp................................65
2 2 6 Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu...............................................................66
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................73
3-A – ĐỐI VỚI AURAMINE O......................................................................73
3 1 Điều kiện tối ưu phân tích Auramine O bằng HPLC...............................73
3 1 1 Bước sóng..............................................................................................73
3 1 2 Thành phần pha động............................................................................73
3 1 3 pH của dung dịch đệm photphat pha động............................................75
3 1 4 Tỉ lệ thành phần pha động.....................................................................76
3 1 5 Tốc độ pha động....................................................................................77
3 1 6 Khoảng phụ thuộc tuyến tính và xây dựng đường chuẩn......................78

3 1 7 Khảo sát độ lặp lại.................................................................................82
3 2 Điều kiện chiết Auramine O tối ưu từ mẫu thực phẩm............................83
3 2 1 Hỗ trợ quá trình chiết............................................................................83
3 2 2 Dung môi chiết......................................................................................83
3 2 3 Tỉ lệ mẫu và dung môi...........................................................................86


4

3 2 4 Nhiệt độ chiết, thời gian chiết và số lần chiết.......................................87
3 2 5 Độ thu hồi quá trình chiết......................................................................89
3 2 6 Ảnh hưởng của nền mẫu........................................................................90
3 3 Các điều kiện tối ưu hấp phụ AO trên nanosilica chế tạo từ vỏ trấu........92
3 3 1 Cường độ ion của dung dịch hấp phụ....................................................92
3 3 2 pH của dung dịch hấp phụ.....................................................................92
3 3 3 Thời gian cân bằng hấp phụ..................................................................93
3 3 4 Đường hấp phụ đẳng nhiệt....................................................................94
3 3 5 Điều kiện rửa giải AO tối ưu……………………………………… …95
3 4 Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích AO...........................96
3 5 Kết quả phân tích AO trong mẫu thực......................................................97
3 5 1 Các mẫu măng, miến, dưa chua............................................................97
3 5 2 Các mẫu phấn hoa, cá khơ, mì tơm.....................................................102
3-B – ĐỐI VỚI HỖN HỢP SUDAN I VÀ SUDAN II.................................107
3 6 Điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan bằng HPLC.........................107
3 6 1 Bước sóng............................................................................................107
3 6 2 Thành phần pha động..........................................................................107
3 6 3 Tỉ lệ thành phần pha động...................................................................109
3 6 4 Tốc độ pha động..................................................................................109
3 6 5 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn, LOD và LOQ................................110
3 7 Điều kiện chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II tối ưu từ mẫu thực phẩm 113

3 7 1 Dung môi chiết....................................................................................113
3 7 2 Nhiệt độ chiết, thời gian chiết và số lần chiết.....................................114
3 7 3 Tỉ lệ mẫu và dung môi.........................................................................115
3 8 Các điều kiện tối ưu hấp phụ hỗn hợp Sudan trên nanosilica................116
3 8 1 Ảnh hưởng của lực ion của dung dịch hấp phụ...................................116
3 8 2 Ảnh hưởng của pH..............................................................................117
3 8 3 Thời gian cân bằng hấp phụ và ảnh hưởng của nồng độ đầu..............119
3 8 4 Đường hấp phụ đẳng nhiệt..................................................................119


5

3 8 5 Điều kiện rửa giải hỗn hợp Sudan tối ưu……………………………
120
3 9 Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích hỗn hợp Sudan.......121
3 10 Kết quả phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm123
KẾT LUẬN...................................................................................................129
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ.....................................131
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................132
PHỤ LỤC......................................................................................................142
Phụ lục 1: Phổ FT-IR của vật liệu RHNS......................................................142
Phụ lục 2: Phổ EDX của vật liệu RHNS.......................................................142
Phụ lục 3: Đường đẳng nhiệt hấp phụ - giải hấp N2......................................143
Phụ lục 4: Đường phân bố kích thước mao quản..........................................145
Phụ lục 5: Biểu đồ diện tích bề mặt BET......................................................146
Phụ lục 6: Hình ảnh một số mẫu phân tích...................................................147


6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1 1: Một số chất màu phụ gia thực phẩm được phép sử dụng ở Việt Nam
……………………………………………………………………………… 6
Bảng 1 2: Phân loại chất màu tổng hợp theo nhóm mang màu……………… 7
Bảng 1 3: Tóm tắt một số cơng trình nghiên cứu định lượng Auramine O 1

Bảng 1 4: Công thức, tên gọi và danh pháp các loại Sudan ...........................18
Bảng 1 5: Tóm tắt kết quả một số cơng trình nghiên cứu định lượng Sudan
trong thực phẩm ..............................................................................................24
Bảng 1 6: Các giá trị RL ..................................................................................42
Bảng 2 1: Thành phần các mẫu chuẩn bị cho phương pháp phân tích AO ....50
Bảng 2 2: Thành phần các mẫu chuẩn bị cho phương pháp phân tích Sudan 51
Bảng 2 3 Các loại dung mơi lựa chọn cho q trình chiết AO .......................56
Bảng 2 4: Ký hiệu mẫu và thông tin lấy mẫu .................................................67
Bảng 3 1: Sắc ký đồ AO khi thay đổi thành phần pha động ..........................74
Bảng 3 2: Thông số peak AO ứng với tỉ lệ thành phần pha động khác nhau .76
Bảng 3 3: Thông số peak AO ứng với tốc độ pha động khác nhau ................77
Bảng 3 4: Các điều kiện tối ưu phân tích AO bằng HPLC .............................78
Bảng 3 5: Số liệu đường chuẩn AO ................................................................79
Bảng 3 6: Các thông số đường chuẩn dạng Y=a X+b ....................................79
Bảng 3 7: Diện tích peak AO phụ thuộc hàm lượng ......................................81
Bảng 3 8: Phương trình đường chuẩn và các giá trị MDL, MQL của AO......81
Bảng 3 9: Số liệu khảo sát độ lặp lại phép đo AO bằng HPLC… …………82
Bảng 3 10: Độ thu hồi mẫu trung bình ( R %) khi khảo sát phương pháp chiết
.........................................................................................................................83
Bảng 3 11: Hiệu suất chiết AO khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau 84
Bảng 3 12: Hiệu suất chiết AO theo tỉ lệ mẫu và dung môi ...........................86


7


Bảng 3 13: Hiệu suất chiết AO các mẫu MMT phụ thuộc nhiệt độ và thời gian
.........................................................................................................................87
Bảng 3 14: Độ thu hồi AO trên mẫu MAG và MIG .......................................89
Bảng 3 15: Số liệu khảo sát ảnh hưởng nền mẫu đối với phân tích AO .........90
Bảng 3 16: Dữ kiện tính tốn độ khơng đảm bảo đo…………………… …96
Bảng 3 17: Kết quả phân tích mẫu MI1 theo phương pháp đường chuẩn......98
Bảng 3 18: Hàm lượng AO trong các mẫu măng, miến, dưa chua................101
Bảng 3 19: Kết quả phân tích mẫu PH3 theo phương pháp đường thêm chuẩn
.......................................................................................................................105
Bảng 3 20: Kết quả phân tích hàm lượng AO trong các mẫu mì tơm, phấn hoa,
cá khô ...........................................................................................................105
Bảng 3 21: Sắc ký đồ hỗn hợp Sudan với thành phần pha động khác nhau 108
Bảng 3 22: Các tham số của các peak Sudan I và Sudan II trong PĐ5-S ....109
Bảng 3 23: Các điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II bằng
phương pháp HPLC ......................................................................................110
Bảng 3 24: Số liệu đường chuẩn và LOD, LOQ của hỗn hơp 2 Sudan chuẩn
.......................................................................................................................111
Bảng 3 25: Số liệu đường chuẩn và MDL, MQL trên nền mẫu trắng ..........112
Bảng 3 26: Hiệu suất chiết hỗn hợp Sudan phụ thuộc dung môi .................113
Bảng 3 27: Hiệu suất chiết các Sudan phụ thuộc nhiệt độ và thời gian chiết
.......................................................................................................................114
Bảng 3 28: Hiệu suất chiết các Sudan theo tỉ lệ mẫu và dung môi ..............115
Bảng 3 29: Dữ kiện tính tốn độ khơng đảm bảo đo.....................................122
Bảng 3 30: Kết quả định lượng Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm 125
Bảng 3 31: Độ thu hồi các Sudan trên nền mẫu thực………………………125
Bảng 3 32: Hàm lượng Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm khô ban đầu
.......................................................................................................................126



8

DANH MỤC HÌNH
Hình 1 1: Cơng thức cấu tạo của Auramine O ...............................................12
Hình 1 2: Bột Auramine O .............................................................................12
Hình 1 3: Các tính hệ số đối xứng AF ............................................................27
Hình 1 4: Hiện tượng peak chẻ .......................................................................27
Hình 1 5: Các hiện tượng kéo đi peak ........................................................28
Hình 1 6: Hiện tượng peak nở rộng ................................................................29
Hình 1 7: Thiết bị chiết gồm nhiều phễu ........................................................36
Hình 1 8: Một hệ thống chiết liên tục .............................................................37
Hình 1 9: Các trạng thái tồn tại của CO2 (Ben Finney và Mark Jacobs).........38
P
P
f 
 Po  ........................43
Hình 1 10: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc V(Po  P)

Hình 1 11: Hiển vi điện tử quét của các hạt nanosilica tại các tỉ lệ phóng đại
(A) 500nm và (B) 300nm……………………………………………

……44

Hình 2 1: Một số cơng đoạn tạo mẫu giả phân tích AO .................................50
Hình 2 2: Thế Zeta phụ thuộc pH của dung dịch hấp phụ ..............................60
Hình 2 3: Quy trình xử lý mẫu măng, miến, dưa muối chua, thịt khơ ...........71
Hình 2 4: Quy trình xử lý mẫu cá khơ, bim bim, phấn hoa và mì tơm ..........72
Hình 3 1 Phổ hấp thụ của dung dịch AO chuẩn 1000 µg/L ...........................73
Hình 3 2: Sắc ký đồ AO phụ thuộc pH pha động ...........................................76
Hình 3 3: Đường chuẩn AO(1) .......................................................................80

Hình 3 4: Sắc ký đồ AO tại các giá trị nồng độ trong đường chuẩn .............80
Hình 3 5: Đường chuẩn AO(2)........................................................................81
Hình 3 6: Đường chuẩn AO(3)........................................................................81
Hình 3 7: Sự thay đổi hiệu suất chiết AO trung bình theo dung mơi chiết ....84
Hình 3 8: Biểu đồ hiệu suất chiết trung bình của AO phụ thuộc số lần chiết 88


9

Hình 3 9: Ảnh hưởng nồng độ KCl đến sự hấp phụ AO ................................92
Hình 3 10: Ảnh hưởng pH đến sự hấp phụ AO ..............................................93
Hình 3 11: Khảo sát thời gian cân bằng hấp phụ theo nồng độ đầu AO ........94
Hình 3 12: Mơ hình Langmuir tuyến tính của sự hấp phụ AO .......................94
Hình 3 13: Hiệu suất thu hồi AO phụ thuộc thời gian rửa giải………………
95
Hình 3 14: Hiệu suất thu hồi AO phụ thuộc số lần rửa giải…………………
96
Hình 3 15: Sắc đồ của MI1 khi pha loãng 3 lần dịch chiết gốc ......................98
Hình 3 16: Ảnh một số mẫu thực phẩm phân tích AO………………………98
Hình 3 17: Sắc ký đồ MA1 của dịch chiết gốc pha loãng 10 lần ...................99
Hình 3 18: Sắc ký đồ MA2 của dịch chiết gốc pha lỗng 2 lần ...................100
Hình 3 19: Sắc ký đồ MA6 của dịch chiết gốc .............................................100
Hình 3 20: Sắc ký đồ MA6 khi thêm chuẩn AO 90 µg/L .............................100
Hình 3 21: Dung dịch phân tích mẫu phấn hoa PH1 ...................................102
Hình 3 22: Sắc ký đồ mẫu phấn hoa PH1 khi phân tích dung dịch B ..........103
Hình 3 23: Sắc ký đồ phân tích PH1 gốc và PH1 khi thêm chuẩn AO 100 µg/L
.......................................................................................................................103
Hình 3 24: Sắc ký đồ mẫu PH3 gốc (có hấp phụ bằng RHNS) ....................104
Hình 3 25: Sắc đồ mẫu PH3 gốc và thêm chuẩn ..........................................104
Hình 3 26: Phổ hấp thụ của dung dịch các Sudan ........................................107

Hình 3 27: Sắc ký đồ phân tích dung dịch hỗn hợp chuẩn các Sudan ..........110
Hình 3 28: Sắc ký đồ hỗn hợp Sudan I và Sudan II theo nồng độ ................111
Hình 3 29: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Sudan ........................111
Hình 3 30: Đường chuẩn các Sudan trên nền mẫu trắng ..............................112
Hình 3 31: Hiệu suất chiết các Sudan phụ thuộc số lần chiết .......................115
Hình 3 32: Ảnh hưởng của lực ion đến hiệu suất hấp phụ các Sudan ..........116


10

Hình 3 33: Hiệu suất hấp phụ các Sudan khi thay đổi pH của dung dịch ....117
Hình 3 34: Hiệu suất hấp phụ theo nồng độ đầu các Sudan..........................119
Hình 3 35: Đường đẳng nhiệt Langmuir của các Sudan ..............................120
Hình 3 36: Hiệu suất thu hồi các Sudan theo thời gian rửa giải ...................120
Hình 3 37: Hiệu suất thu hồi các Sudan theo số lần rửa giải .......................121
Hình 3 38: Dịch chiết mẫu MBB1 sau xử lý ................................................123
Hình 3 39: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB1...................................126
Hình 3 40: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB2 ..................................127
Hình 3 41: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB4 ..................................127


11

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Tiếng Anh
AAS
Atomic Absorption Spectrometry
ACN
Acetonitril

AO
Auramine O
Association of Official
AOAC
Analytical Chemists
EtOH
Ethanol

Tiếng Việt
Phổ hấp thụ ngun tử
Vàng ơ
Hiệp hội các nhà hố học
phân tích
Cồn
Cục quản lí Thực phẩm và

FDA

Food and Drug Administration

GC

Gas Chromatography
Gas Chromatography/Mass

Dược phẩm Hoa Kỳ
Phương pháp sắc ký khí
Sắc ký khí ghép nối khối

Spectrometry

High-performance liquid

phổ
Sắc ký lỏng cao áp/ Sắc ký

chromatography
International Agency for

lỏng hiệu năng cao
Cơ quan Nghiên cứu Ung

Research on Cancer
Inductively Coupled Plasma
Liquid Chromatography
Liquid Chromatography/Mass

thư Quốc tế
Plasma cao tần cảm ứng
Phương pháp sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng ghép nối khối

LOD
LOQ

Spectrometry
Limit of detection
Limit of quantitation

MDL


Method detection limit

phổ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện của
phương pháp

MeOH

Methanol

MQL

Method quantification limit

PBS

Phosphate buffer solution
Quality Assurance/Quality

phương pháp
Dung dịch đệm phosphate
Đảm bảo chất lượng/kiểm

Control
National Regulation
Recovery (%)
Nanosilica from rice husk


soát chất lượng
Quy chuẩn Việt Nam
Độ thu hồi (%)
Nanosilica từ vỏ trấu

GC/MS
HPLC
IARC
ICP
LC
LC/MS

QA/QC
QCVN
R%
RHNS

Giới hạn định lượng của


12

RSD
RT
SPE
RP
SKPĐ
SKPT
TCVN


Relative standard deviation
Retention Time
Solid Phase Extraction
Reversed Phase
National Standard

Độ lệch chuẩn tương đối
Thời gian lưu của chất
Chiết pha rắn
Pha đảo
Sắc ký pha đảo
Sắc ký pha thường
Tiêu chuẩn Việt Nam


MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết và lí do của đề tài
Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế IARC [49] đã xếp một số chất
màu tổng hợp vào nhóm các chất có thể gây ung thư như: các chất Sudan,
Auramine O, Rhodamine B, Ponceau 3R,… Những chất màu này có ưu điểm
rẻ tiền, bắt màu chuẩn và lên màu nhanh, bền màu, nhưng chúng là những
chất độc có khả năng gây bệnh cho người Thực tế đã có nhiều sản phẩm thực
phẩm trên thị trường bị phát hiện sử dụng phẩm màu không được phép dùng
cho thực phẩm [17, 34, 57,66]
Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - phẩm màu
QCVN 4-10:2010/BYT [4] và Thông tư số 21/2019/TT-BNNPTNT của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về “Hướng dẫn một số điều của luật
chăn nuôi về Thức ăn chăn ni”, có quy định rõ tại phụ lục V: Cấm sử dụng
Auramine O (AO) và các dẫn xuất của Auramine O trong thức ăn chăn nuôi
[3], như vậy AO là chất khơng được phép có mặt trong thực phẩm tại Việt

Nam Mặt khác thông tư 24/2019/TT-BYT ban hành ngày 30 tháng 8 năm
2019 quy định có 57 chất màu được phép sử dụng trong thực phẩm không bao
gồm các Sudan và AO Do đó, một phương pháp phát hiện AO và các chất
Sudan ở lượng siêu vết trong thực phẩm là rất cần thiết Trong các hợp chất
Sudan, thì Sudan I và Sudan II có màu đỏ sáng đẹp mắt, được sử dụng khá
phổ biến trong thực phẩm hơn Sudan III và Sudan do đó đề tài chọn hướng
nghiên cứu hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm
Hiện nay, Việt Nam mới chỉ có duy nhất một phương pháp được chứng
nhận để xác định Auramine O trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là Tiêu
chuẩn quốc gia TCVN 12267:2018 về “Thực phẩm - xác định hàm lượng
Auramine - phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS)”[1], chưa
có phương pháp được chứng nhận để xác định các Sudan trong thực phẩm


TCVN 12267:2018 đã áp dụng một quy trình duy nhất chiết tách AO từ các
nền mẫu thực phẩm khác nhau bằng dung mơi hữu cơ, điều này có thể dẫn
đến hiệu suất thu hồi thấp và độ chính xác chưa cao do các mẫu thực phẩm
khác nhau có nền mẫu phức tạp không giống nhau, đồng thời LC-MS/MS là
hệ thống thiết bị phức tạp đắt tiền, không phổ biến trong các phịng thí
nghiệm Ưu điểm của phương pháp HPLC là có thể định lượng đồng thời các
chất màu tương tự nhau, phương pháp phân tích và vận hành đơn giản, thiết bị
sử dụng phổ biến, tuy nhiên khi phân tích HPLC cần phải xử lý làm sạch ảnh
hưởng của nền mẫu Việc sử dụng nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) để hấp phụ
chất màu Rhodamine B và Xanh metylen trong dung dịch nước đã được
nghiên cứu trên thế giới [20,63], ưu điểm của việc sử dụng RHNS so với kỹ
thuật chiết pha rắn (SPE) ở nguồn nguyên liệu nông nghiệp rẻ tiền là trấu, các
bước thực nghiệm đơn giản không cần thiết bị phức tạp, sử dụng chính dung
mơi pha động HPLC để rửa giải chất màu cho hiệu suất hấp phụ- rửa giải cao
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tiến hành hấp phụ chất màu AO và Sudan
từ dịch chiết mẫu thực phẩm

Nhằm tìm kiếm giải pháp chiết, tách phù hợp với từng nền mẫu thực
phẩm khác nhau, đồng thời xây dựng phương pháp định lượng chất màu nhân
tạo độc hại bằng hệ thống thiết bị đơn giản, phù hợp với các điều kiện phịng
thí nghiệm, chúng tơi tiến hành đề tài “Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan
II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica
để xử lý mẫu”
2 Mục đích và nội dung chính của luận án
Mục đích của luận án:
 Xây dựng quy trình phân tích Auramine O trong mẫu thực phẩm:
măng, miến, dưa, phấn hoa, cá khơ, mì tơm


 Xây dựng quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong
mẫu thực phẩm thịt khô và bim bim
Nội dung nghiên cứu chính của luận án:
 Đối với Auramine O:
o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định Auramine O bằng phương
pháp HPLC
o Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Auramine O từ mẫu thực phẩm
phịng thí nghiệm
o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của Auramine O trong dung dịch lên
Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu (kí hiệu RHNS)
o Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Auramine O trong mẫu
thực tế
 Đối với hỗn hợp Sudan I và Sudan II:
o Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định đồng thời Sudan I và Sudan II
bằng phương pháp HPLC
o Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Sudan I và Sudan II từ mẫu thực
phẩm phịng thí nghiệm
o Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của của hỗn hợp Sudan I và Sudan II

trong dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu
o Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Sudan I và Sudan II
trong mẫu thực tế
3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
- Các chất màu Sudan I, Sudan II trong các mẫu thực phẩm: mẫu thịt
khô, mẫu bim bim
- Chất màu Auramine O trong các mẫu: măng, miến, phấn hoa, dưa
chua, cá khơ, mì tơm
Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp chiết lỏng – lỏng mẫu thực phẩm bằng dung môi hữu cơ
- Phương pháp hấp phụ chất màu trên nanosilica


- Phương pháp phân tích HPLC định lượng chất màu, sử dụng detector
mảng Diode Array (PDA)
- Phương pháp phổ hấp phụ phân tử UV-Vis để xác định các bước sóng
hấp phụ cực đại của các dung dịch chất màu
Luận án sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại để đánh giá
xác định các đặc trưng của vật liệu hấp phụ: phổ FTIR, SEM, EDX, BET,…
Sử dụng các phương pháp thống kê để xử lý kết quả, đánh giá số liệu
thực nghiệm
4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án
- Việc kiểm tra chất màu cấm sử dụng trong thực phẩm với các mẫu
ngẫu nhiên tại các phịng thí nghiệm nhỏ ở Việt Nam là ít khả thi, chính vì vậy
với mục tiêu nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích đơn giản RP-HPLC
để đánh giá hàm lượng AO, Sudan I và Sudan II trong một số mẫu thực phẩm
trên thị trường là có ý nghĩa lớn
- Luận án đã đưa ra quy trình chung để phân tích các chất màu
(Auramine O và hỗn hợp Sudan I, Sudan II) trong các mẫu thực phẩm Quy

trình gồm 2 giai đoạn chính là xử lý mẫu và phân tích định lượng mẫu bằng
phương pháp HPLC Giai đoạn xử lý mẫu được thực hiện theo 2 cách với các
loại mẫu khác nhau Cách 1: Chiết bằng dung môi hữu cơ Cách 2: Chiết bằng
dung môi hữu cơ - Hấp phụ chất màu trong dịch chiết bằng Nanosilia chế tạo
từ vỏ trấu - Giải hấp phụ bằng pha động trong phân tích HPLC Đây là quy
trình phân tích chất màu trong thực phẩm chưa được đề xuất trước đó trong
bất kỳ cơng trình nghiên cứu khoa học nào
- Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ được đánh
giá là phương pháp nhanh, đơn giản dễ thực hiện và chi phí thấp Một điểm ý
nghĩa của luận án là đưa ra phương pháp chiết các chất màu bằng dung môi
ethanol (chiết auramine O bằng hỗn hợp ethanol: nước (v/v 70:30, chiết hỗn


hợp Sudan I và Sudan II bằng ethanol tuyệt đối) Với lượng mẫu, thể tích dịch
chiết, số lần chiết, nhiệt độ, thời gian chiết phù hợp, sử dụng dung môi chiết
chứa dung môi ethanol cho hiệu suất chiết cao đối với nhiều loại mẫu thực
phẩm (trên 90%) mà vẫn đảm bảo được yếu tố: khơng độc hại với người phân
tích và mơi trường, chi phí thấp, các bước thực hiện đơn giản và có thể áp
dụng chiết được nhiều loại mẫu
- Sử dụng Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu để hấp phụ chất màu từ dịch
chiết mẫu thực phẩm cũng là một điểm mới của luận án Đây cũng là một
bước quan trọng trong xử lý mẫu hướng tới "quy trình xanh" Việc sử dụng
nanosilia hấp phụ các Sudan ở điểm đẳng điện trong khi Sudan có tính kỵ
nước là một nghiên cứu chưa được đề xuất trước đó (các nghiên cứu hấp phụ
chất màu bằng RHNS chỉ tập trung vào chất màu ưa nước như Methylene
Blue, Rhodamine B, )
- Luận án đã đưa ra kết quả định lượng phân tích AO, Sudan I và Sudan
II trong nhiều mẫu thực phẩm khác nhau, số liệu có giá trị trong việc tham
khảo lựa chọn các loại thực phẩm an toàn đối với người tiêu dùng
5 Bố cục của luận án

Bố cục luận án gồm 147 trang, mở đầu 5 trang; tổng quan 40 trang;
thực nghiệm 27 trang; kết quả và thảo luận 56 trang; kết luận 2 trang Luận án
có 56 hình và 42 bảng; tài liệu tham khảo 11 trang với 13 tài liệu tiếng Việt và
63 tài liệu tiếng Anh Ngồi ra cịn có 6 Phụ lục với độ dài 6 trang


CHƯƠNG 1 -TỔNG QUAN
1 1 Chất màu tổng hợp
Chất màu tổng hợp dùng để nhuộm màu thực phẩm được sử dụng khá
phổ biến trên thế giới như một chất phụ gia khơng thể thiếu để tăng tính thẩm
mĩ Các chất này được tạo ra bằng các phản ứng hóa học tổng hợp, ví dụ
Sunset yellow (màu vàng), Amaranth (đỏ), Brilliant blue (xanh),…Mỗi quốc
gia đều có những quy định riêng về các loại chất màu tổng hợp được sử dụng
trong thực phẩm Tuy nhiên, mối lo ngại đến từ việc dung nạp quá nhiều
lượng màu tổng hợp này và việc sử dụng bất hợp pháp những phẩm màu đẹp
nhưng có nguy cơ gây ung thư Bảng 1 1 cung cấp thông tin một số chất
thường dùng làm phụ gia thực phẩm và được cho phép dùng trong thực phẩm
ở Việt Nam [5]
Bảng 1 1: Một số chất màu phụ gia thực phẩm được phép
sử dụng ở Việt Nam
Loại chất
Tartrazine (E102)
Công thức:
C16H9N4Na3O9S2
Quinoline Yellow
E(104)
Công thức:
C18H13NO5,8,11(SN
a)1,2,3


Màu sắc

Công thức cấu tạo


Carmoisine
(E122 )
Công thức:
C22H12N2O7S2Na
Amaranth (E123)
Công thức:
C20H11N2Na3O10S3

Cấu trúc phân tử của chất màu là yếu tố chính tạo nên màu sắc của nó
Trong phân tử chất màu gồm nhóm mang màu và nhóm trợ màu, nhóm mang
màu là những nhóm chứa các nối đôi liên hợp với hệ điện tử π không cố định,
có những nhóm mang màu quan trọng là: nhóm etylen (-CH=CH-); nhóm azo
(-N=N-); nhóm azomethine (-CH=N-); nhóm nitroso (-N=O); nhóm cabonyl
(=C=O) Bên cạnh đó, nhóm trợ màu bao gồm những nhóm thế, có thể cho
hoặc nhận điện tử như -NH2, -COOH, -SO3H,

chúng làm tăng cường màu

của nhóm mang màu bằng cách làm dịch chuyển năng lượng của hệ điện tử
Dựa vào nhóm mang màu người ta phân loại các chất màu tổng hợp
thành các nhóm như trình bày trong Bảng 1 2
Bảng 1 2: Phân loại chất màu tổng hợp theo nhóm mang màu
Loại chất
Đặc điểm
Ví dụ

Nhóm azo
Trong phân tử chứa
Sudan I
một hay nhiều nhóm
mang màu azo và các
nhóm trợ màu như
Nhóm

-OH, -NH2, -SO3H
Trong phân tử chứa

antraquinon

nhóm

mang

màu

Purpurin


antraquinone và các
nhóm trợ màu như
-OH, -NH2, -SO3H
Nhóm

Trong phân tử chứa

indigo


nhóm

mang

Indigo carmine

màu

indigo và các nhóm
trợ màu
Nhóm nitro Trong phân tử chứa
và nitroso

nhóm nitro hay nhóm
nitroso và các nhóm
trợ màu
Naphthol yellow

Nhóm hồn Trong phân tử có
ngun

Procion blue MX-R

đa nhiều vịng thơm và

vịng

nhiều nhóm mang
màu


Nhóm

Trong phân tử có

arylmethane

một hay nhiều vịng
thơm liên kết thay

Auramine O


thế trên methane và
các nhóm trợ màu

Nhóm

Trong phân tử có

azomethine

nhóm azomethine

Azomethine H

-CH=N- và các nhóm
trợ màu

Trong số các nhóm trên, nhóm chất màu azo chiếm khoảng 60% số

lượng các chất màu tổng hợp (số liệu công bố 2020) [24] Ưu điểm của chất
màu azo là sử dụng đơn giản, giá rẻ, bền màu nên được dùng rộng rãi trong
công nghệ dệt nhuộm, tuy nhiên vì có khả năng gây ung thư nên đang dần
được thay thế bằng những nhóm chất màu tự nhiên khác ít độc hại hơn
1 2 Cơ chế liên kết của chất màu với vật liệu
Khi tiếp xúc với vật liệu (sợi dệt, da, chất hấp phụ như silica, than hoạt
tính, ) hoặc trong mơi trường nước hoặc ở dạng khơ phân tán cao với nhiệt
độ thích hợp, chất màu sẽ liên kết với vật liệu trong một số điều kiện nhất
định Quá trình liên kết này khơng chỉ xảy ra ở mặt ngồi của vật liệu mà có
thể cả trên mặt các thành mao quản, các khoang trống bên trong giữa các
chùm đại phân tử của vật liệu Q trình này cũng khơng chỉ đơn thuần là các
lực liên kết hóa lý (lực liên kết phân tử và lực hấp phụ) mà có cả liên kết hóa
học, chất màu có thể thực hiện liên kết ion hay liên kết hóa trị với vật liệu
[12]
Liên kết ion: Liên kết này xuất hiện giữa các tâm tích điện dương của
vật liệu với các gốc mang màu tích điện âm của chất Quá trình diễn ra trong
khi nhuộm là khi chất màu tiếp cận với vật liệu, ion âm của chất màu bị các


tâm tích điện dương của vật liệu thu hút và thực hiện liên kết ion hay còn gọi
là liên kết muối theo phản ứng 1 1 như sau:
HOOC-P-NH3+ + -O3S-Ar → HOOC-P-NH3O3S-Ar (1 1)
Liên kết của chất màu với vật liệu khá mạnh do có năng lượng lớn, tốc
độ bắt màu nhanh Tốc độ nhuộm có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi
giá trị pH của dung dịch chất màu
Liên kết Hidro: Liên kết hidro xuất hiện giữa các nhóm định chức của
vật liệu và chất màu như: hydroxyl, nhóm amin, nhóm amit và nhóm carboxyl
khi chất màu và vật liệu tiếp xúc nhau Liên kết hidro này có vai trò khá quan
trọng trong một số trường hợp để cố định chất màu trên vật liệu Ví dụ, người
ta dùng chất màu trực tiếp gắn màu vào xơ xenlulo và tơ tằm chủ yếu do lực

liên kết hidro, các Sudan hòa tan vào dầu mỡ và nhuộm màu trên thịt cũng
một phần do liên kết hidro tồn tại giữa nhóm - OH của Sudan và –COOH của
các axit béo trong dầu mỡ, -N-H trong Auramine O tạo liên kết hidro với –OH
trong chất xơ của măng, tinh bột của miến,…
Liên kết hóa trị: Liên kết hóa trị xuất hiện khi nhuộm chất màu hoạt
tính (reactive dyes) trên các vật liệu xơ sợi chứa các nhóm hydroxyl –OH (ví
dụ sợi cellulose) và nhóm amin –NH2 (ví dụ sợi polyamide hoặc len) Liên kết
hóa trị chủ yếu giúp cho chất màu hoạt tính bám màu tốt trên vật liệu đặc biệt
với xử lý ướt
Liên kết Van Der Waals: Liên kết Van Der Waals xuất hiện ở hầu hết
các lớp chất màu khi nó tương tác với vật liệu Đây là lực liên kết ở cấp độ
phân tử và được coi là tổ hợp của các lực hút: lưỡng cực, phân cực cảm ứng
và lực phân tán Nó phụ thuộc và loại vật liệu nhuộm là ưa nước hay kỵ nước,
cũng phụ thuộc vào phân tử chất màu là có cực hay khơng có cực, và mức độ
tiếp xúc giữa chất màu và vật liệu