Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Kỹ thuật chuyển gien trên
thục vật
Hiện nay, diện tích GMO trên thế giới khoảng 215 triệu acres
Cây trồng chuyển gien (GMO)
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Gien là 1 đoạn ADN mã hóa 1 loại protein chuyen biệt 
biểu hiện 1 tính trạng.
mRNA protein trait
transcription
translation
expression
Cây trồng chuyển gien là gì ?
•
Thuật ngữ ‘chuyển gien’ (Transgenic) dùng để chỉ việc đưa gien
vào 1 đối tượng SV nào đó bằng KT ADN tai tổ hợp. Gien được
chuyển từ các loài khác hay trong cùng 1 loài.
•
Từ đồng nghĩa (Synonym):
Genetically modified organism (GMO)
Genetically engineered organism (GEO)
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ?
Bắp (corn)
Cà rốt (carrot)
cải salade (lettuce)
Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ?
Valued Gateway Customer

Producing Transgenic Plants
Teosinte Bắp (maize)
Sinapis
Cabbage
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Từloài hoang dại trở thành loài trồng
• Mất khả năng phát tán hạt tự nhiên
(rụng, lông, gai )
• Nảy mầm nhanh
• Hạt lớn
• Chín đồng loạt
• Mất khả nang tự baro vệ trong
môi trường tự nhiên
• Màu sắc thay đổi
• Không còn chất độc hoặc vị đắng
Source: Damania, 2008
Thuần hóa
(Domestication)
Quá trình chọn giống gồm 2 bước cơ bản
I. Tạo ra (hoặc nhận diện) các dạng biến dị.
•
Thu thập từ nơi hoang dại hay ruộng nông dân
•
Lai tạo (lai giữa 2 hay nhiều cây)
•
Gây đột biến, hoặc đa bội
II. Chọn lựa các tính trạng mong muốn.
Các đặc tính đầu tiên được nhà chọn giống quan tâm trong
quá trình thuần hóa là: hạt to, không bị ngủ đông, và không bị

rụng hạt.
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Công tác lai tạo có thể thực hiện từ nhiều
nguồn nguyên liệu khác nhau
Nguồn gien sơ cấp (trong cùng loài)
•
Các giống ưu việt
•
Giống địa phương (primitive cultivars)
•
Giống hoang dại của cùng loài
Nguồn gien thứ cấp (khác loài)
•
Giống trồng, giống địa phương, hoặc cây hoang dại của các
loài khác (species) hoặc giống khác (genera)
 lai xa
Lai xa và xử lý đột biến không được sử
dụng phổ biến
•
Cây ngũ cốc triticale là sản phNm lai xa gia lúa mì (Triticum) và
lúa mch en (Secale).
•
TAM107, ging lúa mì có cha 1 cánh N ST ca lúa mch en, à
ging chng chu stress ưc trng ph bin  Colorado (M).
•
Ging lúa mì ‘Clearfield’, mang gien kháng thuc tr c, ưc to
ra do x lý t bin, sp ưc ưa ra th trưng.
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants

KT chuyn gien có phi là bưc m rng
ca PP chn ging truyn thng hay là s
phát trin nhy vt hoàn toàn mi ?
•
KT chuyn gien cho phép khai thác các bin d di truyn trong th
gii SV, thay vì ch giưi hn trong cùng loài hay cùng ging trong
h thng phân loi.
•
Gien ưc chuyn vi mc  chính xác rt cao so vi các PP
trưc ây.
•
N hưng 2 bưc cơ bn ca qui trình chn ging vn phi m bo:
to bin d và chn la tính trng mong mun.
Qui trình to cây chuyn gien
•
Phân lp và nhân dòng (cloning) gien cn chuyn
•
Gn thêm vào gien các on khi ng và iu hòa hot ng
ca gien
•
Gm thêm marker chn lc (selectable marker)
•
ưa cu trúc ưc thit k (cassette) và TB ca cây (chuyn
gien - transformation)
•
Chn lc các Tb hay mô mang gien chuyn
•
Tái to li Regenerate whole plants
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants

Xác nh và nhân dòng (cloning) gien cn
chuyn
•
ây là bưc àu tiên, và cũng là gii hn ca thành t v chuyn
gien.
•
Các phòng thí nghim quc gia cũng như tư nhân ang tp trung
rt nhiu công sc vào vic xác nh , nh v, kháo sát tính cht
và nhân dòng nhng gien kim soát các tính trng nông hc quan
trng (chiu cao, tr hoa, s trái, s ht, năng sut ).
Bước 1:
Arabidopsis thaliana
•
Vic gii mã trình t bô gien hoàn tt vào
tháng 12/2000: b gien cha khong ~120
Mb (ADN ), và có khong 25.000 gien.
•
‘D oán’ chc năng ca gien ưc thc
hin cho khong 70% các gien.
•
N hng vùng lp chim khong 58% b
gien, dưng như do s nhân ôi ca toàn
b gien xy ra vào khong 100 triu năm
v trưc.
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Thông tin có ưc t nghiên cu trên Arabidopsis
•
Có nhiu loi gien huc nhom Protein-kinase hơn d oán. iu này
co thy tm quan trng trong cơ ch truyn phát tín hiu trong TB.

•
N hũng gien kim soát các hot ng cơ bn ca TB ưc bo tn
trong quá trình tin hóa (có t l ging nhau cao gia ngưi và
Arabidopsis). N gưc li, các gien kim soát s trao i thông tin ca
TB thì rt thay i, bao gm:
♦ Các gien kim soát các chc năng cơ bn ca TB tn ti  thi
t tiên.
♦ N hưng khi n giai on a bào thì tin hóa theo hưng khác
nhau gia V và TV.
Các dng t bin trên
Arabidopsis ưc to ra
bng KT chuyn gien
(t bin “knock-out”)
cho phép phát hin chc
năng ca các gien.
(C
(C
á
á
c đ
c đ
ộ
ộ
t bi
t bi
ế
ế
n liên quan
n liên quan
đế

đế
n
n
c
c
ấ
ấ
u t
u t
ạ
ạ
o hoa)
o hoa)
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Mc tiêu tương lai trong nghiên cu b gien TV
•
Xác nh chc năng ca tt c các gien trên Arabidopsis (2010)
•
Gii mã trình t b gien ca cây lúa (b gien nh nht trong nhóm ngũ
cc).
•
Gii mã trình t ca cây c 3 lá (Medicago truncatula) (i din cho
nhóm cây h u).
•
Gii mã trình t nhũng vùng mang nhiu gien (gene-rich regions) ca
nhóm cây ngũ cc vi b gien ln, VD: bp, lúa mì
•
Bào t ca csc VK t Bacillus thuringiensis (Bt) có cha các tinh
th (crystalline - Cry) protein. Tromg h thng tiêu hóa ca côn

trùng, các tinh th này b phá v và gii phóng ra các c t  liên
kt và làm thng ưng rut ca côn trùng.
•
1 on ca gien Cry ưc s dng trong chuyn gien  to ra các
ging cây trng Bt.
Gien Bt
on mã hóa cho c t
on không cn thit
cho c tính
Bước 2:
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
gn thêm các on ADN  kim soát biu hin ca
gien
•
Promoter = im bt u ca quá trình sao mã; có tính
chuyên bit cho thi im, v trí mô, mc  biu hin ca
giean.
•
Termination sequence = im k thúc ca quá trình sao mã.
Promoter
Terminator
Bt coding
sequence
Bước 2:
Transgene promoters
•
Thưng ưc s dng là CaMV 35S promoter ca víu gây bnh
khm trên cây bông ci. ây là promoter mnh và biu hin  mi
nơi, mi lúc (constitutive promoter)  TV.

•
Các Promoter có tính chuyên bit hơn ang ưc nghiên cu: c
trưng cho cơ quan, giai on phát trin ca TV hay trong các /kin
c bit khác.
Transgene Terminator
•
Thưng ưc s dng nht là nopaline synthase (nos) transcription
terminator ca VK Agrobacterium tumefaciens.
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Gn thêm các marker chn lc (Selectable markers
•
Bi vì hiu qu chuyn gien rt thp (t 1 - 5% TB nhn ưc
gien chuyn), do ó cn phi có PP  nhn din các TB ã
nhn ưc gien chuyn  tip tc.
•
Hin nay, các gien kháng vói kháng sinh (antibiotic) hoc vi
thuc tr c thưng ưc s dung làm marker nhn din.
Bước 3:
Thit k gien Bt (cassete) cho chuyn gien
Antibiotic or
herbicide
resistance gene
Promoter
Bt gene
Termination
sequence
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Chuyn thit k gien vào TB TV (chuyn

gien - Transformation)
•
Súng bn gien (Gene gun = biolistics, microprojectile
bombardment)
•
Chuyn gien bng VK Agrobacterium
Bước 4:
Các loi mô TV ưc s dng trong chuyn gien
Vic chn la các mô TV  chuyn gien tùy thuc vào tng loi
cây trng, thưng là các phôi chưa trưng thành (immature
embryos), dĩa lá (leaf disks) và mô phân sinh ngn (apical
meristems).
Các mô ưc chn phi có kh năng to callus (undifferentiated
tissue), t ó tái to li cây.
Trên Arabidopsis, PP chuyn gien có th thc hin ơn gin bng
cách phun ddch có ch gien cn chuyn + vector lên trên các
chi
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
PP s dng súng bn gien
(“Gene gun” method)
DN A
TB TV
Source: Monsanto
N ST ca TV
Gien cn chuyn
pellets
ây là PP vt lý:
• Các ht kim loi (vàng hoc titan) rt nh có ADN bám xung
quanh, nm trong ddch huyn phù, ưc s dng thành git nh

trong súng bn gien.
• Các ht ưc bn ra do áp lc t bung nén khí ca súng bn gien.
• Các ht ln b gi li  màng ngăn (stopping plate), nhưng các ht
nh tip tc di chuyn và i vào các TB TV phía dưi.
• Kt qu là ADN cn chuyn s ưc ưa vào TB TV.
PP s dng súng bn gien (“Gene gun” method)
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Súng bn gien
ưc s dng
thành công trên
bp. lúa. lúa mì,
lúa mch và
nhiu loi hoa
màu khác.
Mô h
Mô h
ì
ì
nh v
nh v


n h
n h
à
à
nh c
nh c



a s
a s
ú
ú
ng b
ng b


n gien
n gien
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Súng bn gien s dng khí Helium
(Helios Gene Gun)

S dng áp lc to ra do khí Helium  ưa các ht vàng ưc bc
xung quanh bi DN A hoc ARN t vách trong ca ngăn nha bên trong
úng i thng n TB TV.
VK Agrobacterium tumefaciens chuyn 1 phn ADN ca
chúng vào TB TV.
Hiejn tưng này ưc ghi nhn trên nhiu loi cây king, cây
ăn trái to ra khi u trên cây.
Source: Ohio
State Univ.
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
T-DN A
Ti plasmid
vir genes

Khi b kích thích bi hóa cht, gien vir ưc kích hot và
iu khin chui tin trình chuyn T-DN A (ca VK) vào
TB TV
bacterial
chromosome
T-DN A border region
PP chuyn gien s dng Agrobacterium
T-DN A (mang gien chuyn)
(Ti) plasmid mang gien chuyn
Agrobacterium tumefaciens
N ST ca VK
Chuyn gien vào TB
TV
N ST ca TV
Source: Monsanto
Gien chuyn
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Trong cơ ch chuyn gien bng Agrobacterium, cn tác ng ca nhiu
gien vir (nm trên T-DN A):
+ N hân bn sao T-DN A.
+ Gn 1 sn phNm vào bn sao T-DN A như là yu t dn ưng
(leader)
+ Gn protein dc theo chiu dài si T-DN A  tác ng bo v
+ M kênh vn chuyn trên màng TB VK  chuyn T-DN A ra khi
TB VK
Cơ ch chuyn gien bng Agrobacterium
+ T-DN A i vào bên trong TB TV qua vt thương, sau ó di
chuyn vào nhân và gn vào b gien ca TB TV.
+ Mt gi thuyt cho rng, khi vào ưc bên trong TB TV, T-

DN A s i n khi DN A ca TB TV nhân ôi, hoc sao mã mi
gn vào b gien ca TB TV.
Cơ ch chuyn gien bng Agrobacterium
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Event = Là nhng dòng nhn gien chuyn mt cách thành công.
Các dòng mang chuyn gien s khác nhau  thành phn gien
chuyn nhn ưc và  v trí mà gien gn vào trên b gien ca
TB nhn.
Dòng mang chuyn gien (Transgenic “event”)
Bp có 10 N ST, bt c N ST nào cũng có th nhn gien
chuyn  có th có nhiu dòng mang chuyn gien khác
nhau.
N hn din các TB/mô ã nhn ưc gien
chuyn bng cách s dng môi trưng chn
lc.
Cá th ã nhn
ưc gien chuyn
Bước 5:
Môi trưng chn
lc (cha kháng
sinh, thuc tr
c )
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Tái to li cây bng
phương pháp nuôi cy
mô (in vitro).
Nguồn: USDA
Bước 6:

N hng k thut mi s ưc ngày càn hoàn thin  nâng cao hiu
qu chuyn gien và khc phc các nh hưng có th có i vi sc
khe và môi trưng, c th là:
•
nh hưng chính xác v trí gn ca gien chuyn
•
S dng các marker chn lc mi tay cho các gien kháng vi
kháng sinh ang ưc s dng ph bin hin nay
•
Kim soát tt hơn biu hin ca gien chuyn trong cơ th nhn
(nh hưng ưc thi gian và v trí biu hin ca gien chuyn)
•
Có t chuyn gien vào lc lp (chloroplasts) thay vì chuyn
gien vào trong nhân
Tương lai ca KT chuyn gien trên thc vt
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
ánh giá biu hin ca cây chuyn gien
•
Kim tra s hin din ca gien chuyn và hot ng ca
chúng
•
Kho sát nh hưng ca gien chuyn trên s sinh trưng
phát trin ca cây nhn
•
Kho sát nh hưng ca gien chuyn n môi trưng
•
Kho sát tính an toàn ca gien chuyern khi ưc s dng
làm th ăn cho ngưi hay gia súc
Bước 7:

Kim tra s hin din và hot ng ca gien
chuyn trên cây nhn (cây chuyn gien)
•
KT lai Southern (Southern blot)  xác inh xem gien chuyn
có nm trên b gien ca cây nhn ?
•
KT lai N orthern (N orthern blot)  xác nh xem gien chuyn
co sao mã thành ARN m trong cây nhn ?
•
KT lai Western (Western blot)  xác nh xem protein có
ưc tng hp t gien chuyn, bên trong cây nhn ?
•
Cây nhn có biu hin ra tính trng mong mun hay không ?
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
S dng PP hi giao (Backcross)  ưa
gien chuyn t các cây chuyn gien vào các
ging ưu tú ang ph bin trong SX
•
i vi hu ht các loài TV, ch có 1 vài dòng/ging cho hiu
qu chuyn gien cao, tuy nhiên các dòng/ging này thưng
mang các c tính nông hc và cht lưng không cao.
•
Vì vy, sau khi to ưc các cây chuyn gien u tiên, cn s
dng PP hi giao nhiu ln  ưa gien chuyn t các cây
chuyn gien vào các ging ưu tú ang ưc s dng ph bin
trong SX.
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer

Producing Transgenic Plants
Valued Gateway Customer
Producing Transgenic Plants
Các ng dng trên thc vt ang
ưc áp dng KT chuyn gien
• Kháng thuc tr c
• Kháng côn trùng
• Gia tăng năng sut và phNm cht
• Thc phNm chc năng
• S dng cây trng như ‘lò P/ sinh hc’ (bioreactors)
• N ăng lưng sinh hc (Biofuels)
• Gia tăng cht lưng g
• Liu pháp sinh hc dùng trong y hc (Bioremediation)