BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THẠCH PHONG

NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN,
TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THUỶ
PHÂN ARABINOXYLAN CỦA XYLANASE TÁI
TỔ HỢP TỪ CHỦNG PICHIA PASTORIS GS115

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HOÁ SINH DƯỢC
MÃ SỐ 8720208
Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Đỗ Thị Tuyên
2. TS. Đào Thị Mai Anh

HÀ NỘI 2022


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin được gửi lời cảm ơn đến tồn thể các thầy cơ giáo của
Trường Đại học Dược Hà Nội, những người dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức
quý báu cho em trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường. Em xin chân
thành cảm ơn các thầy cơ bộ mơn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội, cũng
như các anh chị tại phịng Cơng nghệ sinh học Enzym – Viện Cơng nghệ sinh học
đã tạo điều kiện thuận lợi và hướng dẫn em trong quá trình thực tập, nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên đã định hướng ý tưởng nghiên
cứu, tận tình hướng dẫn thí nghiệm và thực hiện khóa luận trong suốt q trình
thực tập tại phịng Cơng nghệ sinh học Enzym – Viện Cơng nghệ sinh học. Ngoài

ra em cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến quỹ Phát triển khoa học và công nghệ
Quốc gia Nafosted đã tài trợ thực hiện đề tài.
Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đào Thị Mai
Anh. Cô không những là một người thầy tận tâm giúp em tìm ra đam mê của mình,
giúp em định hướng bước đi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học, mà
cơ cịn cho em những lời khun chân thành trong cuộc sống, tiếp thêm động lực
cho em trong suốt thời gian qua.
Cảm ơn các anh chị lớp cao học 25, bạn Trương Thị Thanh Thanh, Lê
Nguyễn Anh Thư đã luôn đồng hành, động viên tơi trong q trình học tập.
Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ, người thân
trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực
cho em trên con đường học tập và rèn luyện bản thân. Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2022
Học viên
Nguyễn Thạch Phong


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. Arabinoxylan ............................................................................................... 3
1.1.1. Định nghĩa ............................................................................................ 3
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố trong tự nhiên .................................................. 3
1.1.3. Phân loại............................................................................................... 4
1.1.4. Ứng dụng .............................................................................................. 4
1.2. Enzym xylanase .......................................................................................... 5
1.2.1. Định nghĩa ............................................................................................ 5

1.2.2. Phân loại............................................................................................... 5
1.2.3. Phân bố trong tự nhiên ......................................................................... 6
1.2.4. Ứng dụng .............................................................................................. 6
1.2.5. Xylanase từ chủng Aspergillus niger .................................................... 8
1.3. Chủng Pichia pastoris GS115................................................................... 13
1.3.1. Nguồn gốc, phân loại.......................................................................... 13
1.3.2. Bộ gen di truyền .................................................................................. 14
1.3.3. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................. 14
1.3.4. Ứng dụng ............................................................................................ 14
1.4. Tình hình nghiên cứu xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115
.......................................................................................................................... 15
1.4.1. Trên thế giới........................................................................................ 15
1.4.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 16


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 18
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................ 18
2.1.1. Chủng giống........................................................................................ 18
2.1.2. Hóa chất.............................................................................................. 18
2.1.3. Mơi trường .......................................................................................... 20
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 21
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 22
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 24
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy Pichia pastoris GS115 ................................... 24
2.3.2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện xylanase tái tổ hợp................. 24
2.3.3. Phương pháp tinh sạch xylanase tái tổ hợp........................................ 25
2.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein tái tổ hợp......................... 25
2.3.5. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamid ( SDS- PAGE) 26
2.3.6. Phương pháp định tính xylanase ........................................................ 28
2.3.7. Phương pháp định lượng xylanase ..................................................... 28

2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng thuỷ phân arabinoxylan ................ 30
2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 31
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ ....................................................... 32
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện biểu hiện xylanase từ chủng Aspergillus niger
DMS1957 trong Pichia pastoris GS115 ....................................................... 32
3.1.1. Kết quả biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong điều kiện cơ bản ........... 32
3.1.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện nâng cao hoạt tính xylanase tái tổ hợp
...................................................................................................................... 33
3.2. Kết quả tinh sạch và đánh giá đặc tính sinh học thủy phân arabinoxylan
của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115................ 40


3.2.1. Kết quả tinh sạch xylanase tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực
...................................................................................................................... 40
3.2.2. Đánh giá độ tinh sạch của xylanase tái tổ hợp................................... 42
3.2.3. Đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan ...................................... 43
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 45
3.1. Về kết quả khảo sát điều kiện biểu hiện nâng cao hoạt tính xylanase tái tổ
hợp.................................................................................................................... 45
3.2. Khảo sát kết quả tinh sạch và đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan
của xylanase tái tổ hợp ..................................................................................... 47
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 50


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt


ATCC

American Type Culture collection

AX

Arabinoxylans
Cộng sự

Cs
IUBMB

International
Biochemistry

Union
and

of Liên hiệp Hoá sinh và Sinh học

Molecular phân tử Quốc tế

Biology
MW

Molecular weight

Trọng lượng phân tử


NSP

Non-starch polysaccharides

Polysaccharid không tinh bột

PAGE

Polyacrylamid gel electrophoresis

PBS

Phosphate buffer saline

Dung dịch đệm phosphat

PFGE

Pulsed Field Gel Electrophoresis

Điện di trường xung

BSA

Bovine Serum Albumin

Albumin huyết thanh bò

SDS


Sodium dodecyl sulfat

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

WEAX

Water-extractable arabinoxylan

Arabinoxylan chiết xuất được
trong nước

WUEAX Water-unextractable
arabinoxylan

Arabinoxylan không chiết xuất
được trong nước


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số ứng dụng của arabinoxylan ...................................................... 4
Bảng 1.2: Đặc điểm lý hóa của một số xylanase từ Aspergillus niger ................ 13
Bảng 1.3: Thông tin bộ gen Pichia pastoris GS115 ............................................ 14
Bảng 2.1: Các hóa chất được sử dụng ................................................................ 18
Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch .............................................. 19
Bảng 2.3: Môi trường sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 20
Bảng 2.4: Các thiết bị sử dụng ............................................................................ 21

Bảng 2.5: Thành phần gel polyacrylamid 12,5% ................................................ 27
Bảng 3.1: Hoạt tính và hoạt tính riêng xylanase ................................................. 33
Bảng 3.2: Kết quả định lượng xylanase tái tổ hợp sau mỗi 24 giờ ..................... 34
Bảng 3.3: Hoạt tính xylanase ở các nồng độ methanol cảm ứng ở 120 giờ ....... 37
Bảng 3.4: Kết quả định lượng xylanase trong 6 môi trường dịch nuôi cấy ........ 38
Bảng 3.5. So sánh hoạt tính và hoạt tính riêng trước và sau khi khảo sát .......... 40
Bảng 3.6: Kết quả định lượng xylanase tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng phương
pháp sắc kí ái lực ................................................................................................. 41
Bảng 3.7: Kết quả quá trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp ................................. 41


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của arabinoxylan (AX) và các vị trí bị tấn cơng bởi các enzym
xylanolytic liên quan đến sự phân hủy của nó……………………………………….. 3
Hình 1.2: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong phản ứng thuỷ phân
xylan [81]…………………………………………………………………………………. 5
Hình 1.3: Sơ đồ gen xylanase A từ chủng Aspergillus niger DMS1957………….. 9
Hình 1.4: Sơ đồ gen xylanase B từ chủng Aspergillus niger DMS1957………….. 9
Hình 1.5: Sơ đồ gen xylanase D từ chủng Aspergillus niger DMS1957…………. 9
Hình 1.6: Hai quan điểm đại diện về cấu trúc tổng thể của endoxylanase I từ A.
niger (được phát hiện bởi Raster3D; Merritt & Murphy, 1994 [73]). Hai gốc
glutamat xúc tác, Glu79 (trên) và Glu170 (dưới), được chỉ ra trong (a)………..10
Hình 1.7: Con đường xúc tác xylanase……………………………………………… 12
Hình 2.1: Nội dung nghiên cứu……………………………………………………… 23
Hình 2.2: Đường chuẩn Bradford…………………………………………………….26
Hình 2.3: Đường chuẩn xylose……………………………………………………….. 29
Hình 3.1: Kết quả xác định hoạt tính xylanasae trong dịch ni cấy ……………..32
Hình 3.2: Kết quả điện di protein bằng SDS-PAGE sau mỗi 24 giờ ………………33
Hình 3.3: Khảo sát thời gian ni cấy………………………………………………...34
Hình 3.4: Điện di đồ SDS-PAGE xylanase tái tổ hợp cảm ứng methanol các nồng

độ khác nhau……………………………………………………………………………..35
Hình 3.5: Khảo sát nồng đồ methanol cảm ứng ……………………………………36
Hình 3.1: Khảo sát mơi trường ni cấy………….. ………………………………..38
Hình 3.7: Điện di đồ SDS – PAGE xylanase tái tổ hợp qua cột sắc ký ái lực…..41


Hình 3.8: Sắc ký mỏng thủy phân arabinoxylan thương mại hãng Megazym của
các dịch xylanase tái tổ hợp với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O =
(3:1:1)..................................................................................................................42


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xylanase là glycosidase thuộc nhóm enzym endohydrolysis xúc tác cho
phản ứng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-xylosidic trong xylan [77]. Xylanase
được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1955, với tên gọi ban đầu là pentosanase và
được liên hiệp Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế (IUBMB) công nhận đến
năm 1961 với mã enzym là EC 3.2.1.8 [39]. Nhưng phải đợi đến tận những năm
1980, xylanase mới bắt đầu được sử dụng chuẩn bị thức ăn chăn ni và sau đó là
trong các ngành cơng nghiệp thực phẩm, dệt may và giấy. Mặc dù vậy, trong
những năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học có sử dụng xylan,
arabinoxylan và xylanase đã phát triển đáng kể. Hiện nay, xylanase và cellulase
cùng với pectinase chiếm 20% thị trường enzym thế giới [47], [43], [80], [81],
[45], [46], [36]. Theo một báo cáo mới được công bố bởi Gen Consulting
Company, thị trường xylanase tồn cầu được dự đốn sẽ tăng trưởng với tỷ lệ tăng
trưởng hàng năm kép là 6,6% vào năm 2023, quy mô thị trường mở rộng trên
nhiều lĩnh vực như: thực phẩm và đồ uống, thức ăn chăn nuôi, công nghiệp… và
nhiều khu vực trên thế giới: Bắc Mỹ, Châu Âu, Châu Á Thái Bình Dương, Trung
Đông và Châu Phi, Nam Mỹ [51]. Đặc biệt là gần đây, xylanase cũng bắt đầu được
ứng dụng trong ngành sản xuất Dược phẩm và Hoá chất. Các sản phẩm thủy phân
bởi xylanase với các cơ chất xylan, arabinoxylan (gốc β-D-xylopyranosyl) có thể

được chuyển đổi thành chất lỏng dễ cháy (ethanol), dung mơi và chất làm ngọt
nhân tạo có hàm lượng calo thấp [34]. Trong số các sản phẩm này, xylitol là một
polyalcohol có khả năng làm ngọt tương đương với sucrose nhưng khơng sinh
năng lượng, thích hợp cho người bị tiểu đường, béo phì. Khơng những thế, sản
phẩm này còn được khuyến nghị sử dụng để phòng ngừa lỗng xương, nhiễm trùng
đường hơ hấp, rối loạn chuyển hóa lipid, tổn thương thận và đường tiêu hóa [26].

1


Mặc dù xylanase có thể được chiết xuất và tinh chế từ nhiều nguồn khác
nhau trong tự nhiên nhưng hoạt tính của chúng cịn thấp và chi phí sản xuất còn
cao. Những hạn chế này thực sự là rào cản khi muốn ứng dụng rộng rãi xylanase
trong công nghiệp và là nguyên nhân khiến một phần lớn xylan trong tự nhiên
khơng được sử dụng hiệu quả, gây lãng phí nhiều tài nguyên. Vì vậy, các kỹ thuật
ADN tái tổ hợp đã được sử dụng để nhân bản và biểu hiện các gen xylanase được
phân lập ở vật chủ thích hợp (ví dụ Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae,
và nấm sợi) nhằm đáp ứng nhu cầu xylanase ở quy mô công nghiệp [86], [79],
[52]. Trong số các hệ biểu hiện, nấm men hiện là hệ thống hứa hẹn nhất vì chúng
có khả năng phát triển với mật độ rất cao, thực hiện các sửa đổi sau dịch mã của
sinh vật nhân thực và tiết ra các protein ngoại bào lớn. Trong số các loại nấm men,
Pichia pastoris đã trở thành một trong những vật chủ được sử dụng phổ biến nhất,
do khả năng biểu hiện và tiết ra các protein tái tổ hợp một cách hiệu quả. Hơn nữa,
các nghiên cứu về tái tổ hợp xylanase nói chung và trong Pichia pastoris nói riêng
mới chỉ dừng lại ở việc biểu hiện, đánh giá đặc tính lý hố hay là tinh sạch enzym,
trong khi đó sản phẩm thuỷ phân xylan, arabinoxylan có vai trị quan trọng trong
các lĩnh vực đời sống, đặc biệt là dược phẩm thì chưa có các nghiên cứu về chúng.
Vì vậy, với mong muốn tạo ra được một công cụ xanh hiệu quả cho nhiều ngành
công nghiệp khác nhau, đặc biệt là công nghiệp dược phẩm chúng tôi tiến hành đề
tài “Nghiên cứu điều kiện biểu hiện, tinh sạch và đánh giá khả năng thuỷ phân

arabinoxylan của enzym xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115”
với mục tiêu:
(1) Nghiên cứu các điều kiện biểu hiện xylanase từ chủng Aspergillus niger

DMS1957 trong Pichia pastoris GS115
(2) Tinh sạch và đánh giá đặc tính sinh học thuỷ phân arabinoxylan của enzym

xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115
2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Arabinoxylan
1.1.1. Định nghĩa
Arabinoxylan (AX) là polysaccharid phi tinh bột chính có trong ngũ cốc.
AX bao gồm trục xương sống của các gốc xylose liên kết  - (1,4), được thay thế
bằng các gốc arabinose ở vị trí C(O)-2 và/hoặc C(O)-3 [12]. Vì AX chủ yếu bao
gồm xylose và arabinose, nên nó thường được gọi là pentosan. Các acid phenolic
như acid ferulic có thể được liên kết este trên vị trí C (O) -5 của arabinose. Trong
điều kiện oxy hóa, các dư lượng axit ferulic này trải qua q trình liên kết chéo
oxy hóa giữa các gốc axit ferulic khác nhau tạo thành các cầu nối axit diferulic
trong chuỗi [15].

Hình 1.1: Cấu trúc của arabinoxylan (AX) và các vị trí bị tấn cơng bởi các
enzym xylanolytic liên quan đến sự phân hủy của nó
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố trong tự nhiên
Arabinoxylan là thành phần quan trọng của chất xơ trong ngũ cốc [9]. Ngoài
ra, AX cũng được tìm thấy trong vỏ ngơ và vỏ chuối với tỷ lệ là 40% và 10%. Tuy

3



nhiên chuối có tiềm năng lớn hơn trong việc cung cấp AX do chất lượng và số
lượng AX vượt trội hơn [40], [41], [14], [25].
1.1.3. Phân loại
Arabinoxylan thường được phân loại thành arabinoxylan có thể chiết xuất
được trong nước (WEAX) và arabinoxylan không thể chiết xuất được trong nước
(WUEAX). Trong đó, WEAX liên kết lỏng lẻo với bề mặt thành tế bào [20].
Ngược lại, WUEAX được giữ lại trong thành tế bào bởi các tương tác cộng hóa trị
và khơng cộng hóa trị với AX và protein, lignin và cellulose [19].
1.1.4. Ứng dụng
AX đã được nghiên cứu rất nhiều trên thế giới để sử dụng trong nhiều lĩnh
vực khác nhau, đặc biệt là lĩnh vực chăm sóc sức khỏe. Một số ứng dụng của AX
được trình bày tóm tắt trong bảng 1.1:
Bảng 1.1: Một số ứng dụng của arabinoxylan
Lĩnh vực

Ứng dụng

Thực

Sử dụng khả năng giữ nước của arabinoxylan để mang lại các đặc

phẩm

tính lưu biến cần thiết cho bột mì => Cải thiện chất lượng sử dụng
cuối cùng của bánh mì [24], [29], [30], [7].

Chăm sóc Bổ sung chất xơ [42], [32], [8]. => kiểm soát bệnh đái tháo đường,
sức khỏe


rối loạn lipid, cải thiện chức năng hệ tiêu hoá [23], [21], [25]. [64].
AX tác động mạnh lên đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch
thu được [4].
Hoạt tính chống khối u [4].

4


1.2. Enzym xylanase
1.2.1. Định nghĩa
Endo – 1,4 – xylanase (EC 3.2.1.8) là một enzym phân cắt xylan thành các
đoạn nhỏ bằng cách thủy phân các liên kết β – 1,4 – glycosidic bộ khung cấu trúc
của xylan [54].

Hình 1.2: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong phản ứng thuỷ
phân xylan [82]
1.2.2. Phân loại
Xylanase về cơ bản thuộc nhóm enzym glycosid hydrolase. Việc phân loại
glycosid hydrolase dựa trên trình tự đã chia xylanase vào hai họ GH10 và GH11.
Tuy nhiên xylanase cũng được tìm thấy trong các họ glycosid hydrolase khác,
chẳng hạn như GH 5, 7, 8 và 43 [70]. Họ GH10 là nhóm có trọng lượng phân tử

5


cao bao gồm cả endo-1,4-β-xylanase và endo-1,3-β-xylanase, nhưng phần lớn là
endo-1,4-β-xylanase với ít endo-1,3-β-xylanase. Họ GH11 là nhóm có trọng
lượng phân tử thấp, chúng chỉ bao gồm các endo-β-1,4-xylanase thực sự phân cắt
các liên kết β-1,4-xylosidic bên trong. Hoạt tính xúc tác của chúng thấp hơn họ

GH10, và các sản phẩm của hoạt động của chúng có thể được thủy phân thêm bởi
các enzym thuộc họ 10. Đây được coi là "xylanase thực sự", vì chỉ hoạt động
trên D-xylose chứa chất nền [76], [48], [50].
Tuy nhiên, một số trường hợp ngoại lệ đã được tìm thấy [82], [73] và khoảng
30% các xylanase đã được xác định hiện nay, đặc biệt là các xylanase của nấm,
không thể được phân loại theo hệ thống này. Sau này, một hệ thống phân loại hoàn
chỉnh hơn đã được giới thiệu [62] cho phép phân loại khơng chỉ xylanase, mà cả
glycosidase nói chung (EC 3.2.1.x), và hiện đã trở thành hệ thống chuẩn để phân
loại các enzym này. Hệ thống này dựa trên sự so sánh cấu trúc cơ bản của các vùng
xúc tác chỉ và các nhóm enzym trong các họ có trình tự liên quan [63].
1.2.3. Phân bố trong tự nhiên
Các xylanase được sản xuất chủ yếu bởi vi sinh vật, tảo biển, động vật
nguyên sinh, giáp xác, côn trùng, ốc và hạt của thực vật trên cạn. Những nguồn
xylanase từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm và nấm men đang được tìm thấy
với tính chất lý hố như độ pH, nhiệt độ ổn định [82]. Trong nấm
sợi, Aspergillus và Trichoderma spp. được xác định là nguồn xylanase tốt nhất
với mức sản xuất xylanase ngoại bào cao [17].
1.2.4. Ứng dụng
Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là thuỷ phân các xylan,
arabinoxylan…. Quá trình thủy phân và các sản phẩm thuỷ phân của xylanase có
thể sử dụng trong nhiều giai đoạn của các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp,
dược phẩm, thực phẩm…. Một số ứng dụng cụ thể được trình bày sau đây:
6


- Tẩy trắng sinh học trong ngành công nghiệp giấy - bột giấy: Tầm quan
trọng của việc sử dụng xylanase trong các ngành công nghiệp giấy - bột giấy nằm
ở việc thủy phân xylan tương ứng với việc loại bỏ lignin. Loại bỏ lignin làm trắng
giấy do đó nâng cao chất lượng của giấy. Trong những năm qua, clo, chất tẩy trắng
hóa học, đã được sử dụng để loại bỏ lignin nhưng nó có một số hạn chế bao gồm

việc tạo ra các sản phẩm nguy hiểm cho sức khỏe con người. Các sản phẩm phụ
này đôi khi được cho là độc hại, gây đột biến, bền và có khả năng chống phân hủy
sinh học cao cho thấy mức độ ô nhiễm môi trường cao. Ứng dụng của xylanase
trong bột giấy để loại bỏ lignin được gọi là tẩy trắng sinh học. Một số nghiên cứu
cho thấy rằng việc sử dụng xylanase chịu axit để tẩy trắng bột giấy đã tăng lên vì
nó có lợi ở một số khía cạnh hơn so với việc sử dụng clo [78], [37].
- Ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi: Xylanase ưa axit rất quan trọng
đối với ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn ni. Chúng giữ vai trị rất
quan trọng trong sản xuất nước trái cây, làm bánh mì, sản xuất xylooligosaccharid
vv…. Đối với mục đích làm bánh mì trong ngành công nghiệp thực phẩm,
xylanase ưa axit được áp dụng vì độ pH của bột nhào vì pH nằm trong khoảng có
tính axit [31].
- Sản xuất nhiên liệu sinh học: Việc tiêu thụ quá nhiều nhiên liệu hóa thạch
trong vài thập kỷ qua không chỉ dẫn đến cạn kiệt nguồn cung nhanh chóng mà cịn
gây ra những tác động có hại đến môi trường. Những tác động tiêu cực như vậy
của việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch làm nảy sinh suy nghĩ về các giải pháp thay
thế thân thiện với môi trường cũng như bền vững trong tự nhiên. Ngày nay, năng
lượng tái tạo dưới dạng nhiên liệu sinh học từ chất nền lignoxenluloza đã trở thành
một trong những phương thức sản xuất năng lượng bền vững quan trọng. Sinh
khối lignocellulosic rất dồi dào vì sản lượng sinh khối này được ước tính là 10–50
tỷ tấn khơ trên tồn thế giới [5], [60].
7


- Ngồi ứng dụng trong các ngành cơng nghiệp khác, xylanase được biết
đến là có nhiều tiềm năng trong cơng nghiệp dược phẩm. Tuy nhiên, trên thế giới
vẫn cịn có ít nghiên cứu về xylanase trong lĩnh vực này. Xylanase đôi khi được
thêm vào kết hợp với phức hợp các enzym (hemicellulase, protease và những loại
khác) như một chất bổ sung chế độ ăn uống hoặc để điều trị tiêu hóa kém [18].
Các sản phẩm thủy phân của xylan, chẳng hạn như gốc β-D-xylopyranosyl, có thể

được lên men, chủ yếu là bởi nấm men (Pichia spititis và Candida shehatae), để
sản xuất xylitol. Xylitol là một polyalcohol có khả năng làm ngọt tương đương với
sucrose [26]. Nó là một chất làm ngọt khơng tạo năng lượng, thích hợp cho bệnh
nhân tiểu đường và béo phì và được khuyến nghị để phịng ngừa lỗng xương và
nhiễm trùng đường hơ hấp, rối loạn chuyển hóa lipid, tổn thương thận và đường
tiêu hóa.
1.2.5. Xylanase từ chủng Aspergillus niger
1.2.5.1. Gen mã hoá
Mặc dù một cơ sở dữ liệu rất lớn về các xylanase khác nhau và các gen mã
hóa chúng từ A. niger đã được tạo ra, nhưng vẫn chưa rõ có bao nhiêu gen xylanase
được mã hóa trên mỗi bộ gen của chủng A. niger phân lập được và những xylanase
nào sẽ được tạo ra trong q trình ni cấy. Đây thực sự là trở ngại lớn đối với
việc nghiên cứu về gen mã hóa xylanase của A. niger. Nghiên cứu đầy đủ và rõ
ràng nhất về hệ gen của A. niger được Pel và cộng sự tiến hành năm 2007. Trong
nghiên cứu này, Pel và cộng sự đã chỉ ra, với chủng A. niger CBS 513.88 có 5 gen
mã hóa cho xylanase bao gồm: một gen mã hoá cho xylanase thuộc họ GH 10 và
bốn gen mã hoá cho xylanase thuộc họ GH 11 [75].
Đối với chủng Aspergillus niger DMS1957, phịng Cơng nghệ sinh học
Enzym, Viện Công nghệ sinh học đã nghiên cứu và giải trình tự được 3 gen mã
hố xylanase lần lượt là: xylanase A mARN với chiều dài 984 bp, xylanase B
8


mARN với chiều dài 678 bp, và xylanase D mARN với chiều dài 957 bp (Hình
1.3, 1.4, 1.5). Trình tự nucleotid của 3 gen này được thể hiện trong phụ lục 1 [11].

Hình 1.3: Sơ đồ gen xylanase A từ chủng Aspergillus niger DMS1957

Hình 1.4: Sơ đồ gen xylanase B từ chủng Aspergillus niger DMS1957


Hình 1.5: Sơ đồ gen xylanase D từ chủng Aspergillus niger DMS1957
1.2.5.2. Cấu trúc
A. niger xylanase I có một nếp gấp rất đặc trưng (Hình 1.6), đặc trưng cho
họ G xylanase. Hình dạng của nó đã được so sánh với hình dạng của bàn tay phải
[83], với '' ngón tay '' ở phía dưới, '' lịng bàn tay '' ở phía bên tay phải và '' ngón
9


tay cái '' ở đầu phân tử như được biểu diễn trong Hình 3 (a). Cấu trúc bao gồm một
miền duy nhất và chứa một chuỗi xoắn  và 13 sợi , được sắp xếp thành hai tấm
 chủ yếu là đối song song. Chuỗi  lớn hơn, tám sợi (b) được xoắn nhiều xung
quanh một khe sâu và dài, đủ lớn để chứa ít nhất bốn dư lượng xyloza. Một chuỗi
xoắn duy nhất được nhúng ở mặt sau của trang tính này. Nó được ổn định chủ yếu
bởi các tương tác kỵ nước với chuỗi , nhưng cũng bởi một số liên kết hydro và
tương tác tĩnh điện giữa các gốc axit amin được bảo tồn cao.

Hình 1.6: Hai quan điểm đại diện về cấu trúc tổng thể của endoxylanase I từ
A. niger (được phát hiện bởi Raster3D; Merritt & Murphy, 1994 [74]). Hai
gốc glutamat xúc tác, Glu79 (trên) và Glu170 (dưới), được chỉ ra trong (a)
1.2.5.3. Cơ chế xúc tác
Một số mơ hình đã được đề xuất để giải thích cơ chế hoạt động của
xylanase. Hầu hết các enzym thủy phân polysaccharid như cellulase và xylanase
được biết là thủy phân cơ chất của chúng với việc giữ lại cấu hình anomeric. Đồng
thời có sự tham gia của cơ chế dịch chuyển kép để duy trì anomeric của sản phẩm
[6]. Cơ chế xúc tác của xylanase gồm những bước sau:
(1) Xylanase nhận diện xylan và liên kết nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần
cánh trái (cuộn xoắn lại 3 lần); cơ chất xylan hình xoắn ốc được đặt ở vị trí
đối diện với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 [65] (a);
10



(2) Hai gốc glutamat (Glu) được định vị cho phù hợp với vị trí hoạt động
(khoảng 5,5 Å). Glu 172 là chất xúc tác acid/base, Glu 78 là chất cho điện
tử [65];
(3) Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác (Glu
78), liên kết glycosidic bị kéo căng và bẻ gãy tạo thành dạng trung gian
đồng hóa trị enzym – cơ chất [71] (b).
(4) Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, nó tách thành
ion 𝐻 + gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi 𝑂𝐻 − gắn vào đầu
khử của mạch xylan vừa tạo theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản
phẩm được giải phóng [68], [84] (c),(d).
(5) Enzym dịch chuyển đến vị trí tiếp theo trên cơ chất nhờ sự phân tách và
phân tán các đường (xylose) [65].

11


Hình 1.7: Con đường xúc tác xylanase
1.2.5.4. Tính chất lý hố
Nhìn chung, các xylanase từ chủng A. niger có nhiệt độ và pH tối ưu, trọng
lượng phân tử gần giống nhau. Bảng 1.2 tóm tắt các đặc điểm lý hố chính của
một số xylanase từ A. niger

12


Bảng 1.2: Đặc điểm lý hóa của một số xylanase từ Aspergillus niger
pH tối Nhiệt độ
Km
ưu

tối ưu (oC) (mg/ml)

Chủng

MW
(kDa)

Aspergillus niger I

13,5-14

5.5

45

niger

35,5

7

Aspergillus
IA-001

niger

24

Aspergillus
xylanase A


niger

Aspergillus
BCC14405

pI

TLTK

-

0

[58]

50

-

6,23

[10]

5

50

4,429


-

[57]

20

5

50

4,8

-

[22]

niger

21

5

55

8,9

-

[67]


Aspergillus
XZ-3S

niger

24,04

5

40

-

-

[59]

Aspergillus
US368

niger

25

5

50

-


-

[55]

Aspergillus
DMS1957

1.3. Chủng Pichia pastoris GS115
1.3.1. Nguồn gốc, phân loại
Nấm men methylotrophic Pichia pastoris lần đầu tiên được phân lập từ một
cây hạt dẻ ở Pháp và được Alexandre Guilliermond mô tả là Zygosaccharomyces
pastori [16]. Vào những năm 1950, Herman Phaff đã phân lập thêm các chủng từ
cây sồi đen ở California, Hoa Kỳ, và đổi tên loài là Pichia pastoris [27]
Năm 1995, Pichia pastoris đã được phân loại lại thành chi Komagataella
sau khi phân tích phát sinh lồi về trình tự gen, và tách thành ba lồi, K. pastoris,
K. phaffii và K. pseudopastoris. Những loài này là nấm men metylotrophic đa
dạng: chúng có thể sử dụng các hợp chất cacbon đơn (ví dụ như metanol hoặc

13


metan) hoặc các hợp chất đa cacbon khơng có liên kết C-C (ví dụ như dimetyl ete
hoặc dimetylamin) làm nguồn thức ăn.
1.3.2. Bộ gen di truyền
Trình tự bộ gen được cơng bố vào năm 2009 cho dịng Pichia pastoris
GS115 [53] tại phòng nghiên cứu sinh học phân tử, đại học Gent, Bỉ, bao gồm 4
nhiễm sắc thể với tổng chiều dài khoảng 9,22 Mb với thông tin như sau (Bảng
1.3):
Bảng 1.3: Thơng tin bộ gen Pichia pastoris GS115
Trình tự tham


Kích

chiếu

thước

1

NC_012963.1

2

Nhiễm sắc thể

%GC

Số gen

2,8

41,1

1538

NC_012964.1

2,39

41,0


1333

3

NC_012965.1

2,25

41,1

1198

4

NC_012966.1

1,78

41,4

971

1.3.3. Điều kiện nuôi cấy
Chủng GS115 của P. pastoris (ATCC số 20864) có thể được phát triển trên
đĩa thạch pepton dextrose (YEPD) chiết xuất nấm men và một khuẩn lạc đơn lẻ
được tiếp tục phát triển trong môi trường YEPD bổ sung adenin sulphat trong 16
– 18 giờ ở 25oC.
1.3.4. Ứng dụng
Các nấm men Pichia pastoris đã được biết đến như là một nhà máy sản xuất

protein thành công, đặc biệt là trong lĩnh vực enzym công nghiệp và ngành công
nghiệp dược phẩm sinh học. Là một vi sinh vật “thường được coi là an toàn” , nấm
men này đã được sử dụng để sản xuất hơn 500 protein dược phẩm và hơn
1000 protein tái tổ hợp tính đến năm 2009 [13]. Được thúc đẩy bởi nhu cầu ngày

14


càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, P.
pastoris cũng đã trở thành vật chủ quan trọng để sản xuất các enzym tái tổ hợp
như xylanase và phytase, các enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng trong những
lĩnh vực này [33]. Gần đây, P. pastoris cũng đã được sử dụng để biểu hiện các
protein màng của sinh vật nhân chuẩn, tạo điều kiện cho những tiến bộ trong
nghiên cứu về sinh học cấu trúc [3]. Sử dụng kỹ thuật hiển thị bề mặt tế bào , P.
pastoris đã được sử dụng để tổng hợp nhiên liệu sinh học và các hóa chất khác
[35]. Sự thành công của P. pastoris như một hệ thống đa năng như vậy chủ yếu là
do khả năng phát triển đến nồng độ sinh khối cao trên môi trường xác định, khả
năng thực hiện các biến đổi phức tạp sau dịch mã, bao gồm gấp protein chính
xác, hình thành liên kết disulfid cũng như glycosyl hoá và đặc biệt là hiệu quả bài
tiết cao của nó.
1.4. Tình hình nghiên cứu xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115
1.4.1. Trên thế giới
Trên thế giới có khá nhiều nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp trong Pichia
pastoris GS115. Một số ví dụ như trong năm 2006, Aspergillus niger xylanase A
(AnxA) được biểu hiện thành công trong Pichia pastoris ở mức cao dưới sự kiểm
soát của promoter AOX1. AnxA tái tổ hợp được tiết vào môi trường nuôi cấy. Sau
96 giờ cảm ứng 0,25% methanol, hoạt tính của reAnxA trong dịch ni cấy đạt
đến đỉnh, 175 U/mg, cao gấp 1,9 lần so với AnxA tự nhiên (92 U/mg) [72]. Năm
2011, nghiên cứu tối ưu điều kiện biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong P. pastoris
cho kết quả xylanase biểu hiện ở mức độ cao (165 IU/ml) trong mơi trường men

glycerol tối thiểu có đệm (BMGY) kết hợp với zeocin. Cùng đó trong mơi trường
khơng có zeocin thì hoạt tính thấp hơn một chút (160 IU/ml) [2]. Năm 2014, gen
xylanase GH11 từ Aspergillus niger IA-001 được gọi là xynB đã được biểu hiện
thành công ở Pichia pastoris trong thiết bị lên men 10 L, hoạt tính xylanase tái tổ
15


hợp đo được 10,035 U/ml sau 114 giờ [57]. Năm 2015, β-1,4-endoxylanase của
Aspergillus niger US368 được nhân bản và biểu hiện trong Pichia pastoris dưới
promoter GAP cấu thành. Hoạt tính tối đa thu được là 41 U/mL, cao hơn khoảng
3 lần so với hoạt tính thu được ở các lồi bản địa. Enzym được tinh chế cho thấy
hoạt tính cụ thể là 910 U/mg và khối lượng phân tử là 24 kDa. Nó có hoạt tính tối
ưu ở pH 4 và 50°C [56]. Năm 2021, Sangho cùng cộng sự tách gen xylanase họ
glycosyl hydrolase 10 biểu hiện trong Pichia pastoris thu được enzyme có hoạt
động tối đa ở pH 6,0 và 50 ° C, và hoạt tính được duy trì ở 90% ở pH 5,0 và nhiệt
độ thấp hơn 30 ° C trong 24 giờ [66]. Cũng trong năm 2021, gen GH10 xylanase
xylAr10 mới từ Anaeromyces robustus đã được xác định, nhân bản và biểu hiện
ở Pichia pastoris GS115. Protein tái tổ hợp ArXyn10 được đặc trưng sau khi được
tinh chế bằng Niken, độ pH và nhiệt độ tối ưu của ArXyn10 được xác định lần
lượt là 5,5 và 40°C. ArXyn10 ổn định ở phạm vi pH 4,0-8,0 và có thể duy trì độ
ổn định cao từ 35 đến 45°C [85]
1.4.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam cũng đã có tương đối nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp nói riêng
và cơng nghiệp enzym tái tổ hợp nói chung nhằm hạn chế nguồn nhập khẩu, cũng
như phát triển để ứng dụng trong chăn nuôi, dược phẩm, …
Năm 2016, để tạo xylanase tái tổ hợp, đoạn gen có độ dài 636 nucleotid mã
hóa endo-1,4-β-xylanase dựa trên trình tự FJ212324 (Xyl11B) của Bispora sp.
MEY-1 được tối ưu hóa codon và tổng hợp hóa học. Gen tổng hợp sau đó được
chuyển vào genome của Pichia pastoris X33 và biểu hiện ngoại bào sử dụng vector
pPICZαA. Hoạt lực xylanase của chủng tái tổ hợp sau 10 ngày ni cấy trên mơi

trường khống với methanol là nguồn carbon duy nhất đạt 96 IU.ml-1. Endo-1,4β-xylanase sau tinh sạch có kích thước 30 kDa, hoạt động ở pH thấp và tối ưu ở
65C, pH 3,0. Enzyme tái tổ hợp khá bền nhiệt và duy trì 90% hoạt tính sau khi
16