VIỆN ĐẠI HỌC MỎ HÀ NỘI
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

-----oOo----

KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP
Đề tó/.NGHIÊN CỨU ĐIÊU KIỆN LÊN MEN VÀ THU HÔI MỘT SỚ
HOẠT CHẤT SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Cordyceps militaris FNA5

Giáo viên hướng dẫn: TS. Phí Quyết Tiến

TS. Phạm Thanh Huyền
Sinh viên:

Nguyễn Thị Thu Hiền

Lớp:

1302

Hà Nội -2017


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN........................................................................................................ i
DANH MỤC BÁNG............................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH............................................................................................... V

DANH MỤC VIẾT TẮT..................................................................................... vii

MỞ ĐẦU................................................................................................................ 1

CHƯƠNG I. TÔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 3
1.1.
1.1.1.

1.1.2.
1.2.

Giới thiệu về chúng nấm Đông trùng hạ tháo..............................................3

Sơ lược về lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thào.......................... 3

Sự phân bố cùa nấm Đông trùng hạ tháo trong tự nhiên.......................... 6

Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đơng trùng hạ thảo................... 7

1.2.1.

Cordyccpin................................................................................................ 7

1.2.2.

Adenosine.................................................................................................. 9

1.2.3.


Polysaccharide........................................................................................... 9

1.2.4.

Các hợp chất khác.................................................................................... 10

1.3.

Giá trị dược liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con người...... 12

1.4.

ứng dụng công nghệ lên men chìm nấm Cordyccps spp. đế sản xuất sinh

khối và exopolysaccharide (EPS)......................................................................... 14

1.5.

Thu hồi sinh khối và hoạt chất từ Cordyceps spp...................................... 17

1.6.

Tình hình nghiên cứu nam Đơng trùng hạ tháo trong vàngồi nước...... 18

1.6.1.

Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo trên thế giới..................18

1.6.2.


Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ tháo ờ Việt Nam................. 19

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................ 20
2.1.

Vật liệu nghicn cứu..................................................................................... 20

2.1.1.

Chúng giống............................................................................................ 20

2.1.2.

Hóa chất................................................................................................... 20

2.1.3.

Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu............................................................... 20

2.1.4.

2.2.

Mơi trường nuôi cấy................................................................................ 20

Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 21

Nguyễn Thị Thu Hiền


ii


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

2.2.1.

Phương pháp báo quán giống................................................................ 21

2.2.2.

Lựa chọn môi trường nuôi cấy................................................................ 21

2.2.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến khá năng sinh trưởng và phát triển cứa nấm... 22

2.2.3.1.

Nhiệt độ lên men.................................................................................. 22

2.2.3.2.

pH môi trường lên men........................................................................ 22

2.2.3.3.

Tý lệ tiếp giống..................................................................................... 23

Phương pháp xác định các chất có hoạt tính dược học của nấm Đơng tràng

2.2.4.

hạ thào .................................................................................................................. 23
2.2.4.1.

Xác định Cordycepin............................................................................ 23

2.2.4.2.

Xác định Polysaccharide...................................................................... 24

Nghiên cúư tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ các chúng nấm.. 25

2.2.5.

2.2.5.1.

Phương pháp tách chiết Cordyccpin....................................................25

2.2.5.2.

Phương pháp tách chiết Polysaccharide............................................... 26

3.1. Đặc điểm sinh học các chủng nấm ký sinh côn trùng................................ 27
3.2. Lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp............................................... 28
3.3. Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp..................................................... 31
3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khá năng sinh trường phát triển của chúng nấm .32


3.4.1.

Anh hướng của nhiệt độ.......................................................................... 33

3.4.2.

Ánh hưởng của pH môi trường ban đầu................................................. 34

3.4.3.

Ánh hướng của nong độ.......................................................................... 36

3.4.4.

Ảnh hường của thể tích........................................................................... 38

3.5.

Nghiên cứu lên men sinh tống hợp các chất có hoạt tính sinh học cùa

chúng nấm (trong hệ thống binh lên men 5 lít).................................................... 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 43

Nguyễn Thị Thu Hiền

iii


Khóa luận tốt nghiệp


Khoa CNSH- 1302

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Bàng phân loại khoa học....................................................................3
Bàng 1.2. Mơ tả hình thái một số loài nấm thuộc chi Cordyceps................... 5
Bảng 3.1. Đặc điêm sinh học cùa các chúng nâm ký sinh côn trùng.............. 27

Bảng 3. 2. Hình thái khuẩn lạc của chùng nấm c. militaris FNA5 trên các môi
trường khác nhau theo thời gian nuôi cấy.......................................................... 28

Bảng 3. 3. Khả năng phát triên của chùng c. miìitaris FNA5 trên các nhiệt độ
khác nhau theo thời gian (đường kính khuẩn lạc, cm)...................................... 33
Bảng 3. 4. Lượng sinh khối thu được chùng c. militaris FNA5 trên các giá trị

pH khác nhau theo thời gian............................................................................... 35
Báng 3. 5. Lượng sinh khối thu được chúng c. militaris FNA5 trên các giá trị

nồng độ khác nhau theo thời gian...................................................................... 37
Báng 3. 6. Lượng sinh khối thu được chủng c. militaris FNA5 trên các giá trị

thể tích khác nhau theo thời gian........................................................................39

Nguyễn Thị Thu Hiền

iv


Khóa luận tốt nghiệp


Khoa CNSH- 1302

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Nấm Đơng trùng hạ thào lồi Corđyceps militaris............................ 4
Hình 1.2. Một số hình thái của các chúng nấm thuộc chi Cordyceps.............. 5
Hình 1.3. Hình thái tự nhiên một số lồi nấm :A- c. sinensnis; B-C. gunnii;

C-C. barnesii; D- c. gracilis; E- c. Uangshanensis; F-C. militaris.................. 6
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học cùa Cordycepin và Adenosine............................... 8

Hình 3.1. Hình ánh bề mặt khuấn lạc chúng FNA5 trên đĩa thạch sau 15 ngày

nuôi cấy................................................................................................................... 28

Hình 3.2 Hình thái túi bào tử lúc mới nẩy mầm và bào tử khi trưởng thành
chùng FNA5 sau 10 ngày nuôi cấy (SEM, X 3.500 và 7.500 lần)..................... 29

Hình 3. 3. Hình thái khuẩn lạc chủng c. militaris FNA5 trên các môi trường

rắn theo thời gian nuôi cấy..................................................................................... 29

Hình 3. 4. Biếu đồ đường kính khuẩn lạc của chúng c. militaris FNA5 trên
các môi trường khác nhau theo thời gian (đường kính khuẩn lạc, cm)............31

Hình 3.5. Biểu đồ sự ánh hưởng cúa các môi trường khác nhau tới khá năng
phát triển của chúng c. militaris FNA5 theo thời gian ni cấy...................... 31

Hình 3.6. Biếu đồ sự ánh hướng cùa các môi trường khác nhau tới khá năng
sinh EPS của chủng c. militaris FNA5 theo thời gian nuôi cấy....................... 31

Hình 3.7. Hoạt tính đối kháng chùng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
CNLM của dịch sau lên men chùng c. militaris FNA5 trên mơi trường MPA
theo thời gian ni cấy........................................................................................... 32

Hình 3.8. Ảnh hưởng cúa nhiệt độ tới sự phát triến của chúng nấm FNA5 trên
đĩa petri sau 7 ngày................................................................................................ 33

Hình 3. 9. Khá năng sinh trưởng và phát triến cùa nấm c. militaris FNA5 ớ

các giá trị pH khác nhau.........................................................................................35
Hình 3. 10. Hàm lượng EPS thu được chủng c. militaris FNA5 trên các giá trị
pH khác nhau theo thời gian................................................................................. 36

Nguyễn Thị Thu Hiền


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

Hình 3. 11. Khà năng sinh trướng và phát triển cùa nấm c. mỉlỉtaris FNA5 ở

các tý lệ giống......................................................................................................... 37
Hình 3. 12. Hàm lượng EPS thu được chững c. militaris FNA5 trên các giá trị

nồng độ khác nhau theo thời gian..........................................................................38
Hình 3. 13. Khả năng sinh trưởng và phát triến của nấm c. militaris FNA5 ờ

các thể tích khác nhau.............................................................................................38
Hình 3. 14. Hàm lượng EPS thu được chủng c. militaris FNA5 trên các giá trị


thế tích khác nhau theo thời gian........................................................................... 39

Hình 3. 15. Chu kỳ sinh trướng cùa chúng c. miỉitaris FNA5 trong thời gian
18.5 ngày................................................................................................................ 40

Hình 3. 16. Kết quả đo phố xác định hàm lượng cordycepin trong dịch lên
men của chúng nấm c. militaris FNA5............................................................... 41

Nguyễn Thị Thu Hiền

vi


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH-1302

DANH MỤC VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nội dung

EPS

Exopolysaccharide (Extracellular polysaccharide)

Polysaccharide ngoại bào
rpm


Tốc độ lắc vịng/phút

w/v

Khối lượng/thể tích

w/w

Khối lượng/ khối lượng

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

Nguyễn Thị Thu Hiền

vii


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

MỞ ĐÀU
1. Đặt vấn đề
Nấm Đông trùng hạ thảo là một loại nấm ký sinh trên côn trùng, không
chỉ được các nhà khoa học nghiên cứu, mà cịn được cả xã hội quan tâm đến,

vì nấm là loại dược liệu quý, rất tốt cho sức khỏe con người, phù hợp với mọi

lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu niên, cho đến người già.

Theo các tài liệu ghi chép về đông dược cố, Đông trùng hạ tháo là một vị

thuốc bồi bồ hết sức q giá, có tác dụng tích cực đối với các bệnh như rối
loạn tình dục, thận hư, liệt dương, đau lưng, mói gối, ho hen, và có tác dụng

tốt đối với trẻ em còi xương chậm lớn. Một số nghiên cứu hiện tại gần đây đã
chi ra rằng nấm Đơng trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cường công năng

cúa tuyến thượng thận, cái thiện được chức năng thận, nâng cao năng lực
miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư và chất phóng xạ.

Trên thế giới, nấm Đông trùng hạ thào đã được các nhà khoa học

nghiên cứu và thu được rất nhiều thành tựu có giá trị. Với công nghệ sinh học
tiên tiến, nhiều nước đã thành công trong việc nuôi cấy nhân tạo các chủng
nấm thuộc chi Cordyceps và thương mại hóa các sản phàm cùa chúng.Hiện

nay, với phương pháp lên men được sử dụng chủ đạo, các sản phẩm thương
mại sinh khối nấm ký sinh đã được sán xuất rất thành công ớ Trung Quốc,
Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ. Các chất chiết xuất sau quá trình lên men chứa đầy

đú các hợp chất có hoạt tính sinh học tương tự như nấm ký sinh nguồn gốc tự
nhiên.

Ớ Việt Nam việc nghiên cứu về nấm Đơng trùng hạ thào vần cịn gặp
nhiều khó khăn cá về cơ sở vật chất cũng như kiến thức. Chúng ta sử dụng

chú yếu dựa trên khai thác tự nhiên hay nhập khẩu từ Trung Quốc, nguồn gốc

và chất lượng không rõ ràng, giá cá đắt đỏ và không đáp ứng được nhu cầu

cho xã hội.

Nguyễn Thị Thu Hiền

1


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

Đế góp phần vào nghiên cứu và phát triển nâng cao thị trường sán xuất

nấm dược liệu Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Nghiên cứu điều kiện lên men và thu hồi một số hoạt chất sinh học của

chùng nấm Cordyceps militaris FNA5

Với mục đích tìm ra được điều kiện

nuôi cấy phù hợp nhằm tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học bởi chủng
nấm Cordyceps militarisFNNS. Đồng thời đóng góp một phần nhỏ bé trong
việc xây dựng nền công nghiệp dược ở trong nước.

2. Mục tiêu nghiên cứu cua đề tài
Xác định được một số điều kiện lên men nấm Cordyceps miỉitaris
FNA5 và điều kiện thu hồi một số dược chất polysaccaridc, cordyccpin từ


sinh khối và dịch lên men của nấm nhằm ứng dụng trong sản xuất thực phấm
chức năng.

3. Đối tượng và nội dung nghiên cửu của đề tài

a. Đối tượng nghiên cứu
-

Chúng nấm Cordyceps militaris FNA5phân lập tại Việt Nam, nhận từ

bộ sưu tập giống cúa phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

b. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu một số điều kiện lên men (mơi trường, tỷ lệ tiếp giống, sục

khí, pH...) chủng nấm Cordyceps militaris FNA5 quy mơ 5 lít/mẻ để

sinh tổng hợp cordycepin, polysaccharide.

-

Nghiên cứu điều kiện tách chiết thu hồi các chất có hoạt tính sinh học
cordycepin, polysaccharide.

Nguyễn Thị Thu Hiền

2



Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

CHƯƠNG I. TĨNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giói thiệu về chủng nấm Đơng trùng hạ thảo

1.1.1. So’ lược về lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo
Hàng ngàn năm nay, Đông trùng hạ tháo (Cordyceps) được coi là thần

dược trong y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc.Trong y học cổ truyền
Trung Quốc, “Đông Trùng, Hạ Tháo” dùng đế chừa các bệnh về phối và hô
hấp, thận, gan, tim mạch; trị bệnh yếu sinh lý và cao huyết áp; trị rối loạn
miền dịch và chống ung thư (Zhou et al., 1998a,b).Tại viện Nghiên cứu nội
tiết Thượng Hải (Trung Quốc), nấm Đông trùng hạ thào đã được dùng để

chừa liệt dương có hiệu quả tốt. Vì vậy, nấm đông trùng hạ tháo được người
Trung Quốc xem như một loại dược tào quý, chi dùng cho vua chúa và người

giàu.
Nấm Cordyceps là một giống nấm túi, được các nhà khoa học Trung

Quốc phát hiện lần đầu tiên ở vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu
quý này thực chất là ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes hoặc
Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc ký sinh (Bàng 1.1.)


Bảng 1.1. Băng phân loại khoa học
Giói (Regnum)

Fungi

Ngành (phylum)

Ascomycota

Lớp (Class)

Ascomycetes

Bộ (Ordo)

Hypocreales

Họ (Familia)

Clavicipataceae

Chi (Genus)

Cordyceps

Lồi (Species)

c. miìitaris

Đơng trùng hạ thảo cịn có tên gọi khác là Trùng thảo hay Hạ thào đơng


trùng. Chi nấm Cordycepsgồm khoảng 400 lồi đã được miêu tả, chỉ riêng
Trung Quốc đã tìm thấy 60 lồi (Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006).

Nguyễn Thị Thu Hiền

3


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

Tuy nhiên cho đến nay người ta chi nghiên cứu nhiều nhất được về 2 loài
Cordyceps sinensis ( Berkeley, 1843) và Cordyceps miỉitaris Link.

Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, c. militaris là một lồi
nấm ký sinh trên cơn trùng và ấu trùng của cơn trùng. Lồi này chú yếu lây

nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ

thế ký chú vào mùa đông. Bào tứ nấm theo gió dính vào bên ngồi ký chú,

sau đó từ bào từ hình thành các ổng nảy mầm có các the bám. Các ống này
tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài cúa ký chu

và xâm nhập vào bên trong cơ thể. Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh

trưởng mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thế và gây chết ký chủ. Đen cuối hè hoặc
thu q thể nhơ ra ngồi đế phát tán bào tử vào khơng khí (Kobayasi et aỉ.,


1982; Kamblc et al., 2012). Do đó,nó có tên gọi là nấm Đơng trùng hạ thảo.

Các quá thể nấm c. nùlitaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam
(Zheng et al., 2011) (Hình 1.1).

Hình 1.1. Nấm Đơng trùng hạ tháo lồi Cordyceps militaris

Đơng trùng hạ thảo ở ngồi tự nhiên , người ta có thể trơng rõ hình con
sâu, với đi là một cành nhó, mọc lá. Khi sẩy khơ, nó có mùi tanh như cá,
đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 11 cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non
giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm. Bên

ngồi có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở

gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đi giống như đi con tằm, có
tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đơi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong

Nguyễn Thị Thu Hiền

4


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột

bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng, có nhiều sợi nấm nên khá dai và bên

trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà (Đái Duy Ban và Lưu Tham Mun,

2009) (Hình 1.2).

Hình 1.2. Một số hình thái của các chúng nấm thuộc chi Cordyceps
Bảng 1.2. Mô tả hình thái một số lồi nấm thuộc chi Cordyceps
Lồi

c. sinesis

c. gtinnii

Ấu trùng

Chất nền

Phần cơ thế giống như nhộng Chat nền hình trụ mành, chiều
tằm, có chiều dài từ 3-5 cm, dài 4-7 cm, đường kính
đường kính từ 3-8 mm, màu khống 3 mm, với đinh nhọn
vàng đạm tới vàng nâu.
vơ trùng
Phần cơ thế ấu trùng giống Chất nền hình trụ, mập mạp
như nhộng tằm, dài từ 3-6 và thô, 4-14 cm chiều dài và
cm, đường kính 3-10 mm, khống 4mm, với bulgy vô
vàng nâu đến nâu
trùng hoặc phân nhánh đinh

c. barnesii

c. liangshanensìs


Nguyễn Thị Thu Hiền

Cơ thể ấu trùng cong hỉnh Chất nền duy nhất, thanh
thận, ngắn, 1,5-2 cm chiều mánh và cong, 2-6 mm chiều
dài , đầu nhỏ với một cặp dài và khoảng 2mm đường
răng.
kính.
Cơ thế ấu trùng giống như Chat nen như sợi, phân nhánh
một con tằm, dày, chiều dài hoặc khơng phân nhánh, 103-6 cm, đường kính 6-10 30 cm chiều dài, đường kính
mm, bề mặt bèn ngoài màu 1 -2 mm.
nâu, nâu sẫm

5


Khóa luận tốt nghiệp

c. militaris

Khoa CNSH- 1302

Mơi chất dinh dưỡng khơng Chất nền phăng, hơi cong
có cơ thể ấu trùng
khống 5 cm chiều dài, màu
vàng cam đến màu đỏ da cam

Hình 1.3. Hình thái tự nhiên một số lồi nấm :A- c. sinensnis', B-C. gunnii;
C-C. hamesii; D- c. gracilis', E- c. liangshanensis; F-C. inilitaris


1.1.2. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên

Các chúng thuộc chi Cordyceps được thu mầu ở các vùng khác nhau
trên toàn thế giới. Đơng trùng hạ tháo được tìm thấy vào mùa hè ờ một số cao

nguyên cao hơn mặt biến từ 3500 đen 5000 mét thuộc các vùng Tây Tạng, Tứ
Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam... Mao và cộng sự (2000) đã mơ tà
đặc điếm hình thái, cơng dụng và ành minh họa cho 13 loài nấm thuộc chi

Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, gồm các loài: Cordyceps harnesii
Thwaites, C.capiata (Holmsk.:Fr.) Link., c. crassispora Zang, c. gunii
(Berk.) Berk., C.hawkesiiGray, c. kyushuensis Kobayasi, c. martialis Gray,

c. militaris (L.:Fr.) Link., c. nutans Pat., c. ophioglossoides (Ehrcnb.) Link.,
c. sinensis (Berk.) Sacc., c. soholifera (Hill.) Berk. Et Br., c. tubecuỉata

(Leb.) Maire.

Tuy nhiên theo một số nghiên cứu cho thấy, các thành viên cùa chi nấm

Cordyceps cịn có thể được tim thấy ớ Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bán và Việt
Nguyễn Thị Thu Hiền

6


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302


Nam (John et al., 2005). Như vậy, có the thấy thành phần lồi nấm Đơng

trùng hạ thào khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều lồi

có phạm vi phân bố rộng, các lồi có đặc điếm phân bố đặc hữu cho tìrng
vùng.

Quả thề của nấm c. militaris dùng làm thực phẩm, dùng trong các món
hầm, súp, trà ... ờ các nước Đông Nam Á như Hongkong, Đài Loan, Trung
Quốc. Liều lượng an tồn khoảng ít hon 2.5 g/kg thế trọng (Che et al., 2003).

Quá thế và sinh khối nấm cũng được sử dụng làm thuốc và bồi bố sức khóe

như nước uống, viên nhộng, rượu, trà... (Wang et al, 2006). Các loại thuốc
từ nấm này dùng duy trì chức năng thận, phối, chống lão hóa, điều hịa giấc
ngú, viêm phế qn mạn tính (Das et aỉ., 2010). Hiện có hon 30 loại, sán

phấm chăm sóc sức khỏe từ c. militaris trên thị trường (Huang et al.,
2010;Park et al., 2001; Kim et al., 2005; Shin et al., 2007; John & Matt, 2008;

Đái Duy Ban et al., 2009).
ỉ.2.

Một số chất có hoạt tính sinh học tù' nấm Đơng trùng hạ thảo
Trong nấm Cordycepscỏ các nhóm chất quan trọng là cordycepic acid,

cordycepin và polysaccharide có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh ung thư
và các bệnh do virus. Ngoài ba thành phần trên, khi phân tích nấm người ta

cịn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị là N-acetylgalactosamine,


adenosine, ergosterol và ergosterol ester, bioxanthracenes, hypoxanthine,

polysaccharide và exopolysaccharidc, chitinase, cicadapcptins, và myriocin,
các chất có hoạt tính sinh học là saccharide (trehalose và polysaccharide),

nucleoside (adenosine, inosine và cordyccpin), manitol và sterol (ergosterol).
1.2.1. Cordycepin

Cordycepin lan đau tiên được tách ra từ loài c. nỉilitaris (Cunningham

et al., 1950). Cordycepin là một hợp chất quan trọng trong nấm đông trùng hạ
tháo (Mina et al., 2005), chúng cũng được tìm thấy ở lồi c. sinensis và c.
kyushuensis. Cordyceps tự nhiên chứa lượng cordycepin vào khoảng 0,0066,36 mg/g. Trong sinh khối sinh nấm nuôi và quà the cùa Cordyceps, hàm

Nguyễn Thị Thu Hiền

1


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

lượng cordycepin ớ giai đoạn đầu sau khi được tách và nuôi thường thấp với
hàm lượng từ 0,006-1,64 mg/g. Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong

tự nhiên, nồng độ cordycepin trong quá thế c. mUitaris cao hơn c. sinensis
với hàm lượng lần lượt là 2,65 và 1,64 mg/g, trong khi trong nuôi cấy trong


các bình lên men hàm lượng chất này thu được là 1,59 mg/g tương đương với

c. sinensis trong tự nhiên (Lo et al., 2013).

Cordycepin

Adenosine

Hình 1. 4. Cấu trúc hóa học của Cordyccpin và Adenosine

Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có dạng

cúa nucleosid adenosin bị mất một oxy ờ vị trí 3’ phần đường ribose.
Cordycepin được phân lập lan đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris.
Bằng phân tích phố NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared),

cordycepin được xem như là một hợp chất có hoạt tính sinh học được ly trích

từ quả thể và sợi nấm. Cordyccpin có cơng thức C10H13N5O3 và có phân tử

lượng 251, điếm nóng chảy tại 230-231 °C, độ hấp thu cực đại tại 259 nm. Có
thế hồ tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nhưng khơng
hồ tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều nghiên cứu đã sử

dụng dung dịch muối khử trùng và đệm phosphat làm dung môi.
Các nhà khoa học thường sử dụng saline để khử trùng và đệm

phosphate để hòa tan cordycepin (Xuanwei et al., 2009). Cordycepin có khả
năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng virus. Gần đây, cordyccpin cũng
cho thấy khả năng điều hòa sản săn phẩm interleukines trong tế bào lympho T

(Mina et al., 2005). Cordycepin phát huy tác dụng gây độc tế bào thông qua
Nguyễn Thị Thu Hiền

8


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

methyl hóa acid nucleic, ức chế sự phát triển của Clostridium paraputrificum
và Clostridium pefringens nhưng khơng có tác động nào tới Bifidobacterium

spp. và Lactobacillus spp. do Ahn và cộng sự đã chứng minh năm 2000 (Lu et
al.,2ồ\2‘, Scok et ư/.,2009).
ỉ.2.2. Adenosine

Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quà the và được cho là phong phú
ở tất cá các loài thuộc chi Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 đến

14,15 mg/g. Khi thu nhận nấm Cordyceps spp.trong tự nhiên, nồng độ
adenosine là 2,45 ± 0,03 mg/g trong quả the và ở nam c. militaris cao hơn c.
sinensis, ở c. sinensis hàm lượng chi có l,643±0,03 mg/g, trong khi đó, hàm

lượng trong sợi nấm c. militaris lên men là 1,592±0,03 mg/g gần tương tự c.
sinensis trong tự nhiên (Lo et al., 2013). Adenosine được cho là có tác dụng
điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch(Shashidhara et al., 2013).
1.2.3. Polysaccharide

Trong nam Cordyceps chứa một lượng lớn polysaccharid, khoảng 3-8%


khối lượng, đây là một trong những hợp chất sinh học chínhvà được đánh giá

cao về giá trị dinh dưỡng trong sán xuất thực phẩm chức năng và sản xuất

thuốc phòng, chừa bệnh cho người và với cấu trúc phức tạp gồm cyclofuran
(đường

5C,

mạch

vịng),

beta-glucan;

beta-mannan;

và

phức

hợp

polysaccharide có cả đường 5C và 6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh,
dùng cá cầu nối alpha- và beta-).
Các Polysaccharide chính trong nấm Cordyceps là một dạng glucans
với các mối liên kết glycosidic chứa các liên kết: (1/3) - (1/6) - p glucan và

(1/3) -1 - glucan. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính cùa


polysaccharide đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide
thu nhận từ thực vật lại khơng có đặc diêm này, điêu này chỉ có thê giái thích

được thơng qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các
polysaccharide(Hui et al., 2011). Các polysaccharide có khả năng chống lại

Nguyễn Thị Thu Hiền

9


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

hoạt động của các tế bào ung thư chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo từ
đơn gián đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose,

arabinose, fucose, ribose và acid glucuronic.
Trong một so loài nam, polysaccharide liên kết với các protein hoặc

peptide tạo thành các hệ polysaccharide- protein hoặc polysaccharide- peptide
cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn (Hardeep et al., 2014; John và Matt,
2008; Lu et al., 2012). cấu trúc 1/3- p- glucans có khả năng kháng khối u

được biết nhiều nhất, theo các nhà nghiên cứu cho biết những glucan có được
hoạt tính sinh học này là do trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thang

hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tứ đường glucose liên kết với các

đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuồi bèn bao gồm các đơn

vị như acid glucuronic, xylose, arabinose, fucose hoặc ribose. Heteroglycan là
một nhóm lớn polysaccharide lớn hoạt tính sinh học đa dạng được phân loại

là galactan, fucan, xylan, mannan (John el al., 2008; Hardecp et al., 2014; Lu
etal., 2012).
1.2.4. Các họp chất khác

Acid Cordycepìc
Acid Cordycepic, một isomer của acid quinic, được nghiên cứu đầu tiên

ở Cordyceps sinensis năm 1957. cấu trúc tinh thế cúa acid cordyceptic được
xác định là D-mannitol. Mannitol là hợp chất sinh học chính có nhiều hoạt

tính quan trọng như kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho. Chất này tồn tại trong tự
nhiên chủ yếu ở rễ, thân và lá cây; được tỉm thấy nhiều trong nấm ăn, cà rốt

và rêu. Hàm lượng acid cordyceptic trong Cordyceps khống 7-29%.

Mannitol có cấu tạo gồm một alcohol và một đường, hoặc một polyol; tương
tự như xylitol hay sorbitol. Tuy nhiên, mannitol có xu hưởng loại bó ion

hydrogen trong nước làm dung dịch trở nên acid. Cơng thức hóa học của

mannitol là C6H|4O6, trọng lượng phân tử 182, nhiệt độ nóng cháy 166°c, tý
trọng 1,489 (20°C) và nhiệt độ sôi 290-295°C (467 kPa). Mannitol có nhiều

đặc tính quan trọng đã được sử dụng trong y học và thực phẩm, hàm lượng
Nguyễn Thị Thu Hiền


10


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

mannitol có trong quá thể nấm Cordyceps vào khống 29-85 mg/g, sợi nấm

có hàm lượng acid cordyceptic cao hơn so với trong quả thể (Zhoua et al.,
2009).
Protein và acid amin
Hàm lượng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 - 33% bao gồm

18 acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin,
methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin,
cystein và tryptophan. Các acid amin có hàm lượng cao nhất là glutamat,
arginin và acid aspartic và có dược tính cao nhất là arginin, glutamat,

tryptophan và tyrosin (Xuanwei Zhoua et al., 2009). Khi nghiên cứu họ
protein trong c. militaris cho thấy bộ gen c. mìlitaris chứa 61 họ protease
nhưng hầu hết là serin protease và metal lopcptidasc, 12 gcn mã hóa trypsin,

167 gen mã hóa protein kinase, 105 gen mã hóa glycosid hydrolase. Hơn

nữa, c. militaris sở hữu hầu hết các gen cần thiết cho hoạt động biến dưỡng
adenin và adenosin, ngoại trừ việc thiếu ribonucleotid triphosphat reductase
và deoxyadenosin kinase (Zheng et a/.,2Q \ 1).


Ergosterol
Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiền chất thiết yếu cùa

vitamin D2. Hàm lượng ergosterol ở c. militaris nuôi cấy rất cao (10,68mg/g),

cao hơn nhiều so với hệ sợi nấm chi có 1,44 mg/g và chỉ đứng
sau c.sinensis tự nhiên phân lập ở Tây Tạng (Xuanwei Zhoua et al., 2009).

Các ergosterol và các chất đồng dạng của nó có hoạt tính kháng virus, điều
hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giám immunoglobin A.

Acid béo và nguyên tố kim loại

Acid béo bao gồm carbon, hydro, và oxy và là thành phần chính của
lipid, phospholipid và glycolipid, chúng được phân loại thành acid béo no và

không no. Ớ Cordyceps, lượng acid béo no được tìm thấy là 57,84%. Acid

linoleic chiếm hàm lượng cao nhất 38,44%, tiếp đó là acid oleic 17,94%.Các

Nguyễn Thị Thu Hiền

11


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

acid béo nó chiếm 42,16% bao gồm C|4, C|5, C|6, c,7, C18. C20 và C22- Acid

palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là 21,86%
và 15,78%. Các acid béo khơng no có chức năng giảm lipid máu và bào vệ

chổng lại bệnh tim mạch, chứa một loạt các hợp chất dinh dưỡng như các acid
amin thiết yếu, vitamin E và K, các vitamin tan trong nước như B|, B2 và B12

và các nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi,

Se, Al, Si,Ti, Cr, Ga) (John et aỉ., 2005).

Nucleotid
Nucleotid (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là chất có nhiều

trong Cordyceps, có tác dụng kháng khối u, phóng thích các tín hiệu dần
truyền thần kinh, chống co giật... Trong đó, hàm lượng guanosin thường cao

nhất.

Hàm

lượng

nucleotid

trong Cordyceps nuôi

cấy

cao


hoai

hẳn Cordyceps tự nhiên. Hàm lượng các nucleotid trong tự nhiên thấp có thể
do sự thối biến các nucleotid trong qưá trình ú đơng. Khí hậu ấm và âm ướt

là điều kiện làm tăng nucleotid trong Cordyceps khi nuôi trên môi trường rắn

(Xuanwci Zhoua et a!., 2009).
1.3. Giá trị dược liệu cua các hoạt chất sinh học tói sức khỏe con người
Nấm Cordyceps có rất nhiều cơng dụng như là chống ung thư, chống di

căn, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, diệt khuẩn, hạ đường
huyết, chống lão hóa, bảo vệ thần kinh và bảo vệ thận. Cụ the, polysaccharide
đám nhiệm chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, chống di căn khối u,

điều hòa miễn dịch, hypoglycaemic, steroidogenic và hypolipidaemic.

Cordycepin đám nhiệm chống ung thư, trừ sâu, chống nhiễm khuấn.
Ergosterol ức chế ung thư, điều hòa miễn dịch (Shrestha et al., 2010; Zhoua et

aỉ., 2009).

Hiệu quá chong ung thư

Khả năng ức chế sự phát triển của các khối u được phát hiện ở nhiều
chi cùa loài Cordyceps. Các thành phần hoạt tính sinh học có tác động chống
ung thư chủ yếu là polysaccharide, sterol và adenosine. Trong đó, sterol và

Nguyễn Thị Thu Hiền


12


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

adenosine là các chú đề nghiên cứu nóng nhất về khá năng chống ung thư.

Cho tới nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể biết chính xác cơ chế ức chế sự

phát triển cúa tế bào ung thư cùa Cordyceps, cơ chế này có thế là tăng cường

chức năng cúa hệ thống miễn dịch và miễn dịch tự nhiên; ức chế có sự chọn
lọc tồng hợp RNA, từ đó ảnh hưởng tới tồng hợp protein; hoạt động chống
oxy hóa và chống các gốc tự do; chống đột biến; làm nhiễu quá trình sao chép

của virus cám ứng khối u; cám ứng methyl hóa acid nucleic (Shashidhara et
al„ 2013).
Tác động điểu hòa miền dịch
Các tác động chính của Cordyceps lên hệ thống miễn dịch vào các tế

bào như đáp ứng tăng sinh lymph, tế bào giết tự nhiên (NK), và kích thích tạo
thành: ngưng kết tố thực vật (PHA) interleukin-2 (1L-2) và tác nhân hoại tử tế

bào ung thư (TNF-a) trên các tế bào đơn nhân ớ người, đây là kết quả sự sản
xuất của cytokine. Các tác động trị liệu của nấm, như ngăn chặn bệnh tự

miền, dị úng cũng có liên quan đến tác động điều hòa miễn dịch (Xuanwei
Zhoua et al., 2009).


Khá năng điều hịa cơ thể, chong lão hóa, oxy hóa
Các thử nghiệm trên động vật cho thấy, Cordyceps có tác dụng báo vệ

gan cúa bệnh nhân, chống nhiễm virus A, viêm gan B mãn tính, viêm gan c,

xơ gan. Các hoạt chất của nấm hồ trợ tăng các tế bào có chức năng điều hịa,
đưa trạng thái HBeAg-dương tính về HBeAg-âm tính, tăng cường chức năng

gan và ức chế xơ gan (Zhou et aỉ., 2009). Ngồi ra, c. sinensis có nhiều ảnh
hướng đến hệ thống tim mạch, chăng hạn như tần số âm tính, cơ tim giám tiêu
thụ ơxy, cài thiện cơ tim thiếu máu cục bộ, chống đông tụ tiểu cầu, loạn nhịp.

Dịch chiết và tế bào nấm c. sinensis cũng cho thấy tác động lên hệ thần kinh

như giảm đau, chống co giật và thanh nhiệt. Trên hệ thống hơ hấp, dịch chiết
từ c. sinensis có tác dụng làm giãn cuống phổi nhờ quá trình tăng cường tiết

adrenaline từ tuyến thượng thận và co khí quàn nhờ histamine. Đồng thời, tác

dụng tới hormone, corticosterone trong hệ nội tiết của người (Klaunig, 2004).

Nguyễn Thị Thu Hiền

13


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302


Chống lão hố, chống các chứng viêm tấy được thể hiện trong cơng
trình nghiên cứu của Won và Park (2005). Ahn và cộng sự (2000) nhận định
nấm ĐTHT có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triên của một sổ

virus, vi khuẩn và nấm. Ngồi ra, nấm ĐTHT c. militaris cịn có tác dụng

kìm hãm sự oxy hố lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig,
2004).
Trong những năm gần đây, Cordyceps trớ thành nguồn nguyên liệu rất

quan trọng cho làm thuốc và thực phàm chức năng. Giá cà cùa chúng tăng lên

rất nhanh, có rất nhiều người đã canh tác chúng. Hiện tại, sự phát triển của

Cordyceps và các chế phẩm của chúng chủ yếu tập tiling vào ba hướng: thực

phấm ăn kiêng, thực phẩm chức năng và phát triển tính thuốc. Hầu hết các
hoạt chất sinh học chiết xuất từ Cordyceps như cordyccpin, cordyccpic acid,

và polysaccharide đều là các chất chống lão hóa và tác động tới điều hịa giấc

ngủ cũng đâ được cấp phép như một nguồn thuốc mới bởi SFDA của Trung
Quốc. Vì vậy, sứ dụng Cordyceps và cá dịch chiết, chúng ta có thể phát triến

rất nhiều sản phẩm nhờ cơng nghệ hiện đại, các sản phẩm này có rất nhiều
chức năng chủ yếu tập trung vào các phương diện: tăng cường thế chất, chổng

lão hóa, bảo vệ tim mạch, cải thiện giấc ngú, tăng ngon miện, tăng cường


miễn dịch (Shashihara et al., 2013).
1.4.

ủ ng dụng công nghệ lên men chìm nấm Cordyceps spp. để sản xuất
sinh khối và exopolysaccharide (EPS)

Nhiều cơng trình nghiên cứu đã khẳng định sinh khối nấm Cordyceps

spp. có chứa nhiều hợp chất có giá trị như: 14-19 acid amin khác nhau, 11 loại
bioxanthracen, beauvericin, chất béo, cordycedipeptide, cordyceamide,
adenosine, cordycepin, exopolysaccharide... Một trong những chất có hoạt

tính sinh học cao đang được quan tâm là expolysaccharide, được chứng minh

có khả năng tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chống hạ

Nguyễn Thị Thu Hiền

14


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

đường huyết, chổng ơxi hóa và kháng tế bào ung thư (Xiao et al., 2004; Yang
etal., 2013).

EPS là thành phần chính trong q trình tạo thành tế bào nấm


Cordyceps spp. nên sự tích lũy EPS trong mơi trường lên men có mối tương
quan chặt chẽ với sinh khối nấm tạo ra (Cui, Zhang, 2010). Phương pháp lên
men tạo quả thể trên giá thế nhân tạo địi hỏi thời gian ni cấy dài ngày, tốn
diện tích, dễ bị nhiễm tạp. Ngược lại, phương pháp lên men chìm có ưu diem
thu nhận sinh khối trong thời gian ngắn trong không gian nhở, tránh nhiễm

tạp (Kim et aỉ., 2002; Cha et al., 2007). Tuy nhiên, do sàn lượng sinh khối

thấp nên các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tối ưu thành phần môi

trường, điều kiện lên men nhằm nâng cao hàm lượng sinh khối và tổng hợp

cxpolysaccharidc của các chúng Cordyceps spp.
Năm 2002, Kim et aỉ. cơng bố chủng nấm c. miỉitaris trong nghiên cứu

có hàm lượng sinh khối và EPS cao nhất, đạt lần 12,73 g/L và 7,3 g/L trên
thiết bị lên men KF-250 quy mơ 5 Lít có thành phần mơi trường gồm 60 g/L
sucrose; 10 g/L polypeptone; 0,5 g/L KH2PO4. Kết quả ghi nhận ở pH 6,0;

nhiệt độ 25°C; lưu lượng khí 2 vvm; tốc độ khuấy 150 vịng/phút; 10 ngày lên
men. Hình thái hệ sợi có sự biến đối mạnh khi tại hai điều kiện chinh pH và
khơng chình pH trong q trình lên men (Kim et al., 2002).
Các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố kết quá tối ưu khà năng sinh

trưởng của chủng c. jiangxiensis JXPJ 0109 và tồng hợp EPS trong lên men
chìm. Các kết q cơng bố cho thấy, hàm lượng sinh khối khô đạt cực đại
(14,5 g/L) trên môi trường lên men gom 15 g/L maltose; 10 g/L glycerol; 10

g/L tryptone; 10 g/L cao nấm men; 1 g/L KH2PO4; 0,2 g/L MgSO4; 0,5 g/L
CaCl2, pH 5,0 ớ nhiệt độ 26°c sau 8 ngày. Khi sứ dụng mơi trường tối ưu có

thành phần 20 g/L maltose; 8 g/L glycerol; 5 g/L tryptone; 10 g/L cao nấm

men; 1 g/L KH2PO4; 0,5 g/L CaCl2; pH 7,0 ờ 28°c thì hàm lượng EPS đạt 3,5
g/L sau 10 ngày lên men. Đây là báo cáo đầu tiên trên thế giới đánh giá chi

Nguyễn Thị Thu Hiền

15


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302

tiết về ảnh hường cúa từng yếu tố tới khả năng tạo sinh khối và EPS cúa loài

c. jiangxiensis (Xiao et a!., 2004).
Do các sàn pham trao đối chất trong quá trình lên men nấm Cordyceps

spp. rất phong phú nên chủng giống có vai trị quyết định đến chất lượng và
hàm lượng sản phẩm tạo thành. Kim & Yun (2005) đã khẳng định lập luận
trên khi so sánh quá trình tối ưu thu nhận EPS từ chủng c. militaris và c.

sinensis trên quy mơ bình tam giác và thiết bị lên men 5 lít. Với môi trường
tối ưu gồm 40 g/L sucrose; 5 g/L cao ngô; pH 8,0; nhiệt độ 30°C, sinh khối
khô, EPS, cordycepin từ chúng c. militaris đạt cực đại (22,9 g/L và 5 g/L)

sau 16 ngày nuôi cấy. Trái lại, chủng c. sinensis có khả năng sinh trường và
tổng hợp EPS thấp hom (20,9 g/L và 4,9 g/L) trên môi trường tối ưu gồm 20


g/L sucrose; 25 g/L cao ngô; 0,78 g/L CaCl2; 1,73 MgSO4.7H2O; pH 4,0;

nhiệt độ 20°C. Hàm lượng cordycepin thu nhận cùng điều kiện trong nghiên
cứu cùa chủng Cordyceps sp.gằp 2,1 lan so với chùng c. sinensis (Kim và
Yun, 2005). Nhóm nghiên cứu của Cui và Zhang (2010) đã nâng cao khả

năng sinh EPS ở 3 điều kiện lên men: lắc, tĩnh và hai giai đoạn (140 giờ lắc,
130 giờ tĩnh), hàm lượng EPS đạt 3,2 g/L sau khi tối ưu quá trình lên men hai

giai đoạn. Đồng thời gấp 2,3 lần so với điều kiện tĩnh và 1,6 lần so với lên

men trong điều kiện lắc.
Nhàm tăng khả năng sinh trưởng và tống hợp EPS, nhiều nhà nghiên

cứu đã sử dụng một số chất kích thích q trình sinh trướng cùa các chúng

Cordyceps spp. Tác giả Yang et al. (2000) cho rằng acid có tác động mạnh
đến tốc độ sinh trường của chúng c. militaris. Báo cáo cúa Park et al. (2002)
đã chứng minh hiệu quá tống hợp EPS được nâng cao khi bổ sung dầu thực

vật trong lên men chìm. Ngồi ra, một số chất hoạt hóa bề mặt như Tween 80

hay glycerol cũng được chứng minh làm tăng hiệu quả dẫn truyền chất dinh
dưỡng từ môi trường lên men lên thành tế bào nấm (Liu và Wu, 2012).

Nguyễn Thị Thu Hiền

16



Khóa luận tốt nghiệp

1.5.

Khoa CNSH- 1302

Thu hồi sinh khối và hoạt chất từ Cordyceps spp.

Một yếu tố đóng vai trị quan trọng mang ý nghĩa quyết định trong quá

trình lên men chính là thu hồi, tách chiết sản phẩm tạo thành. Hiện nay có rất

nhiều phương pháp đế tách chiết các chất có hoạt tính sinh học cao từ
Cordyceps spp. như sứ dụng nước, dung môi. Nước được sử dụng để tách
chiết polysaccharide từ nấm c. sinensis với tỷ lệ nước: sinh khối = 2,5:1, pH

7,5-8,0 trong 24 giờ (Sun, Zhang, 2003). Wang và cộng sự (2005) cho ràng

khi sử dụng sóng siêu âm kết hợp với nước với tỳ lệ quả thể nấm c. militaris-.

nước = 1:10, lặp lại 3 lần quá trình tách chiết trong 90 phút cho hiệu quả tách
chiết cordycepin và polysaccharide cao. Phương pháp trên khá hiệu quả khi

thay đồi tỷ lệ nước nóng lên 25-30% khi tách chiết chất chống oxy hóa. Ngồi
ra, methanol và ethanol cũng được chúng minh có tác dụng hiệu quả trong
tách chiết nucleoside, polysaccharide, protein. Trong đó, yếu tố ánh hưởng

mạnh đền hiệu suất tách chiết cordycepin là tý lệ cồn và thời gian. Khi tối ưu
tỳ lệ mẫu: ethanol 20% = 1:33 kết hợp sóng siêu âm thu nồng độ cordycepin


đạt cực đại (Song et al., 2007). Chiết xuất bằng ethanol có hiệu quá chống
oxy hóa mạnh, tăng cường miễn dịch. Tuy nhiên, dịch chiết xuất sinh khối c.

sinensis với methanol lại thề hiện độc tính ức chế tế bào ung thư mạnh.
Hàm lượng các chất như carbohydrates, adenosine, ergosterol,

cordycepin được chiết xuất từ Cordyceps spp. với dung mơi ethyl acetate có
hàm lượng khác biệt so với khi tách chiết bằng nước và cồn. Những nhóm

họp chất này the hiện tác động mạnh trong chống ơxy hóa, đáp ứng miễn dịch
tế bào, ức ché tế bào ung thư. Hiệu suất thu hồi khi sử dụng ethyl acetate

trong tách chiết các chất thấp hơn nhiều so với nước và cồn. Tuy nhiên, hàm

lượng chất ergosterol thu được lại cao hơn khi chiết bằng dung môi ethyl
acetate, đây là nhân tố chính trong tác động gây độc thế bào bạch cầu tủy
HL60 với hàm lượng ED đạt 50 ± 25 pg/mL sau 2 ngày điều trị (Zhang et al.,

2005). Nhìn chung, q trình tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ

Cordyceps spp. kết hợp sứ dụng sóng siêu âm cho kết quá thu hồi sàn phẩm
Nguyễn Thị Thu Hiền

17


Khóa luận tốt nghiệp

Khoa CNSH- 1302


cao và đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu cùa các nhà khoa học trên thế
giới.
Hiện nay, tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học bang CO2 siêu
tới hạn đang là một công nghệ mới được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ

hóa chất và thực phẩm. Các chất thu được trong cơng nghệ này có độ tinh
sạch cao, ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư trực tràng, gan và đặc biệt

không cần phải sử dụng các loại dung môi- ngun nhân gây ơ nhiễm mơi
trường (Shin et al., 2003).

1.6.

Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo trong và ngồi

nước
1.6.1. Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo trên thế giói

Trên thế giới, nấm Đơng trùng hạ thảo đã được các nhà khoa học

nghiên cứu và thu được rất nhiều thành tựu có giá trị cao. Từ năm 1998, ở
Trung Quốc đã có những nghiên cứu đi sâu vào các hoạt chất sinh học có

trong Cordyceps trong đó chủ yếu tập trung vào các hợp chat polysaccharide,
adenosine, cordycepin, cordycepic acid. Các nước khác như Nhật Băn, Hàn
Quốc, Đài Loan... cũng nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất các sân phẩm từ

các chủng nấm thuộc chi Cordyceps và thu lại hiệu quả kinh tế cao. Nhiều

công trinh nghiên cứu đã khăng định sinh khối nấm Cordyceps spp. có chứa

nhiều hợp chất có giá trị như: 14-19 acid amin khác nhau, 11 loại

bioxanthracen, beauvericin, chất béo, cordyccdipcptide, cordyccamidc,
adenosine, cordycepin, exopolysaccharide... Một trong những chất có hoạt

tính sinh học cao đang được quan tâm là cxpolysaccharidc, được chứng minh
có khà năng tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chống hạ
đường huyết, chổng ơxi hóa và kháng tế bào ung thư (Xiao et al., 2004; Yang
etal., 2013).

Với công nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước đã thành công trong việc

nuôi cấy Cordyceps trong phịng thí nghiệm và phát triển nền cơng nghiệp sản
xuất các sản phẩm từ nấm Cordyceps. Ví dụ, Công ty Biofact life (Malaysia)
đã kết họp công nghệ tiên tiến cùa Nhật và các nước khác nuôi cấy thành

Nguyễn Thị Thu Hiền

18