BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

PHẠM THỊ CHUYÊN

PHÂN TÍCH AURAMINE O, SUDAN I, SUDAN II
TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP RP-HPLC
SỬ DỤNG VẬT LIỆU NANOSILICA ĐỂ XỬ LÝ MẪU
Chun ngành: Hóa học phân tích
Mã số: 9.44.01.18

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC


Hà Nội - 2022


Cơng trình được hồn thành tại:
Bộ mơn Hóa phân tích - Khoa Hóa học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Đặng Xuân Thư
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2. TS. Nguyễn Bích Ngân
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
Phản biện 2: PGS.TS. Huỳnh Văn Trung
Viện Công nghệ Xạ hiếm
Phản biện 3: PGS.TS. Dương Thị Tú Anh

Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án
cấp Trường họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
vào hồi …..giờ … ngày … tháng… năm 2022

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc Gia, Hà Nội
- Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội


4
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết và lí do của đề tài
Cơ quan nghiên cứu Ung thư quốc tế IARC đã xếp một số chất
màu tổng hợp vào nhóm các chất có thể gây ung thư như: các chất Sudan,
Auramine O, Rhodamine B, Ponceau 3R,… Tuy nhiên đã có nhiều sản
phẩm thực phẩm trên thị trường bị phát hiện sử dụng phẩm màu không
được phép dùng cho thực phẩm.
Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm phẩm màu QCVN 4-10:2010/BYT và Thông tư số 21/2019/TTBNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về “Hướng
dẫn một số điều của luật chăn nuôi về Thức ăn chăn ni”, có quy
định rõ tại phụ lục V: Cấm sử dụng Auramine O (AO) và các dẫn
xuất của Auramine O trong thức ăn chăn nuôi, như vậy AO là chất
không được phép có mặt trong thực phẩm tại Việt Nam. Mặt khác
thông tư 24/2019/TT-BYT ban hành ngày 30 tháng 8 năm 2019 quy
định có 57 chất màu được phép sử dụng trong thực phẩm không bao
gồm các Sudan và AO. Do đó, một phương pháp phát hiện AO và
các chất Sudan ở lượng siêu vết trong thực phẩm là rất cần thiết.
Trong các hợp chất Sudan, thì Sudan I và Sudan II có màu đỏ sáng
đẹp mắt, được sử dụng khá phổ biến trong thực phẩm hơn Sudan III
và Sudan do đó đề tài chọn hướng nghiên cứu hỗn hợp Sudan I và

Sudan II trong mẫu thực phẩm.
Hiện nay, Việt Nam mới chỉ có duy nhất một phương pháp
được chứng nhận để xác định Auramine O trong thực phẩm và thức
ăn chăn nuôi là Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12267:2018 về “Thực
phẩm - xác định hàm lượng Auramine - phương pháp sắc ký lỏng
ghép khối phổ (LC-MS/MS)”, chưa có phương pháp được chứng


5
nhận để xác định các Sudan trong thực phẩm. TCVN 12267:2018 đã
áp dụng một quy trình duy nhất chiết tách AO từ các nền mẫu thực
phẩm khác nhau bằng dung mơi hữu cơ, điều này có thể dẫn đến hiệu
suất thu hồi thấp và độ chính xác chưa cao do các mẫu thực phẩm
khác nhau có nền mẫu phức tạp không giống nhau, đồng thời LCMS/MS là hệ thống thiết bị phức tạp đắt tiền, khơng phổ biến trong
các phịng thí nghiệm. Ưu điểm của phương pháp HPLC là có thể
định lượng đồng thời các chất màu tương tự nhau, phương pháp phân
tích và vận hành đơn giản, thiết bị sử dụng phổ biến, tuy nhiên khi
phân tích HPLC cần phải xử lý làm sạch ảnh hưởng của nền mẫu.
Việc sử dụng nanosilica từ vỏ trấu (RHNS) để hấp phụ chất màu
Rhodamine B và Xanh metylen trong dung dịch nước đã được
nghiên cứu trên thế giới, ưu điểm của việc sử dụng RHNS so với kỹ
thuật chiết pha rắn (SPE) ở nguồn nguyên liệu nông nghiệp rẻ tiền là
trấu, các bước thực nghiệm đơn giản không cần thiết bị phức tạp, sử
dụng chính dung mơi pha động HPLC để rửa giải chất màu cho hiệu
suất hấp phụ- rửa giải cao. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào tiến
hành hấp phụ chất màu AO và Sudan từ dịch chiết mẫu thực phẩm.
Nhằm tìm kiếm giải pháp chiết, tách phù hợp với từng nền
mẫu thực phẩm khác nhau, đồng thời xây dựng phương pháp định
lượng chất màu nhân tạo độc hại bằng hệ thống thiết bị đơn giản, phù
hợp với các điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành đề tài

“Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng
phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu”.
2. Mục đích và nội dung chính của luận án
Mục đích của luận án:
 Xây dựng quy trình phân tích Auramine O trong mẫu thực phẩm:
măng, miến, dưa, phấn hoa, cá khơ, mì tơm.


6
 Xây dựng quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu
thực phẩm thịt khô và bim bim.
Nội dung nghiên cứu chính của luận án:
 Đối với Auramine O:
o

Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định Auramine O bằng phương pháp
HPLC.

o

Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Auramine O từ mẫu thực phẩm
phịng thí nghiệm.

o

Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của Auramine O trong dung dịch lên
Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu (kí hiệu RHNS).

o


Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Auramine O trong mẫu
thực tế.

 Đối với hỗn hợp Sudan I và Sudan II:
o

Khảo sát tìm điều kiện tối ưu xác định đồng thời Sudan I và Sudan II
bằng phương pháp HPLC.

o

Khảo sát các điều kiện tối ưu chiết Sudan I và Sudan II từ mẫu thực
phẩm phịng thí nghiệm.

o

Nghiên cứu điều kiện hấp phụ của của hỗn hợp Sudan I và Sudan II
trong dung dịch lên Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu.

o

Áp dụng quy trình đã nghiên cứu để xác định Sudan I và Sudan II
trong mẫu thực tế.
3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
- Các chất màu Sudan I, Sudan II trong các mẫu thực phẩm:
mẫu thịt khô, mẫu bim bim.
- Chất màu Auramine O trong các mẫu: măng, miến, phấn hoa,
dưa chua, cá khơ, mì tơm.
Phương pháp nghiên cứu



7
- Phương pháp chiết lỏng – lỏng mẫu thực phẩm bằng dung
môi hữu cơ.
- Phương pháp hấp phụ chất màu trên nanosilica.
- Phương pháp phân tích HPLC định lượng chất màu, sử dụng
detector mảng Diode Array (PDA).
- Phương pháp phổ hấp phụ phân tử UV-Vis để xác định các
bước sóng hấp phụ cực đại của các dung dịch chất màu.
Luận án sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại để
đánh giá xác định các đặc trưng của vật liệu hấp phụ: phổ FTIR,
SEM, EDX, BET,…
Sử dụng các phương pháp thống kê để xử lý kết quả, đánh giá
số liệu thực nghiệm.
4. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và đóng góp mới của luận án
- Việc kiểm tra chất màu độc hại trái phép trong thực phẩm với
các mẫu ngẫu nhiên tại các phịng thí nghiệm nhỏ ở Việt Nam là ít
khả thi, chính vì vậy với mục tiêu nghiên cứu phát triển phương pháp
phân tích đơn giản RP-HPLC để đánh giá hàm lượng AO, Sudan I và
Sudan II trong một số mẫu thực phẩm trên thị trường là có ý nghĩa
lớn.
- Luận án đã đưa ra quy trình chung để phân tích các chất màu
(Auramine O và hỗn hợp Sudan I, Sudan II) trong các mẫu thực
phẩm. Quy trình gồm 2 giai đoạn chính là xử lý mẫu và phân tích
định lượng mẫu bằng phương pháp HPLC. Giai đoạn xử lý mẫu
được thực hiện theo 2 cách với các loại mẫu khác nhau. Cách 1:
Chiết bằng dung môi hữu cơ. Cách 2: Chiết bằng dung môi hữu cơ Hấp phụ chất màu trong dịch chiết bằng Nanosilia chế tạo từ vỏ trấu
- Giải hấp phụ bằng pha động HPLC. Đây là quy trình phân tích chất
màu trong thực phẩm chưa được đề xuất trước đó trong bất kỳ cơng

trình nghiên cứu khoa học nào.


8
- Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ
được đánh giá là phương pháp nhanh, đơn giản dễ thực hiện và chi
phí thấp. Một điểm ý nghĩa của luận án là đưa ra phương pháp chiết
các chất màu bằng dung môi ethanol (chiết auramine O bằng hỗn
hợp ethanol: nước (v/v 70:30, chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II
bằng ethanol tuyệt đối). Với lượng mẫu, thể tích dịch chiết, số lần
chiết, nhiệt độ, thời gian chiết phù hợp, sử dụng dung môi chiết chứa
dung môi ethanol cho hiệu suất chiết cao đối với nhiều loại mẫu thực
phẩm (trên 90%) mà vẫn đảm bảo được yếu tố: khơng độc hại với
người phân tích và mơi trường, chi phí thấp, các bước thực hiện đơn
giản và có thể chiết đồng thời được nhiều loại mẫu.
- Sử dụng Nanosilica chế tạo từ vỏ trấu để hấp phụ chất
màu từ dịch chiết mẫu thực phẩm cũng là một điểm mới của luận
án. Đây cũng là một bước quan trọng trong xử lý mẫu hướng tới
"quy trình xanh".
- Luận án đã đưa ra kết quả định lượng phân tích AO, Sudan I
và Sudan II trong nhiều mẫu thực phẩm khác nhau, số liệu có giá trị
trong việc tham khảo lựa chọn các loại thực phẩm an toàn đối với
người tiêu dùng.
5. Bố cục của luận án
`

Bố cục luận án gồm 147 trang: mở đầu 5 trang; tổng quan 40

trang; thực nghiệm 27 trang; kết quả và thảo luận 56 trang; kết luận 2
trang. Luận án có 56 hình và 42 bảng; tài liệu tham khảo 11 trang với

13 tài liệu tiếng Việt và 63 tài liệu tiếng Anh. Ngồi ra cịn có 6 Phụ
lục với độ dài 6 trang.


9
CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN
Chương 1 giới thiệu thông tin về các vấn đề thuộc phạm vi
nghiên cứu của luận án bao gồm:
1.1. Chất màu tổng hợp
1.2. Cơ chế liên kết của chất màu với vật liệu
1.3 Auramine O
1.4. Các hợp chất Sudan
1.5. Một số vấn đề khi định lượng chất màu bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: gồm các nội dung về hệ số đối
xứng của peak, các vấn đề về peak, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ.
1.6. Xử lý mẫu thực phẩm: gồm các nội dung về phân loại các
phương pháp xử lý mẫu, kỹ thuật chiết lỏng - lỏng ứng dụng xử lý mẫu,
xu hướng áp dụng kỹ thuật chuẩn bị mẫu xanh.
1.7. Vật liệu nanosilica và ứng dụng trong hấp phụ chất màu:
bao gồm các nội dung về các đặc trưng vật lý, hóa học của vật liệu, cơ
sở xử lý thống kê số liệu hấp phụ, các ứng dụng vật liệu nanosilica chế
tạo từ vỏ trấu trong hấp phụ làm giàu chất phân tích.
CHƯƠNG 2- THỰC NGHIỆM
2.1. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1.Chuẩn bị mẫu giả
2.2.1.1. Mẫu phân tích Auramine O
Măng tươi được đào nguyên củ, bỏ phần cứng và xơ, lấy lõi
mềm rửa sạch, thái mỏng, ngâm qua nước muối pha lỗng, vớt, luộc
chín, để ráo nước, sau đó ngâm ngập trong dấm đến 4 ngày, khi ngửi

thấy măng có mùi chua đặc trưng thì vớt ra, cắt nhỏ, cân khối lượng


10
ban đầu m1 (gam), thêm vào một lượng Auramine O theo khối lượng
định trước (mAO gam). Đem sấy đến khối lượng không đổi trong tủ
sấy chân không cân khối lượng m2 gam, sau đó nghiền, rây mịn.
Với mẫu miến, là loại miến dong làm thủ công tại Sơn La, được
kiểm sốt cơng đoạn chặt chẽ để khơng sử dụng bất cứ chất màu hoặc
chất tẩy trắng nào trong quá trình làm miến. Lấy một lượng miến đem
sấy khô đến khối lượng không đổi (ghi khối lượng mẫu ban đầu m 1
gam), ngâm vào nước ấm đến mềm, trộn AO khối lượng định trước
(mAO gam), đảo và nghiền đều đến đồng nhất mẫu, đem sấy khô đến
khối lượng không đổi (m2 gam), nghiền vụn, rây mịn, thu bột mịn, tiếp
tục sấy bột trong tủ sấy chân không khoảng 3 giờ, sản phẩm đựng trong
lọ kín, bảo quản trong tủ lạnh tối.
2.2.1.2. Mẫu phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II
Để xác định các điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất các mẫu
thực phẩm, hai mẫu thịt khô, ký hiệu là A và B, đã được chuẩn bị.
Thịt lợn tươi được mua từ một siêu thị VinMart tại Hà Nội, có chứng
nhận thịt lợn sạch ni hữu cơ. Chỉ dùng phần thịt nạc (loại sạch mỡ,
da, gân), thái mỏng, băm rồi xay nhỏ đến kích thước nhỏ hơn 5 mm.
Cho lượng thịt nạc xay nhỏ xấp xỉ nhau vào hai cốc thủy tinh
chịu nhiệt (kí hiệu A và B), và thêm 0,1g NaCl vào mỗi cốc. Cốc A
chỉ chứa mẫu thịt và muối, trong khi cốc B chứa mẫu thịt, muối và
Sudan I, Sudan II. Thêm vào mỗi cốc vài giọt ethanol và trộn đều để
hỗ trợ chất màu thẩm thấu vào thịt và đảm bảo màu sắc phân bố đều
lên thịt. Các mẫu thịt được lưu trữ kín trong tủ lạnh khoảng một ngày
để chất màu thấm kĩ vào thịt. Sau đó, các mẫu lại được trộn đều rồi
sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50°C trong một ngày đêm. Các mẫu

thịt khô được nghiền nhỏ bằng máy rồi rây qua rây kích thước lỗ 0,5
mm. Cuối cùng, các mẫu đã rây xong được tiếp tục làm khô trong tủ
sấy chân không đến khối lượng không đổi (thời gian khoảng 3 tiếng).


11
2.2.2. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu phân tích chất màu bằng
HPLC
Các dung dịch chuẩn của Auramine O trước khi đem đo HPLC
đều được pha trong đệm photphat (pH=3, thêm 0,2% triethylamine) trộn
ACN (tỉ lệ thể tích 65:35).
Các dung dịch chuẩn của hỗn hợp Sudan I và Sudan II trước
khi đem đo HPLC đều được pha trong pha động là MeOH: H 2O:
ACN (v/v=77:3:20). Các nội dung khảo sát bao gồm:
2.2.2.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại
2.2.2.2. Khảo sát pha động tối ưu
2.2.2.3. Khảo sát tỉ lệ pha động
2.2.2.4. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
2.2.3. Nghiên cứu các điều kiện chiết
2.2.3.1. Các điều kiện chiết Auramine O
* Đánh giá khả năng chiết của hai phương pháp: chiết có hỗ
trợ rung siêu âm và chiết rung lắc.
* Lựa chọn dung mơi chiết AO: Có 8 loại dung môi chiết được
lựa chọn để khảo sát được nêu trong bảng 2.3.
Bảng 2.3 Các loại dung môi lựa chọn cho quá trình chiết AO.
Stt

Thành phần

Tỉ lệ


Stt

Thành phần

v:v
1

Tỉ lệ
v:v

ACN:H2O

ACN

100%

5

2

EtOH

100%

6

MeOH:H2O

70:30


3

MeOH

100%

7

EtOH:H2O

70:30

4

H2O

100%

8

EtOH:H2O

50:50

(0,5%NH3)

70:30

* Khảo sát thời gian chiết: thời gian chiết được khảo sát với 5



12
mốc là 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút, 200 phút.
* Khảo sát nhiệt độ chiết: khảo sát các mức nhiệt độ đươc gia
nhiệt trong quá trình chiết là : 50°C, 60°C, 70°C
* Khảo sát số lần chiết: với 10mL dung môi, khảo sát 3
phương án chiết:
(1) chiết 1 lần 10 mL trong 60 phút
(2) chiết 2 lần, mỗi lần 5 mL (30 phút/lần)
(3) Chiết 3 lần theo thể tích dung mơi thêm vào lần lượt là 43-3 mL (20 phút/lần)
* Khảo sát tỉ lệ mẫu và dung môi: Mẫu MMT và MIT được
khảo sát với các khối lượng thay đổi giảm dần từ khoảng 1 gam, 0,1
gam và 0,02 gam.
* Khảo sát độ thu hồi của quá trình chiết
* Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
2.2.3.2. Các điều kiện chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II
* Đánh giá khả năng chiết của hai phương pháp: chiết rung
siêu âm và chiết rung lắc.
* Loại dung môi chiết: khảo sát với các dung môi ACN 100%,
EtOH 100%, MeOH 100%. Hiệu suất chiết được sử dụng làm cơ sở
chính so sánh, lựa chọn dung môi chiết phù hợp.
* Khảo sát thời gian chiết: thời gian chiết được khảo sát với 5
mốc là 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút, 200 phút.
* Khảo sát nhiệt độ chiết: khảo sát các mức nhiệt độ đươc gia
nhiệt trong quá trình chiết là : 50°C, 60°C, 70°C.
* Khảo sát số lần chiết
* Khảo sát tỉ lệ mẫu và dung môi
2.2.4. Nghiên cứu các đặc tính của nanosilica từ vỏ trấu và điều
kiện hấp phụ tối ưu



13
2.2.4.1. Đặc trưng vật lý của vật liệu
Các thông số đặc trưng của vật liệu đã được xác định bằng các
phương pháp hiện đại, độ tin cậy cao, kết quả đươc thể hiện thông
qua: phổ FT-IR, phổ EDX, đường đẳng nhiệt hấp phụ - giải hấp N 2,
đường phân bố kích thước mao quản, biểu đồ diện tích bề mặt BET,
đặc trưng thế Zeta phụ thuộc pH dung dịch hấp phụ.
2.2.4.2. Nghiên cứu các điều kiện hấp phụ tối ưu
Các yếu tố cần khảo sát ảnh hưởng trong quá trình hấp phụ là:
a) Khảo sát ảnh hưởng của lực ion đến hấp phụ: Thêm KCl
với các giá trị nồng độ khác nhau vào dung dịch hấp phụ.
b) Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch hấp phụ ban đầu:
Sử dụng các dung dịch KOH 0,01M; KOH 0,005M; HCl 0,02M để
điều chỉnh pH của dung dịch hấp phụ
c) Khảo sát thời gian cân bằng hấp phụ: Pha các dung dịch
nồng độ đầu khác nhau, khảo sát với thời gian hấp phụ khác nhau.
Các điều kiện khác cố định gồm: thể tích dung dịch RHNS, pH dung
dịch, nồng độ KCl.
d) Đường hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir
2.2.4.3. Nghiên cứu điều kiện rửa giải chất màu
2.2.5. Xác định độ không đảm bảo đo của phương pháp
Được tính theo cơng thức: UR(%)=tα,f . RSDR (%)

(2.1)

Trong đó:
UR : Độ khơng đảm bảo đo tổng theo thu hồi (%)
RSDR : Độ lệch chuẩn tương đối của độ thu hồi (%)

tα,f: giá trị t-student tra bảng với mức ý nghĩa α = 0,05
f: Bậc tự do (f = n - 1)
n : Số lần thử nghiệm
2.2.6. Lấy mẫu thực tế và xử lý mẫu


14

Hình 2.3: Quy trình xử lý
mẫu măng, miến, dưa
muối chua, thịt khơ.

Hình 2.4: Quy trình xử lý
mẫu cá khơ, bim bim,
phấn hoa và mì tơm.
(*)
: Tùy thuộc vào chất cần phân tích là AO hay hỗn hợp Sudan

I và Sudan II sẽ áp dụng điều kiện chiết tối ưu phù hợp
Các mẫu lấy tại các quầy hàng tươi, khô trong chợ Long Biên
gồm: 4 mẫu măng, 2 mẫu miến, 1 mẫu phấn hoa, 3 mẫu cá khơ.
Ngồi ra, các mẫu thực phẩm khác được lấy tại chợ Xanh (quận Cầu
Giấy, Hà Nội), chợ Cầu Diễn (Nam Từ Liêm, Hà Nội) và chợ Trung
Tâm (Thành phố Sơn La).
Các bước xử lý mẫu được sơ đồ hóa theo 2 quy trình như Hình
2.3 và Hình 2.4. Có 2 quy trình xử lý mẫu khác nhau bởi vì trong q
trình thí nghiệm với dịch chiết 4 loại mẫu phấn hoa, cá khô, bim bim,
mì tơm nếu đem pha lỗng dịch chiết trực tiếp trong pha động tối ưu
để phân tích HPLC sẽ có hiện tượng tạo huyền phù, có thể kết tủa
gây tắc cột HPLC, nên so với sơ đồ 1 (Hình 2.3) thì sơ đồ 2 (Hình

2.4) cần xử lý thêm 2 bước:
+ Bước 1: dung dịch sau chiết được làm lạnh trong điều kiện
tối và kín, sau đó lọc hỗn hợp qua giấy lọc băng xanh (loại bỏ tạp
chất lơ lửng và nhất là lớp chất béo đóng trên bề mặt dịch chiết).


15
+ Bước 2: phần dung dịch thu được sau bước 1 được hấp phụ
bằng RHNS theo quy trình hấp phụ tối ưu đã nghiên cứu với chất
chuẩn. Dịch giải hấp sau đó được pha lỗng hợp lý, lọc qua syringe
0,22 µm sau đó đem phân tích trên hệ thống HPLC.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điều kiện tối ưu phân tích Auramine O bằng HPLC
Các thơng số phù hợp của phép phân tích định lượng AO bằng
phương pháp HPLC được tóm tắt trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Các điều kiện tối ưu phân tích AO bằng HPLC.
Điều kiện phân tớch
Giỏ tr
ct

C18-RP (150 mm ì 4,6 mm, 100, 5 àm) - Waters

t độ cột

40°C

tích tiêm mẫu

20 µL


c sóng

432 nm

động

PBS (pH=3; 0,2% triethylamine) : ACN

nh phần pha động

65:35 (v/v)

độ pha động

1,0 mL/phút
Phương trình đường chuẩn mơ tả sự phụ thuộc của diện tích
peak vào nồng độ AO (µg/L): Y = (103,05 ± 0,96).X, với hệ số tương
quan R2 = 0,9999. LOD=1,2 (µg/L); LOQ=3,9 (µg/L). Các giá trị
này phù hợp với sắc ký đồ của các mẫu chuẩn có nồng độ từ 10,0
µg/L AO để xây dựng đường chuẩn.
3.2. Điều kiện chiết Auramine O tối ưu từ mẫu thực phẩm
Thực nghiệm cho thấy phương pháp chiết có sử dụng rung
siêu âm cho hiệu suất thu hồi cao hơn nếu chỉ chiết bằng dung mơi ở
điều kiện thường, do đó phương pháp này được áp dụng đối với tất


16
cả các mẫu chiết về sau.
Hình
3.7: Sự

thay đổi
hiệu
suất
chiết
AO
trung
bình
theo
dung
mơi
chiết
Kết quả hiệu suất chiết khi khảo sát các loại dung môi chiết
khác nhau được trình bày trong Hình 3.7. Sử dụng chuẩn Fisher để
so sánh phương sai của hai tập số liệu chiết bằng hai dung môi
MeOH:H2O (70:30 v/v) và EtOH:H2O (70:30 v/v) thấy rằng các giá
trị tTN đều nhỏ hơn tLT nên chấp nhận hai giá trị trung bình của hiệu
suất chiết bằng hai dung mơi là khơng khác nhau. Vì vậy, dung môi
EtOH:H2O (70:30 v/v) được chọn làm dung môi chiết cho các phép
phân tích về sau vì tính chất ít độc hại của dung môi đối với các nhà
phân tích và đối với mơi trường.
Kết quả khảo sát tỉ lệ mẫu và dung môi cho thấy đối với MMT và
MIT thì khối lượng mẫu sử dụng để phân tích khoảng 0,1 gam/10 mL
dung môi chiết là chấp nhận được (hiệu suất chiết mẫu giả đều trên 95%).
Các kết quả nghiên cứu điều kiện chiết tối ưu khác bao gồm:
số lần chiết là 2 lần, mỗi lần sử dụng 5,00 mL hỗn hợp dung môi
trong thời gian 30 phút/lần ở nhiệt độ chiết duy trì 60°C.
Các kết quả xác định độ thu hồi AO trong các mẫu MIG và MAG
cho thấy độ thu hồi của phương pháp chiết đều đạt theo AOAC và theo



17
hội đồng Châu Âu (từ 80%÷110%), vậy kết luận phương pháp chiết là
phù hợp để chiết AO từ 2 nền mẫu.
Tuy nhiên, khi mở rộng phân tích các loại mẫu thực tế khác
ngoài mẫu măng và mẫu miến, và mẫu dưa chua bao gồm: mẫu mì
tơm, cá khơ, phấn hoa. Nhận thấy rằng ứng với quy trình chiết và
phân tích HPLC ở trên, thì các loại mẫu đó cho dịch chiết có hiện
tượng tạo huyền phù khi pha trong pha động HPLC và có thể gây tắc
cột sắc ký. Vì vậy, biện pháp sử dụng Nanosilica từ vỏ trấu để hấp
phụ AO trong dịch chiết được đề xuất, sau đó AO được giải hấp phụ
bằng pha động và được định lượng bằng HPLC.
3.3. Các điều kiện tối ưu hấp phụ AO trên nanosilica chế tạo từ
vỏ trấu
Kết quả thực nghiệm biểu diễn trên Hình 3.9 cho thấy hiệu
suất hấp phụ AO cao nhất khi nồng độ chất điện li trơ KCl 5 mM, do
đó KCl 5 mM là nồng độ tối ưu được lựa chọn cho các nghiên cứu
hấp phụ tiếp theo.
Sự phụ thuộc của hiệu suất hấp phụ AO vào pH của dung dịch
được trình bày trên Hình 3.10 cho thấy sự giảm hiệu suất hấp phụ
AO xảy ra rõ rệt khi pH dung dịch lớn hơn 5,0 chứng tỏ môi trường
acid thuận lợi hơn cho sự hấp phụ AO trên RHNS và đạt hiệu suất
cao nhất tại pH=4,0. Sự giảm nhẹ hiệu suất hấp phụ khi pH<4,0 có
thể giải thích do sự proton hóa AO trong mơi trường acid mạnh. Vậy
chọn pH=4,0 là giá trị pH tối ưu của dung dịch hấp phụ.
Kết khảo sát thời gian cân bằng hấp phụ cho thấy với cả 3 giá
trị nồng độ ban đầu khác nhau, thì hiệu suất hấp phụ cao nhất tại thời
gian cân bằng hấp phụ là 150 phút. Vì vậy, trong các nghiên cứu hấp
phụ tiếp theo, thời gian cân bằng hấp phụ được chọn là 150 phút.
Kết quả thực nghiệm dựa theo đường đẳng nhiệt hấp phụ



18
Langmuir xác định được dung lượng hấp phụ cực đại của AO trên
RHNS là qm = 0,371 mg/g, hằng số hấp phụ KL = 1,843.
Kết quả khảo sát thực nghiệm khi sử dụng dung môi pha động
PĐ4 để rửa giải AO trên RHNS cho thấy thời gian tối ưu để lắc hỗn hợp
là 10 phút/ lần, rửa giải 3 lần với thể tích dung mơi lần lượt là 4/3/3 ml.
Hình 3.9: Ảnh hưởng nồng độ
Hình 3.10: Ảnh hưởng pH đến sự
KCl đến sự hấp phụ AO.
hấp phụ AO.
3.4. Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích AO
Độ khơng đảm bảo đo của phương pháp:
UR%=tα,f . RSDR %= t0,05;19.2,51=1,73.2,51=4,35%.
Như vy hm lng AO t 10ữ50 àg/L thỡ khơng đảm
bảo đo của quy trình chiết – hấp phụ - giải hấp là 4,35% với độ tin
cậy 95%. Điều này có nghĩa là các kết quả phân tích hàm lượng AO
với độ lệch <4,35% có thể chấp nhận được.
3.5. Kết quả phân tích AO trong mẫu thực
Các mẫu măng, miến, dưa chua được xử lý theo quy trình
được trình bày trong sơ đồ 1 (hình 2.3), quy trình chiết tối ưu được
áp dụng theo kết quả nghiên cứu trong mục 2. Kết quả phân tích hàm
lượng AO trong các mẫu được trình bày trong bảng 3.18.
Bảng 3.18: Hàm lượng AO trong các mẫu măng, miến, dưa chua
Hàm lượng AO
Hàm lượng AO
ST
ST
Mẫu
trong mẫu khơ

Mẫu
trong mẫu khơ
T
T
(µg/g)
(µg/g)
MAK
1
MA1
12,5 ± 0,2
8
ND
8
2
MA2
0,8 ± 0,1
9
MI1
2,1 ± 0,1
3
MA3
1,7 ± 0,2
10
MI2
1,1 ± 0,2
4
MA4
ND1
11
MI3

ND
1 ND : Không phát hiện AO trong mẫu


19
5
6

MA5
MA6
MAK
7
7
Nhận xét: Thời

ND
ND

12
13

MD1
MD2

ND
ND

ND
gian lưu AO của các mẫu thực tương đối ổn


định (từ 3,74 phút đến 3,83 phút). Hàm lượng AO trong mẫu MA1
được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, do nếu cô đặc dịch
chiết đường nền khá nhiễu và ảnh hưởng đến độ chính xác của
phương pháp xác định.
Đối với sắc kí đồ MA6 dịch chiết gốc, có một đỉnh peak xuất
hiện tại thời gian lưu 3,56 phút, tuy nhiên đây không phải peak của
AO, thể hiện rằng khi thêm chuẩn AO, peak của AO xuất hiện sau
(tại thời gian lưu 3,97 phút). Như vậy thành phần các chất trong mẫu
thực có ảnh hưởng đến thời gian lưu của chất định phân dù trong
cùng một điều kiện phân tích HPLC.
Tiến hành phân tích với quy trình tương tự với các mẫu cá
khơ, phấn hoa, mì tơm cịn lại. Kết quả phân tích được trình bày
trong Bảng 3.20.
Bảng 3.20 Kết quả phân tích hàm lượng AO trong các mẫu mì tơm,
ST
T
1
2
3
4
5

Mẫu
PH1
PH2
PH3
CK1
CK2
Kết quả


phấn hoa, cá khơ.
Hàm lượng AO
Hàm lượng AO
ST
trong mẫu khơ
Mẫu
trong mẫu khơ
T
(µg/g)
(µg/g)
ND2
6
CK3
ND
ND
7
MT1
ND
0,82 ± 0,19
8
MT2
ND
ND
9
MT3
ND
ND
phân tích cho thấy hầu hết các mẫu phấn hoa, cá khô

2 ND : Không phát hiện.



20
và mì tơm được phân tích khơng phát hiện chứa Auramine O.
3.6. Điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan bằng HPLC
Các điều kiện tối ưu cho quy trình phân tích hỗn hợp Sudan I
và Sudan II được trình bày trong Bảng 3.23.
Bảng 3.23: Các điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan
II bằng phương pháp HPLC.
Điều kiện phân
Giá trị
tích
Loại cột
C18-RP (150 mm × 4,6 mm, 100Å, 5 µm) Waters
Nhiệt độ cột
40°C
Thể tích tiêm mẫu

20 µL

Bước sóng

490 nm

Pha động

MeOH :H2O: ACN (77:3:20 v/v/v)

Tốc độ pha động


1,0 mL/phút

Khoảng tuyến tính, đường chuẩn, LOD và LOQ
Các kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đường
chuẩn trên mẫu chuẩn được trình bày trong Bảng 3.24
Bảng 3.24: Số liệu đường chuẩn và LOD, LOQ của hỗn hơp 2 Sudan chun.
Khong
Cht
H s
LOD
LOQ
tuyn
Phng trỡnh
phõn
tng
(àg/L (àg/L
tớnh
ng chun
2
tớch
quan R
)
)
(àg/L)
Suda
2ữ
S = (69,50
0,9991
2,73
9,11

nI
10000
0,32).C
Suda
5ữ
S = (76,03 ±
0,9991
2,99
9,96
n II
10000
0,39).C
Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ các Sudan được thêm vào
trên nền mẫu trắng đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu được trình


21
bày trong Bảng 3.25.
Bảng 3.25: Số liệu đường chuẩn và MDL, MQL trên nền mẫu trắng.
Khoảng
Chất
Hệ số
tuyến
Phương trình
MDL
MQL
phân
tương
tính
đường chuẩn

(µg/g) (µg/g)
tích
quan R2
(àg/L )
Sudan 2ữ1000
S= (69,17
0,002 0,007
0,9994
I
0
0,59).C
2
4
Sudan 5ữ1000
S= (75,70
0,002 0,009
0,9991
II
0
0,37).C
9
6
So sánh với số liệu LOD, LOQ của các cơng trình đưa ra trong
Bảng 1.5 có thể thấy giới giạn phát hiện Sudan I của phương pháp
tương đương với kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Thị Ngoan và
cộng sự, nhỏ hơn 2,5 lần so với kết quả nghiên cứu của tác giả Ping
Qi và cộng sự.
3.7. Điều kiện chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II tối ưu từ mẫu
thực phẩm
Kết quả khảo sát các điều kiện chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan

II như sau:
- Phương pháp chiết rung siêu âm.
- Dung môi chiết: lựa chọn dung môi EtOH 100% do hiệu suất
chiết khi sử dụng dung môi này là cao nhất (97,26% với Sudan I và
93,79% với Sudan II) (xem bảng 3.25).
- Nhiệt độ chiết 60°C, thời gian chiết tối ưu 120 phút, số lần
chiết: 2, thể tích dung mơi 10 mL, tỉ lệ khối lượng mẫu/ thể tích dung
mơi phù hợp nhất là khoảng 0,1000 gam mẫu/ 10 mL dung môi.
3.8. Các điều kiện tối ưu hấp phụ hỗn hợp Sudan trên nanosilica
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lực ion trong dung dịch hấp phụ
được duy trì bằng muối trơ KCl cho thấy nồng độ KCl tối ưu là 1mM.


22
pH của dung dịch cũng ảnh hưởng đến điện tích bề mặt của
nanosilica và sự phân ly của thuốc nhuộm Sudan. Hiệu suất hấp phụ
Sudan lên vật liệu RHNS trong khoảng pH = 2 đến pH = 6 được thể
hiện trên Hình 3.31.Kết quả cho thấy tại pH = 3 hiệu suất hấp phụ
Sudan của RHNS là tốt nhất. Do đó, pH = 3 là giá trị pH tối ưu được
lựa chọn cho quá trình hấp phụ của thuốc nhuộm Sudan trên RHNS.
Kết quả hiệu suất hấp phụ được trình bày trên Hình 3.32 cho
thấy, ở các giá trị nồng độ ban đầu khác nhau, thời gian hấp phụ tối
ưu được lựa chọn là 120 phút. Kết quả cũng cho thấy: chọn thời gian
hấp phụ cho các thí nghiệm khác là 120 phút, khi nồng độ chất hấp
phụ vượt quá 1000 µg/L, hiệu suất hấp thụ thuốc nhuộm Sudan bị
giảm. Do đó, chúng tơi chọn khảo sát sự hấp phụ chất màu với nồng
độ các Sudan nhỏ hơn 1000 µg/L.
Các đường đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir của từng chất màu
được xây dựng. Hệ số tương quan (R2) mô tả sự phù hợp tuyến tính
của đường đẳng nhiệt hấp phụ lớn hơn 0,99 cho thấy rằng các thuốc

nhuộm được hấp phụ bởi hấp phụ vật lý đơn lớp đối và các tâm hấp
phụ trên bề mặt là đồng nhất. Dung lượng hấp phụ tối đa (q m) và
hằng số hấp phụ (KL) đối với Sudan I lần lượt là 0,619 mg/g và 2,132
và của Sudan II lần lượt là 0,699 mg/g và 1,573.


23
Hình 3.30: Ảnh hưởng của lực
ion đến hiệu suất hấp phụ các
Sudan.

Hình 3.31: Hiệu suất hấp phụ các
Sudan khi thay đổi pH của dung
dịch.

Kết quả khảo sát thời gian rửa giải và số lần rửa giải tối ưu đối
với hỗn hợp chất Sudan I và Sudan II được trình bày trong hình 3.36
và hình 3.37. Theo đó, thời gian rửa giải gấp 3 lần (từ 10 phút lên 30
phút) hầu như không làm ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thu hồi. Để
tiết kiệm thời gian phân tích, chọn thời gian rửa giải 10 phút cho mỗi
mẫu sau khi hấp phụ hỗn hợp Sudan lên RHNS.
Hình 3.36: Hiệu suất thu hồi các Sudan theo thời gian rửa giải
Hình 3.37: Hiệu suất thu hồi các Sudan theo số lần rửa giải
Theo hình 3.37, số lần rửa giải có ảnh hưởng đến hiệu suất thu
hồi các Sudan. Cụ thể, hiệu suất thu hồi tăng 2,51% khi rửa giải 3 lần
so với rửa giải 1 lần (với Sudan I), tăng 2,74% khi rửa giải 3 lần so
với rửa giải 1 lần (với Sudan II). Như vậy chọn số lần rửa giải là 3
(p3) với thể tích dung mơi rửa giải lần lượt là 4ml, 3ml, 3ml, mỗi lần
rửa giải 10 phút.
3.9. Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích hỗn hợp

Sudan
Độ khơng đảm bảo đo Sudan I của phương pháp:


24
UR%=tα,f . RSDR %= t0,05;19. RSDR %=1,73.3,62=6,26%.
Độ không đảm bảo đo Sudan II của phương pháp:
UR%=tα,f . RSDR %= t0,05;19. RSDR %=1,73.4,53=7,84%.
Như vậy ở hàm lượng Sudan I và Sudan II t 10ữ100 àg/L thỡ
khụng m bo o ca quy trình chiết – hấp phụ - giải hấp lần
lượt là 6,26% và 7,84% với độ tin cậy 95%. Điều này có nghĩa là các
kết quả phân tích hàm lượng Sudan I với độ lệch <6,26%, Sudan II
với độ lệch <7,84% có thể tin cậy được.
3.10. Kết quả phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu
thực phẩm
Do dịch chiết của các mẫu thịt khô không tạo ra huyền phù khi
trộn trong pha động của HPLC, nên có thể phân tích trực tiếp trên
thiết bị HPLC mà khơng cần qua công đoạn hấp phụ bởi RHNS. Tuy
nhiên, dịch chiết các mẫu bim bim (ví dụ mẫu MBB1 – Hình 3.34)
đều có phản ứng tạo huyền phù với pha động và việc phân tích trực
tiếp có thể làm hỏng cột sắc ký. Vì vậy, việc tách có chọn lọc hỗn
hợp thuốc nhuộm từ dịch chiết các mẫu bim bim trước khi phân tích
HPLC là một giải pháp có ý nghĩa thiết thực.
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng Sudan I và Sudan II
trong các mẫu thịt khô BK1, BK3 và mẫu bim bim MBB4 theo tính
tốn thì thấp hơn LOD (kể cả khi đã làm giàu vẫn không xuất hiện
tín hiệu mẫu). Tất cả các mẫu cịn lại đều chứa Sudan I và Sudan II
trên giới hạn phát hiện Dựa trên kết quả định lượng Sudan I và
Sudan II từ dung dịch chiết và dung dịch giải hấp bằng phương pháp
HPLC, hàm lượng (µg/g) của Sudan I và Sudan II trong các mẫu

thực phẩm khô ban đầu được đưa ra trong Bảng 3.30.


25