BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

VŨ THỊ NGÂN
Mã sinh viên: 1701411

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ
HỢP CHẤT TỪ CÂY HỒNG RỪNG (DIOSPYROS KAKI
THUNB. VAR. SILVESTRIS MAKINO)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS Nguyễn Mạnh Tuyển
2. DS. Nguyễn Hồng Thịnh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược học cổ truyền

HÀ NỘI - 2022


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm,
giúp đỡ, động viên, chỉ bảo tận tình từ gia đình, thầy cơ giáo và bạn bè.
Đầu tiên với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển, người đã dìu dắt em từ những ngày đầu làm khóa
luận, tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Nguyễn Hồng Thịnh cùng các thầy cô, các anh
chị kĩ thuật viên đang công tác tại Bộ môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược
Hà Nội đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm khóa luận.
Em xin cảm ơn DS. Nguyễn Hồng Thịnh, DS. Sengkham Choumlivong,
Nguyễn Hải Yến, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Trần Thị Tho, Nguyễn Thị Hiền đã

động viên, đồng hành, truyền động lực cho em để em có thể hồn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo
môi trường học tập, tận tình giảng dạy truyền tải cho em tri thức quý báu trong suốt 5
năm ngồi trên ghế nhà trường.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp
đỡ, an ủi em để em có thể tiếp tục thực hiện và hồn thành khóa luận.
Do điều kiện chủ quan và khách quan, khóa luận khó tránh khỏi thiếu sót, em rất
mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cơ và hội đồng để khóa luận được hoàn
thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 27 tháng 06 năm 2022
Sinh viên

Vũ Thị Ngân


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. 6
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................. 7
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ....................................................................................... 8
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về chi Hồng rừng (Diospyros L.) ........................................................ 2
1.1.1. Vị trí phân loại ................................................................................................ 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Hồng rừng (Diospyros L.) ................................... 2
1.1.3. Đa dạng và phân bố của chi Diospyros L. ...................................................... 2
1.1.4. Thành phần hóa học của chi Diospyros L. ..................................................... 3
1.1.5. Tác dụng sinh học của chi Diospyros ............................................................. 4
1.2. Tổng quan về cây Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb.var. silvestris Makino)..... 4
1.2.1. Đặc điểm thực vật của loài Diospyros kaki .................................................... 4

1.2.2. Thành phần hóa học của lồi Diospyros kaki ................................................. 5
1.1.3. Tác dụng sinh học ........................................................................................... 7
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 7
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ..................................................................... 7
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 7
2.1.2. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................................... 8
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 9
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 9
2.3.1. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn ............................................. 9
2.3.2. Phân lập các hợp chất ................................................................................... 10
2.3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất ..................................................................... 11
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 11


3.1. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn từ lá cây Hồng rừng ................ 11
3.2. Phân lập một số hợp chất từ lá cây Hồng rừng ................................................... 11
3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ................................................... 14
3.4. Bàn luận .............................................................................................................. 23
3.4.1. Về phương pháp chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn ................ 23
3.4.2. Về phương pháp phân lập các hợp chất ........................................................ 23
3.4.3. Về các hợp chất phân lập được ..................................................................... 23
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 1
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 4


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AA


: Arachidonic acid

BuOH

: Butanol

CC

: Column Chromatography

cv.

: cultivar

D.

: Diospyros

ESI-MS

: ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc

: ethyl acetat

EtOH

: ethanol


HPLC

: High Performance Liquid Chromatography

MeOH

: methanol

NMR

: nuclear magnetic resonance

Rha

: L-rhamnopyranose

SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

TLC

: Thin Layer Chromatography


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 So sánh dữ liệu NMR của hợp chất 1 với tài liệu tham khảo

Tr. 14


Bảng 3.2 So sánh số liệu NMR của hợp chất 2 với tài liệu tham khảo

Tr. 19


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1

Các hợp chất được phân lập từ lồi Diospyros kaki

Tr. 5

Hình 2.1

Sơ đồ chiết xuất phân đoạn

Tr. 10

Hình 3.1

Sơ đồ quy trình chiết xuất và phân lập từ phân đoạn ethyl
acetat, n-butanol lá cây Hồng rừng

Tr. 12

Hình 3.2

Sắc ký đồ của phân đoạn 2H-54 và hợp chất HR2


Tr. 13

Hình 3.3

Sắc ký đồ của phân đoạn n- Butanol và hợp chất HB3

Tr. 13

Hình 3.4

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HR-2

Tr. 15

Hình 3.5

Dữ liệu HPLC của hợp chất HR2

Tr. 18

Hình 3.6

Cơng thức cấu tạo của hợp chất 1 (HR2)

Tr. 18

Hình 3.7

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HB3


Tr. 20

Hình 3.8

Dữ liệu phổ MS của hợp chất HB3

Tr. 22

Hình 3.9

Dữ liệu phổ MS của hợp chất HB3

Tr. 22

Hình 3.10

Cơng thức cấu tạo của hợp chất 3 (HB3)

Tr. 22

Hình 3.11

Ảnh TLC khảo sát hệ dung mơi

Tr. 25


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, thuốc có nguồn gốc thảo dược nói chung và Y học cổ truyền nói riêng

đã và đang được đẩy mạnh khai thác bởi những đặc tính vượt trội như hiệu quả và tính
an tồn. Bên cạnh đó, các dược liệu cũng chính là nguồn ngun liệu phong phú trong
lĩnh vực bán tổng hợp các thuốc hóa dược bởi có những hợp chất tổng hợp hóa dược
khơng làm được hoặc khó làm được, nhưng lại dễ dàng chiết xuất từ dược liệu, từ đó
tiết kiệm được chi phí, thời gian và cơng sức trong q trình nghiên cứu và phát triển
thuốc mới. Chính vì vậy, việc triển khai mạnh mẽ nghiên cứu khoa học, ứng dụng kết
quả nghiên cứu vào xây dựng nguồn nguyên liệu và hiện đại hóa y học cổ truyền là yêu
cầu tất yếu trong tình hình hiện nay.
Hồng rừng từ lâu đã được ứng dụng trong các bài thuốc cổ truyền với nhiều công
dụng khác nhau được ghi nhận ở các quốc gia châu Á. Lá của Hồng rừng là một loại
thuốc cổ truyền của Trung Quốc, đã được sử dụng nhiều năm trong bài thuốc điều trị
đột quỵ, thiếu máu cục bộ [11] và được sử dụng như một loại thuốc hạ áp trong y học
cổ truyền Nhật Bản [23], [29]. Ở Việt Nam, cây Hồng rừng (Diospyros kaki Thunb. var.
silvestris Makino) tồn tại và phát triển tự nhiên trên địa bàn Lào Cai, được tri thức bản
địa dùng trong các bài thuốc chống viêm, hạ đường huyết. Các nghiên cứu về hóa thực
vật của dược liệu này trên thế giới cịn tương đối ít. Vì vậy với mong muốn tiếp tục hồn
thiện cơ sở dữ liệu thành phần hóa học và tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo, khóa
luận “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây
Hồng rừng ( Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino)” được thực hiện với mục
tiêu:
 Chiết xuất cao toàn phần và cao các phân đoạn từ lá cây Hồng rừng.
 Phân lập và xác định cấu trúc 1 -2 hợp chất từ lá cây Hồng rừng.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Diospyros L.
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Armen L. Takhtajan (2009) chi Diospyros L. có

vị trí phân loại như sau [25]:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Sổ (Dillenianae)
Liên bộ Đỗ quyên (Ericanae)
Bộ Thị (Ebenales)
Họ Thị (Ebenaceae)
Chi Diospyros L.
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Dyospyros L.
Cây gỗ hoặc cây bụi, rụng lá hoặc thường xanh lá. Lá mọc so le, nguyên [2]. Thỉnh
thoảng có các vết mờ rải rác hoặc có các vết rỗ lớn [22], [25].
Hoa thường đơn tính, khác gốc hoặc cùng gốc; hiếm khi lưỡng tính. Hoa đực mọc
thành xim ở nách lá; nhị từ 4 đến rất nhiều, thường kết hợp thành hai vòng xoắn. Hoa
cái thường đơn độc, mọc ở nách lá; nhị lớp 1-16 hoặc khơng có; bầu thường có 2-6. Đài
hoa thường có 3-7 thùy. Tràng hoa hình chum, hình chng, hoặc hình ống, 3-7 thùy
rụng sớm. Quả thịt, mang đài to không rụng. Hạt 1-10 (hoặc hơn), thường hẹp theo bề
ngang [25].
1.1.3. Đa dạng và phân bố của chi Diospyros L.
Chi Diospyros L. là chi lớn nhất trong họ Ebenaceae, có khoảng 500 lồi, phân
bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới (Ở Châu Á có tới 200 lồi) và một số nơi thuộc khu vực
ơn đới, trong đó đa dạng nhất là khu vực Đơng Nam Á, chỉ có một số lồi ở Tây Á, Nhật
Bản và Đơng Nam nước Mỹ [22]. Trung Quốc có 60 lồi nhiều nhất ở Đơng Nam và
Tây Nam Trung Quốc [25]. Ở Việt Nam, chi Diospyros L. có khoảng 70 loài [2]. Trong

2


đó có 9 lồi cho gỗ có giá trị sử dụng, hai lồi có quả ăn được là Hồng (D. kaki L.f.) và
Cậy (D. lotus L.) [6].
1.1.4. Thành phần hóa học của chi Dyospyros L.

Chi Diospyros L được báo cáo là có khoảng 300 hợp chất thuộc các nhóm hợp
chất hóa học khác nhau đã được phân lập và xác định cấu trúc.
Nhóm triterpen là nhóm phổ biến nhất được tìm thấy trong chi Diospyros L. bao
gồm các chất đã được phân lập như: Peregrinol, taraxerol,...Các naphthoquinon phân bố
và được tìm thấy tích lũy với số lượng đáng kể trong một số loài Diospyros L. Các
flavonoid được phân lập từ chi Diospyros L cho đến nay tất cả đều thuộc về phân lớp
3,5,7-trihydroxyflavon [16].
Các hydrocarbon và chất béo: hexacosane, nonacosane, hentriacontane,
tritriacontane, hexacontanol, hentriacontanol, acid heptacosanonic, acid lauric, acid
myristic, acid palmitic, acid stearic, acid arachidic, acid hexanoic, n-triacosane, npentacosane, nonadecan-7-ol-2-one, 8-hydroxyctadec-10-enoic acid, 9-keto-cis-13octadecenoic acid, acid malvalic, acid sterculic, acid oleic, acid linoleic.
Các amino acid: alanine, hydioxyproline, acid aspartic, L-citruline, cystine, ...
Các carotenoids: antheraxanthin, α-carotene; β, β’-carotene, ...
Các đường: D-lactose, sucrose, D-galactose, L-sorbose, ...
Các hợp chất khác: delphinidin, cyanidin, vitamin A, acid gallic, acid ascorbic, acid
indole acetic, eugenol, p-cresol, methyl-4-pentenoate, 2-hexenal, ...
Cấu trúc hóa học các nhóm hợp chất được phân lập từ các loài thuộc chi
Diospyros L. [16] (phụ lục 2).

3


1.1.5. Tác dụng sinh học của chi Diospyros L.
Các bộ phận của chi Diospyros L. thuộc họ Ebenaceae trong kinh nghiệm của
người dân đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, bao gồm trị xuất huyết, tiểu khơng
kiểm sốt, mất ngủ, nấc cụt, tiêu chảy [11], [22]… Các hoạt tính sinh học của các loài
thuộc chi này như chống oxy hóa, chống viêm, giảm đau, hạ sốt, trị đái tháo đường,
kháng khuẩn, tẩy giun sán, hạ huyết áp... đã được chứng minh bằng các phương pháp
in vitro, in vivo và các thử nghiệm lâm sàng [19]. Một số nghiên cứu đã được công bố:
Năm 2003, Trongsakul và cộng sự đã chứng minh cao chiết n-hexan của rễ từ
loài Diospyros variegata Kruz ở liều 150mg/kg cho thấy tác dụng chống viêm trên mơ

hình gây viêm bằng ethyl phenylpropiolat (EPP) và gây phù nề trên chuột nhắt trắng
do acid arachidonic (AA) kết quả cho thấy có tác dụng chống viêm đến 93% và chống
phù nề đến 91% [27].
Năm 2014, Uddin và cộng sự đã chứng minh cao chiết chloroform, diospyrin,
8-hydroxyisodiospyrin của rễ Diospyros lotus L. có tác dụng chống viêm rõ rệt. Chiết
xuất chloroform (77,43%), diospyrin (80,54%) và 8-hydroxyisodiospyrin (75,87%)
bảo vệ phù chân carrageenan sau giờ thứ 3 [28].
1.2. Tổng quan về loài Diospyros kaki
1.2.1. Đặc điểm thực vật của loài Diospyros kaki
- Tên khoa học: Diospyros kaki Thunb. var. silvestris Makino - Chi Diospyros L.
- Họ Thị (Ebenaceae).
Cây gỗ lớn cao 5 - 7m. Vỏ cây già có màu nâu đỏ, sần sùi, thi thoảng có đốm
trắng; thân non màu xanh, phủ lông dày mịn màu trắng. Lá đơn, mọc sole. Cuống phủ lơng
dày, ngắn, mịn, màu trắng. Phiến lá hình bầu dục, hoặc hình trứng, mặt dưới màu xanh
nhạt, mặt trên màu xanh đậm, cả 2 mặt phủ lông dày đặc, mềm, màu trắng. Gốc lá trịn,
hình tim hoặc cụt; ngọn lá tròn, tù hoặc hơi nhọn; mép lá nguyên. Gân lá hình lơng chim,
gân chính nổi rõ ở mặt dưới, gân có mang lơng dày đặc, mềm, màu trắng.Hoa mọc đơn
độc ở nách lá, lưỡng tính hoặc đơn tính đực. Cuống dài 0,1- 0,3cm phủ lông dày, ngắn,
mịn, màu trắng. Hoa lưỡng tính đều. Đài 4 hàn liền ở gốc, phần trên chia làm 4 thùy
hình bầu dục, màu xanh, mặt trong nhẵn, mặt ngồi phủ lơng; thùy hình bầu dục, mép
4


thùy uốn cong ra phía ngồi; Tràng 4 hàn liền, phía trên chia làm 4 thùy hình bầu dục;
màu trắng xanh, bên ngồi phủ lơng, phía trên nhiều lơng hơn ở gốc tràng. Nhị 8, rời,
hình dải, màu xanh nhạt phủ lông dày đặc, mềm, màu trắng, bao phấn dài dọc theo chỉ
nhị, nứt bên. Bầu hàn liền hình cầu dẹt, màu vàng nhạt; gốc bầu nhẵn, phía trên vịi nhụy
4 phủ lông dày đặc, mềm, màu trắng; mặt cắt ngang bầu có 8 ơ mang 8 nỗn. Hoa đơn
tính đực đều. Đài 4 hàn liền ở gốc, phần trên chia làm 4 thùy hình bầu dục, màu xanh,
mặt trong nhẵn, mặt ngồi phủ lơng; thùy hình bầu dục, mép thùy uốn cong ra phía

ngồi; Tràng 4 hàn liền, phía trên chia làm 4 thùy hình bầu dục; màu trắng xanh, bên
ngồi phủ lơng, phía trên nhiều lơng hơn ở gốc tràng; Nhị nhiều (19 nhị), rời, hình sợi,
màu xanh nhạt mang các lông dày, mềm, màu trắng; bao phấn dài dọc theo chỉ nhị, nứt
dọc.Quả đơn, hình cầu, màu xanh đường kính 3 - 5 cm, khi chín có màu vàng có 4 đài
tồn tại. Hạt dẹt màu nâu đỏ, kích thước 1,2 cm × 2,0 cm [3].
1.2.2. Thành phần hóa học của lồi Diospyros kaki
Năm 1996, Paknikar và cộng sự đã phân lập được hai dẫn xuất 4-hydroxy-5methylcoummarin từ rễ của Diospyros kaki Thunb.var. silvestris Makino [17]:

(152)

(153)

Năm 2005, Wang Chen và cộng sự công bố một dẫn xuất biphenyl mới từ lá
Diospyros kaki được đặt tên là kakispyrol (154) [9]:

(154) 4’ ,5-dimethoxy-3- β -D-glucopyranosyloxy-4-hydroxy-biphenyl
Đến năm 2007, Wang Chen và cộng sự phân lập thêm 2 hợp chất mới được đặt
tên lần lượt là kakispyrone (155) và kakisaponin A (156) [8]:

5


(155) 4,6-dihydroxy-2-O-β-Dglucopyranosylbenzophenone

(156) kakisaponin A

Năm 2008 PGS. TS. Phương Thiện Thương và cộng sự đã phân lập được 2
triterpenoid loại ursane mới [26]:

(157) 3α,19α -dihydroxyurs-12,20(30)dien-24,28-dioic acid


(158) 3α,19α -dihydroxyurs-12-en-24,28dioic acid

Năm 2019, Văn Thùy Linh đã phân lập được 4 hợp chất [3]:

(159) Quercetin

(160) Quercetrin

(161) 4’-O-methyl myricetin

(162) 3-O-β-arabinofuranosid-4’methoxy myricetin
6


Năm 2021, Jaeyoung Kwon và cộng sự đã phân lập được trong lá loài Diospyros
kaki từ phân đoạn ethyl acetate 1 flavonoid (163) và 1 hợp chất tự nhiên mới (164) [13]:

(163) kaempferol-3-O-β-2”-coumaroylgalactosid
(164) kaempferol-3-O-β-D-2”-feruloylglucosid

R1
β-OH
α-OH

R2
H
OCH3

Hình 1.1. Các hợp chất được phân lập từ loài Diospyros kaki

1.1.3. Tác dụng sinh học
Lá hồng (Diospyros kaki Thunb.) thường được sử dụng như là một chất cầm máu.
Năm 1956, trong báo cáo của Yamashita cho thấy dịch chiết lá hồng có tác dụng làm
giảm chảy máu niêm mạc và ngăn ngừa loét đường tiêu hóa [29].
Năm 2019, Văn Thùy Linh đã đã sàng lọc được cao phân đoạn ethyl acetat của lá
Diospyros kaki Thunb.var. silvestris Makino có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất.
Phân lập và thử hoạt tính 4 chất phân lập được từ cao phân đoạn ethyl acetate. Các chất
phân lập được đều có tác dụng dọn gốc tự do DPPH [3].
Năm 2020, Direito và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh tác dụng chống viêm
từ dịch chiết lá Diospyros kaki. Dịch chiết cho thấy tác dụng giảm mức độ viêm mãn
tính và đặc tính tổn thương mơ ở chuột [10].
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là Lá của cây Hồng rừng thu hái vào tháng 7 năm 2021 tại
Sapa, Lào Cai (vùng trồng cây Hồng rừng của ThS. Văn Thùy Linh đã nghiên cứu năm
2019). Mẫu được giám định tên khoa học là Diosspyros kaki Thunb. var. silvestris
Makino. Có 05 tiêu bản số hiệu LH Linh 01, thu ngày 01/4/2019 tại vườn Quốc gia
Hoàng Liên; tiêu bản gồm cành mang hoa đực, được lưu giữ tại phòng tiêu bản thực vật
(HN), thuộc phòng Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật theo Phiếu giám
định tên khoa học (Phụ lục 1).
7


2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất và dụng cụ
-

Hóa chất: Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP18
F254s (Merck), chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 µm, Merck), pha

đảo RP-18 (30 - 50 µm, Merck). Dung mơi cơng nghiệp n-hexan, ethyl acetat
(EtOAc), n-butanol, dichloromethan (CH2Cl2), methanol (MeOH), ethanol (
EtOH), H2SO4 đặc 98%, HCl đặc 95%, nước cất (H2O).

-

Các hóa chất thuốc thử khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược
điển Việt Nam V.

-

Dụng cụ:
Các loại cột dùng cho sắc ký cột có đường kính x chiều cao: 11x64cm,
2x45cm, 1x45cm.
Bình cầu đáy trịn các loại (50 – 2000 ml).
Bình gạn (125 – 2000 ml).
Ống đong các loại (10 – 2000 ml)
Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: giấy lọc, phễu lọc, cốc có mỏ, bình nón,
ống nghiệm, pipet, mao quản, bình khai triển sắc ký…

2.1.2.2. Phương tiện và máy móc
-

Sắc ký cột dùng chất hấp phụ là silica gel F254 cỡ hạt 63 - 200 µm (Merck), silica
gel pha đảo RP-18 (30 – 50 µm, Merck).

-

Máy đo phổ khối LCMS8045 của Shimadzu, Nhật Bản.


-

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13

C-NMR) của hãng Bruker

(500MHz), Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, VAST.
-

Máy cơ quay 5 lít và 20 lít của BÜCHI, Thụy Sĩ.

-

Bể siêu âm WiseClean (Hàn Quốc), máy siêu âm Elmasonic S ( Đức).

-

Bếp cách thủy BATHS.

-

Tủ sấy Memmert (Đức).

-

Đèn tử ngoại hai bước sóng 254nm và 365nm (Pháp).

-


Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C. Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (Precisa, Thụy
Sỹ).

8


2.2. Nội dung nghiên cứu
-

Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn lần lượt là n-hexan, ethyl acetat,
n-butanol, nước của lá cây Hồng rừng.

-

Phân lập một số hợp chất ở phân đoạn n-butanol, ethyl acetat của lá cây Hồng
rừng.

-

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn
Chiết cao toàn bằng phương pháp chiết rắn lỏng.
Chiết các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần của dung môi.
Lá được làm sạch, sấy ở nhiệt độ 55oC để đạt độ ẩm < 10%, sau đó được nghiền thô
bằng thuyền tán, chiết bằng phương pháp chiết siêu âm với dung môi ethanol 96%; cất
thu hồi dung mơi được cắn gọi là cao tồn phần. Cao tồn phần đem hòa vào lượng nước
cất vừa đủ, rồi lần lượt chiết phân đoạn với dung mơi có độ phân cực tăng dần (theo thứ

tự lần lượt là n-hexan; ethyl acetat; n-butanol). Cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu
được cắn n-hexan (cắn Hexan); cắn ethyl acetat (cắn EtOAc); cắn n-butanol (cắn
BuOH); dịch nước. (Hình 2.1)

9


Dược liệu
- Chiết với ethanol 96%, 3 lần x 30 phút/ lần
- Thu hồi dung mơi
Cao tồn phần
- Phân tán trong nước
- Chiết với n-hexan (3 lần)
-

Thu hồi dung môi
Phân đoạn nước

Phân đoạn

- Chiết với ethyl acetat (3 lần)

n-hexan

- Thu hồi dung môi
Phân đoạn
ethyl acetat

Phân đoạn nước
- Chiết với n-butanol (3 lần)

- Thu hồi dung mơi
Phân đoạn
n-butanol

Phân đoạn nước

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn
2.3.2. Phân lập các hợp chất
Phân đoạn ethyl acetat, n-butanol được cho chạy qua sắc ký cột silica gel pha
thường (Merck), sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18. Sắc ký lớp mỏng được thực hiện
trên bản mỏng tráng sẵn 60GF254 (Merck), RP-18 (Merck). Sắc ký lớp mỏng dùng để
theo dõi vết các chất từ các phân đoạn. Sắc ký đồ (TLC) được quan sát dưới đèn tử ngoại
ở bước sóng 254nm và 365nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong
ethanol.
a) Sắc ký cột (CC)
Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành
phần trong mẫu với hai pha khơng trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh
là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh, lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc
vào độ phân cực của mẫu cần tách. Có thể triển khai liên tục với các hệ dung mơi khác
nhau có độ phân cực tăng dần. Chất nhồi cột là silica gel pha thường hoặc silica gel pha
đảo.
b) Sắc ký lớp mỏng (TLC)
10


Được sử dụng để thăm dị hệ dung mơi tách và theo dõi quá trình rửa giải.
Nguyên tắc: dựa trên cơ chế hấp phụ. Chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng
sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định. Quá trình chạy
sắc ký phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong
chất phân tích sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau.

Bản mỏng: sắc ký TLC được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn pha thường silica
gel F254 (Merck), pha đảo RP18 F254s (Merck).
Hiện màu bản mỏng: sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 và 365 nm hoặc bản mỏng được phun dung dịch acid sulfuric 10% trong
EtOH sau đó sấy nóng bản mỏng ở 110 độ C trong khoảng 5 - 7 phút.
2.3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất hóa lý (trạng
thái, màu sắc, ...) và dữ liệu phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,
13

C-NMR) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn từ lá cây Hồng rừng
Lá cây Hồng rừng ( 4,5kg) được làm sạch, nghiền nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 550C đến
độ ẩm dưới 10%, chia vào 3 bình thủy tinh (dung tích 10 lít) tiến hành ngâm với ethanol
96% (8 lít/bình x 3 lần) ở nhiệt độ thường (24 giờ). Sau đó tiếp tục ngâm ở 450C (24
giờ). Siêu âm 3 lần x 30 phút, mỗi lần cách nhau 30 phút. Ngay sau lần siêu âm cuối,
mang bình chiết đi thu dịch lọc, gộp dịch lọc, và loại bỏ dung mơi dưới áp suất giảm thu
được cao tồn phần (886g). Cao tồn phần được chia làm 3 phần, hịa tan mỗi phần vào
1 lít nước cất, sau đó mỗi phần chiết lần lượt với dung mơi n-hexan (0,5 lít × 3 lần),
EtOAc (0,5 lít × 3 lần), và n-butanol (0,5 lít × 3 lần). Tiến hành thu hồi dung môi dưới
áp suất giảm theo từng phân đoạn. Thu được các cao phân đoạn n-hexan (317g) , EtOAc
(103g) và n-butanol(126g), phân đoạn nước (204g). (Hình 3.1)
3.2. Phân lập một số hợp chất từ lá cây Hồng rừng
Phân đoạn EtOAc (103g) được chạy qua cột sắc ký (11 x 64 cm) pha tĩnh là silica
gel, rửa giải bằng hệ dung môi DCM- MeOH (50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 v:v) thu được
10 phân đoạn nhỏ (1A-1K). Phân lập phân đoạn 1G (2,02 g) bằng sắc ký cột pha thuận
với hệ dung môi DCM - aceton (4:1, v/v) thu được các phân đoạn (2A-2K). Phân đoạn
11



2H (0,45g) cho qua cột sắc ký cột pha đảo YMC (2 x 45 cm) với hệ dung môi rửa giải
aceton - H2O (3:2, v/v) thu được 72 phân đoạn( 2H-1 – 2H72), trong đó phân đoạn 2H64 thu được hợp chất 1 (15mg) ( kí hiệu HR-2). (Hình 3.1)
Phân đoạn n-butanol (126g) được chạy qua cột sắc ký thường (11 x 64 cm) pha
tĩnh là silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi DCM- MeOH (50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1
v:v) thu được các phân đoạn nhỏ (3A-3K). Phân lập phân đoạn 3K bằng sắc ký cột pha
thuận với hệ dung môi DCM - MeOH (50:1, v/v) thu được 138 phân đoạn nhỏ (3K-1 –
3K-138), trong đó phân đoạn 3K-121 thu được hợp chất 2 (kí hiệu HB3) (28mg).(Hình
3.1)

HR-1B

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất và phân lập từ phân đoạn ethyl acetat, nbutanol lá cây Hồng rừng

12


A

B

Dung môi khai triển MeOH: Nước = 3:2 (v:v)
A. UV 365 nm.
B. Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH
Hình 3.2 Sắc ký đồ của phân đoạn 2H-54 và hợp chất HR2

Dung môi khai triển Diclomethan: MeOH = 10:1 (v:v).
Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH. Hợp chất HB-3 kí hiệu HB
Hình 3.3 Sắc ký đồ của phân đoạn n- Butanol và hợp chất HB-3


13


3.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
 Hợp chất 1 ( ký hiệu HR2)
Hợp chất HR-2 phân lập được dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ 1H-NMR cho
thấy sự xuất hiện của 4 nhóm methyl tại δH 1,03 (3H, s, H-12); 1,06 (3H, s, H-13); 1,26
(3H, d, J = 6,5 Hz, H-10) và 1,94 (3H, s, H-11); 1 methylen tại δH 2,18 (1H, d, J = 16,8
Hz, H-2), 2,53 (1H, d, J = 16,8 Hz, H-2); 2 proton ở dạng trans tại δH 5,79 (1H, d, J =
14,4 Hz, H-7), 5,81 (1H, m, H-8) và 1 proton olefin tại δH 5,90 (1H, s, H-4) và 1 proton
hydroxymethin tại δH 4,34 (1H, m, H-9). Phổ 13C-NMR và DEPT cũng cho thấy sự phù
hợp với sự xuất hiện của 13 carbon trong đó có 4C, 4 CH, 1CH2 và 4CH3. Tín hiệu tại
δC 201,2 (C-3) cho thấy sự có mặt của nhóm keton trong cấu trúc của HR-2. Từ dữ liệu
phổ cho thấy, HR-2 là một hợp chất megastigmane và được xác định là corchoionol C
[30].
Xuất hiện tín hiện tại δC 210,1 và 30,7 ppm do còn lẫn dung mơi aceton trong q
trình tinh chế mẫu.
Bảng 3.1 So sánh dữ liệu NMR của hợp chất 1 (HR2) với tài liệu tham khảo
Vị trí

Hợp chất 1 (HR2)
δHa,b ppm

1
2

(độ bội, J = Hz, )
2,18 (1H, d, 16,8)


3

2,53 (1H, d, 16.8)
-

4

Corchoionol C [30]
δCa,c
(ppm)
42,4
49,6

δHa,b ppm
(độ bội, J = Hz, )
2,14 (1H, d, 17,0)

δCa,c
(ppm)
42,5
50,8

201,3

2,50 (1H, d, 17,0)
-

201,3

5,90 (1H, s)


127,1

5,86 (1H, s)

127,1

5

-

167,5

-

167,6

6

-

80,0

-

80,0

7

5,79 (1H, d, 14,4)


130,1

5,78 (1H, d, 16,0)

130,1

8

5,81 (1H, m)

136,9

5,78 (1H, m)

136,9

9

4,34 (1H, m)

68,7

4,31 (1H, m)

68,8

10

1,26 (3H, d, 6,6)


23,5

1,22 (3H, d, 6,5)

23,6

11

1,94 (3H, s)

19,6

1,91 (3H, s)

19,7

14


12

1,03 (3H, s)

23,8

0,99 (3H, s)

23,9


13

1,06 (3H, s)

24,5

1,02 (3H, s)

24,6

a)

Đo trong CD3OD, b) 600 MHz, c) 125 MHz
Phổ 1H NMR của HR2

15


Phổ

13

C NMR của HR

16


Hình 3.4 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất HR-2

17



500

mAU

210nm,4nm

800

450

10.386/ 1.00

239

Datafile Name:HR2 sach chay lai.lcd
Sample Name:HR2 sach chay lai
mAU

700

400

600
350

500
/10.386


300

400

200

300

150

200

0.0

2.5

5.0

7.5

12.5

15.0

17.5

22.5

/24.289


/22.907

/21.167

20.0

/22.057

/19.070

/14.724

/12.720

10.0

100
/17.466

0

/7.571

/3.997

/5.610

50

/2.384

/2.853

100

min

388
391

250

0
200.0

225.0

250.0

275.0

300.0

325.0

350.0

375.0

nm


Hình 3.5 Dữ liệu HPLC của hợp chất HR2

Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo của hợp chất 1 (HR2)
 Hợp chất 2 (ký hiệu HB3)
Hợp chất 2 HB3 thu được dưới dạng bột vơ định hình, màu vàng trong phổ 13C
NMR gợi ý công thức phân tử của hợp chất HB3 được xác định là C22H22O12 (M =
476.9). Phổ UV cho hai mũi hấp thu cực đại ở 256 và 351 nm nên HB3 có thể là một
flavonoid. Dữ liệu phổ 1H NMR (Bảng 3.5) hiển thị những tín hiệu proton của vòng
benzen tại δH 6,91 (1H, s, H-2'); 6,91 (1H, s, J = 7,2 Hz, H-6'). Việc không ghi nhận các
tín hiệu của proton tại vị trí H-3', H-4' và H-5' cho phép dự đốn hai vị trí này đều có
nhóm thế, dẫn đến kết luận HB3 có khung myricetin. Bên cạnh đó, tín hiệu proton tại
δH 3,90 (1H, s, Me-O-4') cho phép dự đốn vị trí 4' có nhóm thế –CH3. Ngoài ra, trên
phổ 1H NMR cũng xuất hiện tín hiệu δH 5.32 (1H, d, 1.2) đặc trưng cho proton anomer
của 1 phân tử đường. Phổ 13C cho thấy hợp chất có 22 carbon trong vùng δC = 179,6 –
17,7, như vậy hợp chất HB3 là một flavonoid có khung myricetin có gắn 1 phân tử
đường. Ở vùng từ trường cao có mũi đơi với δH 0,97 (3H, d, J = 5,0 Hz, H-6'') ứng với
nhóm –CH3 (δC = 17,6, C-6''), vậy phân tử đường này là đường rhamnose. Dữ liệu phổ
NMR của hợp chất HB3 so sánh với những giá trị công bố trong tài liệu tham khảo, xác
18