BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN XUÂN CHIẾN
Mã sinh viên: 1701057

NHÂN DÒNG, THIẾT KẾ VECTOR BIỂU
HIỆN XYLANASE TÁI TỔ HỢP TRONG
PICHIA PASTORIS GS115
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Đào Thị Mai Anh
2. TS. Đỗ Thị Tun
Nơi thực hiện:
1. Bộ mơn Hóa Sinh
2. Viện Cơng nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI - 2022


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin được gửi lời cảm ơn đến tồn thể các thầy cơ giáo của Trường
Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức quý báu
cho em trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường. Em xin chân thành cảm ơn
các thầy cơ bộ mơn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội. Em xin cảm ơn các anh chị
tại phịng Cơng nghệ sinh học enzym - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn em trong
quá trình thực tập, nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên đã định hướng ý tưởng nghiên

cứu, tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ dạy kiến thức chuyên môn và tạo
điều kiện tốt nhất giúp em học tập, rèn luyện và thực hiện khóa luận trong suốt q trình
thực tập tại phịng Cơng nghệ sinh học enzym - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đào Thị Mai Anh.
Cô không những là một người thầy tận tâm giúp em tìm ra đam mê của mình, giúp em
định hướng bước đi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học, mà cơ cịn là một
điểm tựa cho em những lời khuyên chân thành trong cuộc sống, tiếp thêm động lực cho
em trong suốt thời gian qua. Đây sẽ là những hành trang quý giá để em có thể tự tin,
vững chãi hơn trên con đường sự nghiệp và cuộc sống mai này.
Em xin cảm ơn đề tài nghiên cứu khoa học cấp Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam: “Tạo chủng Aspergillus niger tái tổ hợp sinh tổng hợp enzym xylanase hoạt
tính cao định hướng ứng dụng làm thực phẩm chức năng”, mã số 106.02-2018.37 do
TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm đã cung cấp kinh phí để thực hiện nghiên cứu này.
Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ, người thân trong
gia đình, bạn bè đã ln bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em
trên con đường học tập và rèn luyện bản thân.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2022
Sinh Viên

Nguyễn Xuân Chiến


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3

1.1. Enzym xylanase ....................................................................................................3
1.1.1. Định nghĩa..................................................................................................... 3
1.1.2. Phân loại ....................................................................................................... 3
1.1.3. Nguồn gốc và đặc tính .................................................................................. 3
1.1.4. Ứng dụng ...................................................................................................... 4
1.2. Xylanase từ Aspergillus ........................................................................................6
1.2.1. Chi Aspergillus ............................................................................................. 6
1.2.2. Gen mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger ........................................ 7
1.3. Vector biểu hiện và chủng biểu hiện P. pastoris ..................................................8
1.3.1. Chủng biểu hiện P. pastoris.......................................................................... 8
1.3.2. Vector biểu hiện ............................................................................................ 8
1.4. Tình hình nghiên cứu biểu hiện xylanase .............................................................9
1.4.1. Trên thế giới .................................................................................................. 9
1.4.2. Ở Việt Nam ................................................................................................. 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 12
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị..................................................................................12
2.1.1. Chủng giống ................................................................................................ 12
2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................... 12
2.1.3. Các dung dịch và đệm................................................................................. 12
2.1.4. Môi trường .................................................................................................. 14
2.1.5. Máy móc và thiết bị thí nghiệm .................................................................. 14
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................15
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................16
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy ................................................................................ 16
2.3.2. Phương pháp khuếch đại gen từ khuôn ADN tổng số ................................ 16


2.3.3. Phương pháp nối ghép gen ngoại lai .......................................................... 16
2.3.4. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào E. coli ............................ 17
2.3.5. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ tế bào E. coli ............................. 17

2.3.6. Điện di ADN trên gel agarose .................................................................... 18
2.3.7. Xử lý ADN plasmid bằng enzym cắt giới hạn............................................ 18
2.3.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose .................................................................... 18
2.3.9. Biến nạp ADN plasmid vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
............................................................................................................................... 19
2.3.10. Tách chiết ADN tổng số nấm men ........................................................... 19
2.3.11. Xác định hoạt tính xylanase ...................................................................... 20
2.3.11.1. Định tính xylanase ..............................................................................20
2.3.11.2. Định lượng xylanase ...........................................................................20
2.3.12. Điện di protein trên gel polyacrylamid (SDS-PAGE) .............................. 21
2.3.13. Xử lý số liệu .............................................................................................. 22
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................... 23
3.1. Kết quả ................................................................................................................23
3.1.1. Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase D từ A. niger
DSM1957 .............................................................................................................. 23
3.1.1.1. Nhân dòng gen mã hóa xylanase D ......................................................23
3.1.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pPICZαA/xlnD (pPXlnD) ............................25
3.1.1.3. Tạo chủng P. pastoris GS115 mang gen xln D ....................................28
3.1.2. Biểu hiện rXlnD tái tổ hợp trong P. pastoris.............................................. 30
3.1.2.1. Nghiên cứu thời gian biểu hiện ............................................................32
3.1.2.2. Nghiên cứu nồng độ methanol cảm ứng...............................................33
3.2. Bàn luận ..............................................................................................................33
3.2.1. Kết quả nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase D từ A.
niger DSM1957 .................................................................................................... 34
3.2.2. Kết quả biểu hiện rXlnD tái tổ hợp............................................................. 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................................... 39


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt


Tiếng Anh

Tiếng Việt

AOX1

Alcohol oxidase 1

AOX2

Alcohol oxidase 2

ADN

Deoxyribonucleic acid

APS
Bis acrylamid
bp
CAGR

Ammonium persulfate
N, N’-Methylen-bis-acrylamid

Ammonium persulfat

Base pair
Compounded Annual Growth


Cặp base nitơ
Tốc độ tăng trưởng hàng năm kép

rate
CAZy

Carbohydrate-Active enzymes

Cơ sở dữ liệu enzym carbohydrat

Database
DNS

Dinitro salysilic acid

Acid dinitro salysilic

dNTP
EDTA

Deoxynucleoside triphosphate
Ethylen diamin tetra acetic
acid

Acid ethylen diamin tetraacetic

GH
kb
kDa
MUT

MW

Glycosid hydrolase
Kilo base
Kilo Dalton
Methanol utilisation pathway
Molecular weight

Con đường sử dụng methanol
Khối lượng phân tử

OD

Optical density

Mật độ quang

PAGE

Polyacrylamide gel

Điện di trên gel polyacrylamid

electrophoresis
SDS

Sodium dodecyl sulfate

Natri dodecyl sulfat


SmF

Submerged fermentation

Lên men chìm

SSF

Solid state fermentation

Lên men rắn

TEMED

N,N,N’,N’-

Tris

Tetramethylethylenediamin
Tris-(hydroxymethyl)
aminomethan

VTCC

Vietnam Type Culture

Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt

Collection


Nam

v/v
w/v

Volume/volume
Weight/volume

XOS

Xylo-oligosaccharide

YNB

Yeast Nitrogen Base

Yeast Nitrogen Base


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Nguồn gốc và vai trò của các oligosaccharid khác nhau [10] ........................5
Bảng 1.2. Đặc điểm gen mã hóa xylanase từ chủng A. niger [73]. .................................7
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu..............................................12
Bảng 2.2. Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ............................................................12
Bảng 2.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu ..........................................................14
Bảng 2.4. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ..........................................14
Bảng 2.5. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu..................................................16
Bảng 2.6. Thành phần gel polyacrylamid 12,5% ..........................................................22



DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo của vector biểu hiện pPICZ A [31] ....................................................9
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................................15
Hình 2.2. Đường chuẩn xylose ......................................................................................21
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm PCR .............................................................................23
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pJXlnD ...................................................24
Hình 3.3. Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pJXlnD với EcoRI và NotI ..........................24
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch .......................................................................25
Hình 3.5. Sản phẩm tách plasmid pPXlnD ....................................................................26
Hình 3.6. Sản phẩm cắt plasmid pPXlnD với enzym EcoRI và NotI............................26
Hình 3.7. Trình tự gen mã hóa xylanase D từ chủng A. niger DSM1957 và trình tự amino
acid suy diễn ..................................................................................................................28
Hình 3.8. Điện di đồ tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pPXlnD với enzym SacI ...........28
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm tách ADN nấm men .....................................................29
Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen xln D với cặp mồi đặc hiệu ......30
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen xln D với cặp mồi AOX1.........30
Hình 3.12. Vịng thủy phân cơ chất xylan của dịch ngoại bào chủng tái tổ hợp XpPXlnD
.......................................................................................................................................31
Hình 3.13. Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra hệ thống biểu hiện rXlnD trong P. pastoris
GS115 ............................................................................................................................32
Hình 3.14. Nghiên cứu thời gian biểu hiện rXlnD ........................................................32
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ MeOH cảm ứng lên mức độ biểu hiện rXlnD .....33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xylanase là enzym xúc tác quá trình thủy phân liên kết β - 1,4 của xylan,
polysaccharid phong phú lớn thứ hai và là thành phần chính của thành tế bào thực vật.
Thành tế bào thực vật là một nguyên liệu tổng hợp bao gồm cellulose (chiếm 35-50%),
hemicellulose (chủ yếu là xylan) (chiếm 20-30%) và lignin (chiếm 20-30%) liên kết chặt
chẽ với nhau [11]. Tác dụng của xylanase giúp chuyển đổi chất cao phân tử thành

xylooligosaccharid và xylose. Các sản phẩm thủy phân này là nguyên liệu cần thiết cho
nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: Công nghiệp thực phẩm [39], thức ăn chăn
nuôi [12], công nghiệp giấy và bột giấy [40], [76], nhiên liệu sinh học [40], xử lý chất
thải công nghiệp [67] và đặc biệt gần đây nhất là công nghiệp dược phẩm [18], [64].
Theo báo cáo phân tích của Grand View Research, quy mơ thị trường enzym toàn cầu
được định giá 10,69 tỷ USD vào năm 2020 và dự kiến sẽ mở rộng với tốc độ tăng trưởng
kép hàng năm (CAGR) 6,5% từ năm 2021 đến năm 2028. Phân khúc carbohydrase (được
phân loại thành amylase, xylanase, cellulose, pectinase và lactase) thống trị thị trường
với tỷ trọng doanh thu trên 45,0% vào năm 2020. Nguyên nhân của hiện tượng này là
do nhu cầu ngày càng tăng từ các ngành công nghiệp sử dụng sản phẩm thủy phân cuối
cùng của xylan. Bên cạnh đó, nhận thức của người tiêu dùng về sức khỏe tăng cũng thúc
đẩy việc tiêu thụ và kích thích nhu cầu sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc là
sản phẩm thủy phân xylan [30].
Phần lớn các q trình cơng nghiệp được thực hiện ở nhiệt độ cao và pH khác
nhau, do đó để đảm bảo được nguồn cung đáp ứng nhu cầu kể trên, thách thức mà ngành
công nghiệp enzym phải đối mặt chính là độ nhạy cao của các enzym đối với nhiệt độ
và độ pH và các vấn đề liên quan đến xử lý sản phẩm. Cũng vì lý do này mà các enzym
bền với nhiệt, ổn định trong môi trường kiềm hoặc trong mơi trường acid sẽ có ưu thế
rất lớn [9]. Việc phân lập và sàng lọc các vi sinh vật ưa nhiệt, do đó đã được chú ý nhiều
hơn để tìm các sinh vật sản xuất xylanase bền nhiệt mới [71]. Kết quả cho thấy loài
Aspergillus fumigates, Bacillus pumilus, Trichoderma reesei và Bacillus firmus sinh ra
các xylanase có khả năng điều chỉnh nhiệt và có thể chịu được nhiệt độ rất cao. Tuy
nhiên, các xylanase tự nhiên, từ vi sinh vật, được sản xuất với số lượng rất thấp do thiếu
các điều kiện thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn hoặc các thông số lên men khơng
tương thích. Việc duy trì nhiệt độ cao trong các thiết bị lên men để sản xuất quy mô lớn
sẽ rất khó khăn. Đây được xem là một vấn đề nan giải trong cơng cuộc tìm ra xylanase
ứng dụng tốt cho các ngành công nghiệp.
Trước thực tế này, việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến việc sản xuất và
tạo ra các xylanase công nghiệp sẽ làm nên bước chuyển biến lớn trong lĩnh vực công
nghiệp enzym. Khi sử dụng kỹ thuật nhân dịng gen xylanase bằng cơng nghệ tái tổ hợp,

việc chọn lọc có thể được thực hiện nhằm sản xuất ra được các enzym tái tổ hợp với
1


nhiều đặc tính tốt hơn so với enzym tự nhiên. Với mục đích này, chúng tơi tiến hành đề
tài: “Nhân dòng, thiết kế vector biểu hiện xylanase D tái tổ hợp trong Pichia pastoris
GS115” với mục tiêu:
(1) Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện xylanase D từ chủng Aspergillus niger
DSM1957
(2) Biểu hiện được xylanase D trong Pichia pastoris GS115

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Enzym xylanase
1.1.1. Định nghĩa
Xylanase là glycosidase (O-glycosid hydrolase, EC 3.2.1.x) xúc tác quá trình
thủy phân các liên kết 1,4-β-D-xylosidic trong xylan. Các enzym này giúp phân giải
polysaccharid xylan mạch thẳng thành xylose, một nguồn carbon chính cho quá trình
trao đổi chất của tế bào vi sinh vật.
Xylanase được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1955 [38], ban đầu chúng được gọi
là pentosanase, và được Liên minh Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế (IUBMB)
công nhận vào năm 1961 khi được gán mã enzym EC 3.2.1.8. Tên chính thức của chúng
là endo-1,4-β-xylanase, nhưng các thuật ngữ đồng nghĩa thường được sử dụng bao gồm
xylanase, endoxylanase, 1,4-β-D-xylan-xylanohydrolase, endo-1,4-β-D-xylanase, β1,4-xylanase và β-xylanase.
1.1.2. Phân loại
Hệ thống phân loại các xylanase được giới thiệu năm 1989 [34] phân loại dựa
trên sự so sánh cấu trúc sơ cấp của các vùng xúc tác và các nhóm enzym trong các họ
có trình tự liên quan. Phân loại ban đầu đã nhóm các cellulase và xylanase thành 6 họ

(A-F) [34], và được cập nhật thành 77 họ vào năm 1999 (1-77) [35] và tiếp tục phát triển
khi các trình tự glycosidase mới được xác định. Hiện tại, có 172 họ glycosid hydrolase
tồn tại được chú thích trong cơ sở dữ liệu CAZy [45]. Về cơ bản, xylanase được chia
vào hai họ GH10 và GH11 dựa trên trình tự gen, xylanase cũng được tìm thấy trong các
họ glycosid hydrolase khác, chẳng hạn như GH 5, 7, 8 và 43 [43].
1.1.3. Nguồn gốc và đặc tính
Xylanase được tạo ra bởi nấm, vi khuẩn, nấm men, tảo biển, động vật nguyên
sinh, ốc sên, động vật giáp xác, cơn trùng,… [59]. Những xylanase này có đặc tính hóa
lý, cấu trúc, khả năng hoạt động, sản lượng và tính đặc hiệu khơng giống nhau, do đó
làm tăng hiệu quả và mức độ thủy phân xylan, cũng như sự đa dạng và phức tạp của các
xylanase. Sự đa dạng này có thể là kết quả của sự dư thừa di truyền, một số trường hợp
do sự khác biệt xử lý sau dịch mã.
Xylanase được tạo ra bởi vi khuẩn và xạ khuẩn (Bacillus sp., Pseudomonas sp.,
Streptomyces sp.) hoạt động hiệu quả trong phạm vi pH rộng hơn từ 5-9, với nhiệt độ
tối ưu cho hoạt động xylanase từ 35ºC đến 60ºC [52]. Các nghiên cứu về Bacillus spp.
cho thấy hoạt tính xylanase cao hơn ở pH kiềm và nhiệt độ cao [48].
Nấm (Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp.) là những nhà sản xuất
xylanase quan trọng do giải phóng xylanase ngoại bào với sản lượng enzym cao. Ngồi
ra, xylanase của nấm có hoạt tính cao hơn so với vi khuẩn hoặc nấm men. Tuy nhiên,
xylanase có nguồn gốc từ nấm có một số đặc điểm khiến chúng khơng khả dụng cho
3


một số ứng dụng công nghiệp [48]. Hầu hết các xylanase này hoạt động hiệu quả ở nhiệt
độ 40-60ºC và phạm vi pH từ 4-7 [13] [28].
Xylanase có thể được sản xuất cơng nhiệp bằng q trình lên men rắn (SSF) hoặc
lên men chìm (SmF), năng suất sinh enzym trong SSF cao hơn nhiều so với trong SmF
[78]. Tuy nhiên, SSF hiện chỉ được sử dụng ở một mức độ nhỏ để sản xuất enzym và
chất chuyển hóa thứ cấp do một số vấn đề về kỹ thuật quy trình.
1.1.4. Ứng dụng

Xylanase có nhiều ứng dụng cơng nghiệp từ cơng nghiệp giấy và bột giấy đến
công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn ni. Ứng dụng chính của xylanase là biến đổi
sinh học sinh khối lignocellulose hoặc chất thải nông nghiệp thành các sản phẩm lên
men [59].
Xylanase đã được ứng dụng hiệu quả trong tẩy trắng sinh học và quá trình phân
hủy sinh học của ngành cơng nghiệp giấy và bột giấy. Xylanase giúp giảm hàm lượng
lignin và tăng độ sáng của bột giấy [40].
Xylanase ổn nhiệt hỗ trợ quá trình đường hóa sinh khối lignocellulose thực hiện
ở nhiệt độ và áp suất cao trước khi sản xuất cồn sinh học. Do đó, xylanase cũng đóng
góp một vai trị quan trọng trong ngành nhiên liệu sinh học [60].
Các loại thức ăn chăn nuôi phổ biến như ngũ cốc, lúa mạch, và thức ăn có đậu
nành rất giàu sinh khối lignocellulose. Xử lý bằng xylanase đối với thức ăn chăn nuôi
sẽ tạo điều kiện giải phóng các chất dinh dưỡng trong các đại phân tử, do đó các enzym
tiêu hóa có thể tiếp cận tốt hơn với cơ chất của chúng, giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng
của thức ăn chăn nuôi [65].
Ứng dụng xylanase trong lĩnh vực y dược trong những năm gần đây đang ngày
càng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trong nước và trên thế giới. Các
phương pháp enzym được ưu tiên để sản xuất các oligosaccharid thực phẩm và thuốc.
Sản phẩm thủy phân được xúc tác bởi enzym còn tạo ra các sản phẩm có tác dụng sinh
học cao. Việc sử dụng phương pháp enzym hiện nay còn được coi là kinh tế, nhanh
chóng và thân thiện với mơi trường hơn so với các phương pháp xử lý hóa lý để tạo các
sản phẩm thủy phân, q trình xử lý bằng enzym khơng tạo ra các hợp chất có hại cũng
như khơng u cầu các thiết bị đặc biệt [10] [41].
Quá trình thủy phân xylan được xúc tác bởi xylanase tạo ra xylo-oligosaccharid
(XOS). Các oligosaccharid (xylo-oligomers, cello-oligomers) cho thấy một số ứng dụng
trong lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và dinh dưỡng. XOS có đặc tính
prebiotics và có thể được sản xuất bằng cách thủy phân xylan từ các nguồn khác nhau
như lõi ngô, vỏ lúa mạch, vỏ trấu, rơm, lúa mì [53]. XOS ổn định ở nhiệt độ cao và pH
có tính acid là nguồn carbon thích hợp giúp tăng cường hệ vi khuẩn có lợi ở đường ruột
như Bifidobacteria, giúp tăng cường sức khỏe, cải thiện hệ tiêu hóa [21]. XOS cũng

4


được sử dụng trong một số sản phẩm đồ uống như sữa đậu nành, trà, cà phê và các sản
phẩm từ sữa khác [39].
Cấu trúc và tính chất của XOS có thể thay đổi do sự thay đổi về mức độ trùng
hợp, các phương pháp được sử dụng để chiết xuất và loại liên kết hiện có. XOS có tiềm
năng đáng chú ý là prebiotics mới và cho thấy nhiều lợi ích khác nhau như tăng khả
năng hấp thụ calci để tăng hoạt tính sinh học [54], hoạt tính gây độc tế bào trên bệnh
bạch cầu [5], cải thiện chức năng ruột [70], giảm thiểu nguy cơ ung thư ruột kết [70],
tác dụng cụ thể trên vị trí đối với bệnh đái tháo đường týp II [66], và các đặc tính chống
oxy hóa [69]. XOS cũng đã chứng minh khả năng trong việc tổng hợp các hợp chất hoạt
động chống lại các hợp chất gây ung thư và virus. Sự thay đổi cấu trúc của oligosaccharid
đã cho thấy các đặc tính khác như kháng virus, kháng u, chống đơng máu và các đặc
tính tái tạo mơ/sụn [55].
Bảng 1.1. Nguồn gốc và vai trò của các oligosaccharid khác nhau [10]
Oligosaccharids
Nguồn cung cấp
Chức năng
Vỏ trấu Bengal, cám Chất chống oxy hóa, mỹ phẩm,
Xylo-oligosaccharid

lúa mì và rơm rạ, gỗ chất điều chỉnh, chất kích thích

(XOS)

cây dương, vỏ lúa tăng trưởng thực vật, prebiotic,
điều trị đái tháo đường,…

mạch,..

Tỏi, cà chua, hành

Fructo-oligosaccharid

tây, mật ong, lúa
mạch đen, lúa mạch, Các đặc tính cariogenic, giá trị
chuối diếp xoăn, calo thấp.
thanh

long,

măng

tây,…
Phản ứng kích thích sinh trưởng
Arabino-oligosaccharid
(AOS)

Củ cải đường

của vi khuẩn trong ruột kết, tạo
điều kiện thuận lợi cho việc sử
dụng dinh dưỡng của động vật.
Các hoạt động chống oxy hóa,
tăng cường miễn dịch, bảo vệ các

Chitosan-oligosaccharid
(COS)

Sản phẩm khử phân tế bào bình thường khỏi quá trình

tử chitosan
apoptosis, chống tăng huyết áp,
chống vi khuẩn và chống lại các tế
bào ung thư, ung thư vú.
Sữa bị và sữa người, Có tác dụng trên sức khỏe đường

Galacto-oligosaccharid

đường Lactose, hạt ruột, ung thư ruột kết, bệnh viêm
đậu nành
ruột.
5


Đậu cô ve, cẩm quỳ,
đậu Hà Lan, hạt các
Raffinose-oligosaccharid

loại đậu, đậu lăng,
đậu, composite và
mù tạt

Phòng trừ dịch bệnh cho động thực
vật và con người.

Tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát
Human milk
oligosaccharid (HMO)

triển ưu tiên của vi khuẩn

bifidobacteria và lactobacilli

Sữa mẹ

trong ruột kết của trẻ sơ sinh bú
sữa mẹ.

Beta-Glucan

Chế độ ăn kiêng dựa Tạo hiệu ứng “lactobacillogenic”

oligosaccharid

trên yến mạch

Pectin-derived acidic
oligosaccharid (pAOS)
Mannan-oligosaccharid
(MOS)

tốt hơn.

Thực vật bậc cao, Được sử dụng trong sữa công thức
bao gồm trái cây và cho trẻ sơ sinh, làm giảm tiêu
rau quả, trái cây
chảy.
Các mảnh thành tế Điều chỉnh hệ vi sinh vật đường
bào của nấm men
ruột của cá tráp biển vàng.


Algae derived marin

Kích thích miễn dịch, chất chống

oligosaccharid (ADMO)

ung thư.
Bảo vệ hiệu quả HDO chống lại sự

Oligo-diaminogalactose

phân cắt RNase A mà khơng làm

(ODAGal)

giảm hoạt tính RNase H của
gapmer.

Cello-oligosaccharid

Dược phẩm, công thức thức ăn
chăn nuôi và ứng dụng thực phẩm

Manno-oligosaccharid

Rơm rạ, rơm lúa mì,

Bản chất khơng tiêu hóa của

prebiotic, phản ứng kích thích sự

lõi ngơ, kẹo cao su
phát triển của vi khuẩn trong ruột
guar
kết.
Đặc tính chống kết dính.

Pectic-oligosaccharid
1.2. Xylanase từ Aspergillus

1.2.1. Chi Aspergillus
Chi Aspergillus bao gồm hơn 340 lồi nấm sợi được chính thức chấp nhận là một
trong những loài nấm phổ biến và phân bố khắp nơi trên trái đất [58]. Trong tự nhiên,
nấm Aspergillus là tác nhân chính phân hủy các chất hữu cơ khác nhau. Nấm Aspergillus
cũng gây ra một số bệnh và tạo ra các độc tố khác nhau gây hại cho thực vật. Một số
loài Aspergillus, chẳng hạn như A. fumigatus và A. flavus, có thể ảnh hưởng nghiêm
6


trọng đến sức khỏe cộng đồng bằng cách gây ra bệnh aspergillosis xâm lấn hoặc
aspergillosis phế quản phổi dị ứng [19], [33]. Một số loài bao gồm A. flavus và A.
parasiticus có thể làm ơ nhiễm thực phẩm và thức ăn có nguồn gốc thực vật với độc tố
aflatoxin nấm mốc, là chất gây ung thư mạnh nhất được tìm thấy trong tự nhiên. Sử dụng
thực phẩm hoặc thức ăn nhiễm aflatoxin có thể dẫn đến các tình trạng nghiêm trọng như
nhiễm độc aflatoxin, hoại tử gan hoặc ung thư gan [33].
Mặc dù vậy, nhiều loài Aspergillus được sử dụng để sản xuất enzym, lên men
thực phẩm, công nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm . Ví dụ, A. oryzae được sử dụng
rộng rãi để lên men thực phẩm truyền thống ở Đông Á [37], A. niger được sử dụng để
sản xuất các enzym khác nhau như amylase [6] và pectinase [44] và acid hữu cơ như
acid citric [58]. Kể từ khi xylanase sinh ra từ A. niger lần đầu tiên được tinh sạch và biểu
hiện vào năm 1977, A. niger được coi như một nhà sản xuất xylanase xuất sắc. Hiện

nay, nhiều gen xylanase mới từ A. niger mới đã được phân lập, nhân dòng và biểu hiện.
1.2.2. Gen mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger
Tính đến nay, đã có 551 gen mã hóa cho protein khác nhau từ A. niger được giải
trình tự hồn tồn và lưu trữ trên kho lưu trữ Uniprot [73]. Trong đó, có 08 gen mã hóa
xylanase từ A. niger đã được định danh và phân loại. Cấu trúc và đặc tính các gen mã
hóa này được trình bày trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Đặc điểm gen mã hóa xylanase từ chủng A. niger [73]
TT

Tên gen

Protein mã hóa

Họ
protein

211

Endo-1,4-beta-xylanase A

GH11

Kích
thước
protein
(kDa)
22,642

225


Endo-1,4-beta-xylanase B

GH11

24,057

GH10

35,476

GH3

87,211

Chiều
dài
(bp)

1

xyn A
xlnB

2

xyn2, xynB,
xynG1

3
4


xlnC
xlnD
xylA

327
804

Probable endo-1,4-betaxylanase C
Exo-1,4-beta-xylosidase
xlnD

5

xlnR

945

6

XYN4

211

Endo-1,4-beta-xylanase 4

Chất
kích
hoạt
phiên

mã
GH11

7

XYN5

211

Endo-1,4-beta-xylanase 5

GH11

22,794

8

XYN6

211

Endo-1,4-beta-xylanase 6

GH11

22,561

Chất kích hoạt phiên mã
xylanolytic xlnR


7

102,073

22,669


1.3. Vector biểu hiện và chủng biểu hiện P. pastoris
1.3.1. Chủng biểu hiện P. pastoris
P. pastoris là một sinh vật nhân chuẩn, chúng có nhiều ưu điểm của hệ thống
biểu hiện của sinh vật nhân thực cao hơn như xử lý protein, gấp protein và sửa đổi sau
dịch mã, đồng thời dễ thao tác như E. coli hoặc Saccharomyces cerevisiae [36]. Nó
nhanh hơn, dễ dàng hơn và ít tốn kém hơn so với các hệ thống biểu hiện khác của sinh
vật nhân chuẩn và thường cho mức độ biểu hiện cao hơn. Là một loại nấm men, nó chia
sẻ những ưu điểm của thao tác phân tử và di truyền với Saccharomyces, và nó có thêm
lợi thế là mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp cao hơn từ 10 đến 100 lần. Những tính
năng này làm cho P. pastoris rất hữu ích như một hệ thống biểu hiện protein [47].
P. pastoris là một loại nấm men metylotrophic, có khả năng chuyển hóa methanol
làm nguồn carbon duy nhất của nó. Bước đầu tiên trong q trình chuyển hóa methanol
là q trình oxy hóa methanol thành formaldehyd bằng cách sử dụng oxy phân tử bởi
enzym alcohol oxidase. Ngoài formaldehyd, phản ứng này tạo ra hydrogen peroxid. Để
tránh nhiễm độc hydrogen peroxid, q trình chuyển hóa methanol diễn ra bên trong
một cơ quan chuyên biệt của tế bào, được gọi là peroxisome, cô lập các sản phẩm phụ
độc hại ra khỏi phần cịn lại của tế bào. Alcohol oxidase có ái lực kém với O2, và P.
pastoris bù đắp bằng cách tạo ra một lượng lớn enzym. Trình tự khởi đầu điều chỉnh
việc sản xuất ra rượu oxidase là trình tự được sử dụng để thúc đẩy sự biểu hiện protein
tái tổ hợp ở P. pastoris [36].
1.3.2. Vector biểu hiện
pPICZ A, B và C là các vector biểu hiện 3,6 kb được sử dụng để biểu hiện các
protein tái tổ hợp trong P. pastoris. Các protein tái tổ hợp được biểu hiện dưới dạng

dung hợp với peptid ở đầu C có chứa epitop c-myc và thẻ polyhistidin (6xHis). Vector
cho phép biểu hiện mức độ cao, cảm ứng methanol của gen quan tâm trong P. pastoris
và có thể được sử dụng trong bất kỳ chủng P. pastoris nào bao gồm X33, GS115,
SMD1168H và KM71H.
pPICZ chứa các phần tử sau:
• Đoạn 5’ có chứa promoter AOX1 sử dụng chất cảm ứng methanol để điều
chỉnh biểu hiện gen quan tâm.
• ZeocinTM gen kháng để chọn lọc ở cả E. coli và P. pastoris.
• Peptid đầu C có chứa epitop c-myc và thẻ polyhistidin (6xHis) để phát hiện
và tinh sạch protein dung hợp tái tổ hợp (nếu muốn).
• Ba khung đọc để hỗ trợ nhân dịng trong khung với peptid đầu C.

8


Hình 1.1. Cấu tạo của vector biểu hiện pPICZ A [31]
Protein tái tổ hợp được sản xuất ở P. pastoris dựa trên các enzym cần thiết cho
q trình chuyển hóa methanol và chỉ xuất hiện khi tế bào được nuôi cấy trên methanol.
Hai gen trong P. pastoris mã hóa cho alcohol oxidase - AOX1 và AOX2. Phần lớn hoạt
động của alcohol oxidase trong tế bào là do sản phẩm của gen AOX1. Sự biểu hiện của
gen AOX1 được điều chỉnh chặt chẽ và cảm ứng methanol ở mức rất cao, thường trên
30% tổng số protein hòa tan trong các tế bào được nuôi cấy bằng methanol. Gen AOX1
đã được phân lập và promoter AOX1 do plasmid sinh ra được sử dụng để thúc đẩy sự
biểu hiện của gen quan tâm mã hóa protein tái tổ hợp mong muốn. Promoter AOX1 đã
được báo cáo và sử dụng rộng rãi nhất trong số tất cả các promoter có sẵn của P. pastoris
[14]. Trong khi AOX2 tương đồng khoảng 97% với AOX1, nhưng sự phát triển trên
methanol chậm hơn nhiều so với AOX1. Sự phát triển chậm này cho phép phân lập các
chủng Muts (AOX1) [68].
1.4. Tình hình nghiên cứu biểu hiện xylanase
1.4.1. Trên thế giới

Việc khám phá và phát triển các xylanase mới và hiệu quả có ý nghĩa rất lớn đối
với các ngành cơng nghiệp hiện nay. Phương pháp nhân dịng biểu hiện góp phần đáng
kể vào việc tăng tốc độ sản xuất enzym mới dạng tinh khiết với số lượng lớn. Trên thế
giới, trong vài năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu nhân dịng, biểu hiện xylanase
từ A. niger trong P.pastoris đã được công bố. Các enzym biểu hiện được đều cho hoạt
9


tính cao hơn so với chủng tự nhiên và có khoảng pH nhiệt độ ổn định:
Năm 2006, Ping và cộng sự đã nhân dịng thành cơng xynB mã hóa endo-β-1,4xylanase ưa acid, thu được từ A. niger CGMCC1067, và sau đó biểu hiện thành cơng
trong P. pastoris dưới sự kiểm sốt của promoter GAP. Gen có chiều dài đầy đủ chứa
745 bp, bao gồm một intron là 67 bp, và mã hóa một protein chứa 188 acid amin.
Xylanase tái tổ hợp, tinh khiết cho thấy ba dải ở khoảng 21, 30 và 35 kDa. Hoạt tính tối
đa của xylanase tái tổ hợp là 62 IU/ml, cao hơn khoảng 50 lần so với năng suất thu được
khi nuôi cấy A. niger [23].
Năm 2014, Fang và cộng sự đã biểu hiện mức xylanase GH11 từ A. niger IA001-xynB trong P. pastoris sử dụng vector pPICZαA. Hoạt tính đo được là 1280 U/ml
cao hơn 19,39 lần so với xylanse tự nhiên. Trong thiết bị lên men 10 L, hoạt tính xylanase
tái tổ hợp đo được 10035 U/ml sau 114 giờ nuôi cấy [29].
Năm 2015, Elgharbi và cộng sự đã nhân dòng, biểu hiện thành cơng xylanase
XAn11 mã hóa cho β-1,4-endoxylanase từ A. niger US368 sử dụng vector pGAPZαB.
Hoạt tính tối đa thu được là 41 U/ml, cao hơn khoảng 3 lần so với hoạt tính thu được ở
chủng tự nhiên. Enzym được tinh sạch cho thấy hoạt tính riêng là 910 IU/mg và khối
lượng phân tử là 24 kDa. Nó có hoạt tính tối ưu ở pH 4 và 50°C, ổn định trong khoảng
pH rộng và bền với một số chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ [27].
Năm 2020, Long và cộng sự đã nhân dòng gen xylanase GH10 từ A. niger BE-2
(XynC) và biểu hiện ở P. pastoris GS115. Thông qua quá trình lên men mật độ tế bào
cao, mức độ biểu hiện của GH10 XynC đạt 1650 IU/ml. XynC cho thấy hoạt động tối
ưu ở 55°C, pH 5,0 và thể hiện sự ổn định tuyệt vời trong phạm vi pH rộng từ 4,5 đến
7,0 [46].
Năm 2021, Aiewviriyasakul và cộng sự đã nhân dịng và biểu hiện thành cơng

gen xylB mã hóa cho xylanase họ GH 11 từ A. niger BCC14405 trên hệ biểu hiện P.
pastoris KM7. XylB tái tổ hợp cho thấy hoạt tính riêng cao là 3852 IU/mg. Enzym hoạt
động tối ưu ở 45°C, pH 6,0 [4].
1.4.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam cũng đã có các nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp, việc tạo thành
công các chủng tái tổ hợp sinh xylanase với số lượng lớn sẽ thúc đẩy công nghiệp enzym
tái tổ hợp trong nước, hạn chế nhập khẩu, đồng thời tạo tiền đề phát triển để ứng dụng
trong một số lĩnh vực như chăn nuôi, dược phẩm. Đa số các nghiên cứu đều tập trung
vào xylanase có nguồn gốc từ A. niger và hệ biểu hiện P. pastoris.
Năm 2013, Trần Liên Hà và cộng sự đã tách gen xylanase và vùng mã hóa gen
xylanase (cds) của nấm mốc A. niger C1 biểu hiện trong E. coli BL21. Gen xylanase từ
A. niger C1 gồm 746 nucleotid trong đó có 1 intron ở vị trí 278-347, trình tự gen có 98%
độ tương đồng với gen mã hóa xylanase EU42881.1. Gen này được mã hóa bởi 225 acid
10


amin và được gắn peptid tín hiệu gồm 37 acid amin có khối lượng phân tử là 30 kDa.
Protein tái tổ hợp có trọng lượng phân tử là 30 kDa. Dịch xylanase thơ có hoạt tính 381,0
U/ml [2].
Năm 2016, Đặng Thị Kim Anh và cộng sự đã tạo thành công xylanase tái tổ hợp
Xyl11B biểu hiện trong P. pastoris X33 sử dụng vector pPICZαA. Hoạt lực xylanase
của chủng tái tổ hợp sau 10 ngày ni cấy trên mơi trường khống với methanol là nguồn
carbon duy nhất đạt 96 U/ml. Xyl11B sau tinh sạch có kích thước 30 kDa, hoạt động ở
pH thấp và tối ưu ở 65°C, pH 3,0. Enzym tái tổ hợp khá bền nhiệt và duy trì 90% hoạt
tính sau khi xử lý ở 70°C trong 20 phút. Enzym bền với pepsin, một protease chính trong
dịch tiêu hóa của dạ dày. Xylanase tái tổ hợp bị ức chế bởi sự có mặt của SDS, ion Mn2+
và Cu2+. Với mức độ biểu hiện xylanase ngoại bào cao, đáp ứng các tiêu chí của enzym
chăn ni, chủng P. pastoris X33 tái tổ hợp được đánh giá có tiềm năng ứng dụng trong
sản xuất [1].
Các nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger cũng được tiến hành bởi

phòng Công nghệ sinh học Enzym, Viện Công nghệ sinh học từ năm 2009. Đến nay
phòng đã biểu hiện, tinh sạch thành công xylanase GH11 ngoại bào trong môi trường
nuôi cấy của A. niger VTCC 017. Xylanase tinh khiết (hoạt tính cụ thể đạt 6596,79
UI/mg protein) là một đơn phân có trọng lượng phân tử 37 kDa. Xylanase tinh sạch có
nhiệt độ tối ưu là 55°C và pH 6,5 với hoạt tính phân giải xylan ổn định trong phạm vi
nhiệt độ 45-50°C và trong phạm vi pH từ 5,0-8,0 [20].
Để tìm ra những xylanase mới với mong muốn cho hoạt tính tốt hơn, ổn định và
khả năng ứng dụng linh hoạt trong công nghiệp, trong đề tài này chúng tôi sẽ tiếp tục
nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện xylanase tái tổ hợp từ A. niger và sử dụng hệ biểu
hiện P. pastoris GS115.

11


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Chủng giống
Chủng Aspergillus niger DSM1957 được mua từ Trung tâm sưu tầm vi sinh vật
của Đức (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH - DSMZ).
Chủng nấm men Pichia pastoris GS115 Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA
được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa xylanase D từ A. niger DSM1957.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, các enzym cắt giới hạn
đều của các hãng uy tín trên thế giới. Một số hóa chất chính và enzym được liệt kê ở
bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất và enzym
Hãng sản xuất (nước)
3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)


Honeywell Fluka (Mỹ)

Acrylamid, chloroform, isoamyl
alcohol, EDTA, imidazol, natri

Merck (Đức)

acetat, TEMED, Triton X100
Agarose, cao nấm men, pepton, kali

Bio Basic Inc. (Mỹ)

phosphat, tris base
SDS, thrombin, plasmid

Sigma (Mỹ)

Ethidium bromid, zeocin

Invitrogen (Mỹ)

Thang ADN chuẩn, thang protein
chuẩn

Fermentas (Latvia)

Enzym: EcoRI, RNase, SacI, T4
ligase, Taq ADN polymerase

Sigma (Đức)


Xylan, from Beechwood
D-Xylose

Sigma (Nhật Bản)

2.1.3. Các dung dịch và đệm
Các dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được pha theo hướng dẫn của các bài
thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
Dung dịch
Thành phần, nồng độ
Dung dịch APS

10% ammonium persulfat

Dung dịch A

Đệm 1,5 M tris HCl, pH 8,8

Dung dịch B

Đệm 0,5 M tris HCl; pH 6,8

Dung dịch C

30% acrylamid; 0,8% bis-acrylamid
12



Dung dịch D

10% SDS (tinh thể); 10 mM EDTA

Dung dịch I

50 mM tris HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0

Dung dịch II

0,2 N NaOH, 1% SDS

Dung dịch III

3M kali acetat, pH 5,5

Dung dịch IV

2% Triton X100; 1% SDS; 100 mM NaCl; 10 mM tris
HCl; 1 mM EDTA

Dung dịch 24 : 1

24 chloroform : 1 isopropanol (v/v)

Dung dịch nhuộm ADN

0,1 μg/ml ethidium bromid

Dung dịch DNS (1000ml)


153 g KNaC4H4O6. 4H2O; 4,15 g Na2S2O5; 5,3 g DNS;
9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol (làm tan ở 50°C)

Dung dịch A1

50% methanol; 5% acid acetic; 0,037% formandehyd

Dung dịch A2

50% methanol

Dung dịch A3

0,02% (w/v) Na2S2O3. 5H2O

Dung dịch A4

0,1% AgNO3

Dung dịch A5

5% Na2CO3; 0,037% formandehyd

Dung dịch A6

5% acid acetic

Đệm KP (K2HPO4)


20 mM K2HPO4; pH 6,5

Đệm điện di Protein

20 mM tris HCl; 192 mM glycin; 0,1% SDS; pH 8,8

Đệm 5x tra mẫu protein

0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 10% SDS;
10% -mercaptho-ethanol pha trong 0,313 M tris HCl;
pH 6,8

Đệm TE

10 mM tris HCl; 1 ml EDTA; pH 8,0

Đệm 10x TBE

20 mM EDTA; 900 mM tris borat; pH 8,0

Đệm 6x tra mẫu ADN

0,09% brommophenol blue; 0,09% xylene xyanol
(FF); 60% glycerol

Đệm rửa ADN

70% ethanol

Đệm PBS 1X


0,01 M Na2HPO4; 0,0018 M KH2PO4; 0,137 M
NaCl; 0,0027 M KCl; pH 7,4

Đệm rửa (Wash buffer)

PBS1X; 0,01% Tween 20

Dung dịch cơ chất

0,5% xylan, pha trong đệm 20 mM kali phosphat pH
6,5

Dung dịch đặc cơ chất

0,5% xylan; 1,2% agar

Dung dịch phá tế bào nấm

2% Triton X100, 1% SDS, 1 mM EDTA, 100 mM

men

NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0
Các hóa chất thông thường khác: NaOH, HCl, ethanol, nước khử RO. Các hóa

chất này đều đạt tiêu chuẩn phân tích.
13



2.1.4. Mơi trường
Các mơi trường sử dụng trong thí nghiệm đều được pha theo các quy trình và
cơng thức chuẩn, có thành phần và nồng độ như trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Môi trường
Thành phần
LB

1% pepton; 0,5% cao nấm men; 1% natri chlorid

LB agar

LB; 2% agar

LB lowsalt

1% pepton; 0,5% cao nấm men; 0,5% natri chlorid

YP

2% pepton; 1% cao nấm men

YPD

YP; 2% glucose

YPD agar

YPD; 2% agar


YPDS agar

YPD đặc; 0,1 M sorbitol

YPG

YP; 1% glycerol

2.1.5. Máy móc và thiết bị thí nghiệm
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phịng Cơng nghệ sinh học
Enzym, Viện Cơng nghệ Sinh học và Bộ mơn Hóa sinh, trường Đại học Dược Hà Nội
được liệt kê ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Xuất sứ
Bể ổn nhiệt VS 120 CW

Vision (Hàn Quốc)

Box cấy vi sinh vật Clean Bench

Trung tâm chuyển giao công nghệ (Việt

TCV.021

Nam)

Bộ xung điện

Eppendorf (Đức)


Máy đo pH-827

Metrohm (Thụy Sỹ)

Cân phân tích BL10S

Sartorius (Đức)

Hệ thống chụp ảnh Dolphin doc

Wealtec (Đài Loan)

Hệ thống điện di ngang

Biorad (Mỹ)

Hệ thống điện di đứng

Biometra (Đức)

Máy Votex OSI

Rotolab (Đức)

Máy lắc rung ổn nhiệt Provocell

Esco (Mỹ)

Máy li tâm lạnh Hettich Mikro22R


Hitachi (Nhật)

Máy li tâm thường

Vision (Hàn Quốc)

Máy nuôi lắc Certomat HK

Sartorius (Đức)

Máy khuấy từ

Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy PCR gradient Q cycler

Quantus (Anh)

Máy quang phổ UV 200

Labomed (Mỹ)
14


Nồi khử trùng ES 31

Tomy (Nhật Bản)

Tủ lạnh 4C GR N4 VTV


Toshiba (Nhật Bản)

Tủ lạnh sâu -20C VCF 280

Deawoo (Hàn Quốc)

Tủ lạnh sâu -84C MDF 192

Sanyo (Nhật Bản)

Dụng cụ thí nghiệm:
-

Các ống ly tâm eppendorf 2,0 ml; 1,5 ml; 0,5 ml.

-

Các ống falcon 15 ml; 50 ml.

-

Micropipet và đầu côn phù hợp với các thể tích 0,5-10 µl; 10-100 µl; 20-200 µl;
100-1000 µl.

-

Dụng cụ thủy tinh: đĩa Petri, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, nhiệt kế, ống đong, chai
đựng hóa chất.


-

Dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống.
Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích.

2.2. Nội dung nghiên cứu
Nhân dòng, thiết kế vector, biểu hiện
xylanase D tái tổ hợp trong Pichia
pastoris GS115

Biểu hiện P. pastoris

Nhân dòng gen mã hóa

GS115/pPXlnD tái tổ

xylanase D

hợp

Thiết kế vector tách
dịng pJET 1.2
blunt/xlnD (pJXlnD)

Nghiên cứu các điều
kiện biểu hiện

Thiết kế vector biểu
hiện pPICZαA/xlnD
(pPXlnD)

Tạo chủng P. pastoris

Thời gian
biểu hiện

GS115 mang gen xln D
(XpPXlnD)

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
15

Nồng độ
methanol


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy
Nuôi cấy hoạt hóa nấm men: Chủng gốc P. pastoris GS115 được nhân giống
trong môi trường YPD ở 28C lắc 200 rpm. Các chủng P. pastoris từ các ống giống
được hoạt hóa lại trên môi trường YPD agar ở 28C, từ 3-5 ngày.
Nuôi cấy E. coli: E. coli bảo quản ở -84C được hoạt hóa trên đĩa mơi trường LB
agar, ủ 37C qua đêm. Một khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch được nhặt nuôi vào 2 ml
LB lỏng lắc 200 rpm ở 37C qua đêm. Các chủng tái tổ hợp được nuôi trong các môi
trường tương ứng bổ sung zeocin (nồng độ cuối cùng 100 μg/ml).
Nuôi biểu hiện: Chủng P. pastoris tái tổ hợp được nuôi lắc trong môi trường YPG
ở 28C lắc 200 rpm qua đêm (16-18h), sau đó chuyển sang môi trường YP bổ sung 0,5%
methanol. Tiếp 0,5% (v/v) methanol sau mỗi 24h để cảm ứng biểu hiện xylanase D.
2.3.2. Phương pháp khuếch đại gen từ khuôn ADN tổng số
Nguyên tắc:
Gen mã hóa xylanase D (xln D) được khuếch đại từ khuôn ADN tổng số của

chủng A. niger DSM1957 bằng cặp mồi đặc hiệu có gắn trình tự nhận biết của enzym
giới hạn. Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào trình tự gen mã hóa xylanase D đã
được công bố ở ngân hàng gen thế giới (Bảng 2.5).
Bảng 2.5. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi
XylD_F
XylD_R

Trình tự mồi 5’-3’

Mục đích

Khuếch đại gen
xln D từ ADN tổng
GCGCGGCCGCGCGATAAAGTCCTCCCCTCA số của A. niger
DSM1957
GCGAATTCTCGCACCCCCAACAGAATC

5’AOX1

GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3’AOX1

GCAAATGGCATTCTGACATCC

Kiểm tra gen xln D
chèn vào bộ gen P.
pastoris


Tiến hành:
Hỗn hợp phản ứng PCR 25 µl gồm 0,5 µl ADN (~100 ng); 1 µl mồi xi (10
pmol); 1 µl mồi ngược (10 pmol); 2,5 µl MgCl2 (25 mM); 2,5 µl đệm 10X PCR; 2 µl
dNTP (2,5 mM); 0,25 µl Taq ADN polymerase (5 U/µl); 14,25 µl H2O. Chế độ chạy
95°C/4 phút; 30 chu kỳ ( 95°C/45 giây; 52°C/45 giây; 72°C/45 giây); 72°C/10 phút. Sau
khi phản ứng kết thúc lấy 8 µl sản phẩm điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra.
2.3.3. Phương pháp nối ghép gen ngoại lai
Nguyên tắc: Gen ngoại lai sau khi được xử lý với enzym cắt giới hạn xác định,
được nối với vector tách dòng hoặc vector biểu hiện (đã được xử lý với enzym giới hạn
tương tự) nhờ enzym nối T4 ligase.
16


Tiến hành:
Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector pJET1.2/blunt được thực hiện theo
protocol của hãng Fermentas. Hỗn hợp bao gồm: 2 μl H2O, 5 μl buffer 2X reaction, 0,5
μl ADN blunting enzym, 1,5 μl sản phẩm PCR. Hỗn hợp được trộn đều và ủ 70°C trong
15 phút. Sau đó, bổ sung 0,5 μl vector pJET1.2/blunt và 0,5 μl T4 ligase. Phản ứng gắn
dính được thực hiện ở 22°C trong 3 giờ hoặc qua đêm để tạo vector tái tổ hợp. Phản ứng
gắn dính phân đoạn ADN tinh sạch vào vector biểu hiện pPICZαA (10μl) bao gồm: 1 μl
đệm gắn dính 10X; 0,5 μl ADN plasmid; 2 μl phân đoạn chèn ADN; 0,5 μl T4 ligase; 6
μl H2O cất vô trùng. Hỗn hợp được trộn đều và ủ qua đêm ở 22°C.
2.3.4. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào E. coli
Nguyên tắc: Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10B theo
phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Tế bào E. coli DH10B được xử lý với CaCl2 giúp
ADN dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các lỗ màng tế bào mở rộng tạo
điều kiện cho các phân đoạn ADN đi vào dễ dàng.
Tiến hành:
Chuẩn bị tế bào khả biến: Một khuẩn lạc E. coli DH10B được nuôi lắc trong 2
ml LB lỏng, lắc 200 rpm ở 37°C qua đêm. Tiếp giống 1% và nuôi lắc ở 37°C trong 2 3 giờ để OD600nm đạt 0,6-0,8. Dịch nuôi cấy được để lạnh 30 phút cho ổn định. Ly tâm

4000 vòng/phút, trong 5 phút, thu tế bào. Tế bào được rửa lần 1 với 0,1 M CaCl2 trong
1 giờ. Ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút, tế bào được rửa lần 2 với 0,1 M CaCl2 trong
20 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút, trong 5 phút thu tế bào. Tế bào đã qua xử lý được hòa
trong 100 μl 0,1 M CaCl2, bổ sung 15% glycerol, trộn đều, chia nhỏ tế bào vào mỗi ống
eppendorf để chuẩn bị biến nạp. Tế bào được bảo quản ở -80°C cho những lần biến nạp
sau. Các thao tác được thực hiện ở điều kiện 4°C.
Biến nạp plasmid vào E. coli DH10B: Dịch nối ghép được ủ với tế bào khả biến
trong đá 30 phút và sốc nhiệt 45 giây ở 42°C rồi chuyển ngay vào đá. Sau 5 phút ủ trong
đá, dịch tế bào vừa sốc nhiệt được bổ sung 250 μl LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37°C
trong 1 giờ. Dịch biến nạp được trải trên đĩa thạch chứa kháng sinh phù hợp vector sử
dụng (100 μg/ml ampicilin hoặc zeocin). Đĩa thạch sau đó được ủ 37°C qua đêm.
2.3.5. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ tế bào E. coli
Nguyên tắc: Vi khuẩn được nuôi và nhân lên đến pha log. Tế bào được phá vỡ
bằng kiềm và các chất tẩy mạnh trong dung dịch I và II. Protein trong tế bào được tủa
bằng acid trong dung dịch III và loại bằng chloroform : isoamyl (24 : 1), ADN plasmid
được thu lại bằng cách tủa với isopropanol.
Tiến hành:
Khuẩn lạc mọc trên đĩa LB agar được nhặt ni trong 1,5 ml LB lỏng có bổ sung
kháng sinh tương ứng vector sử dụng ở 37°C, qua đêm. Dịch nuôi được ly tâm 8000
17


vòng/phút, trong 5 phút, thu cặn tế bào. Bổ sung 150 μl dung dịch I, hòa tan cặn bằng
máy lắc rung, 150 μl dung dịch II, đảo nhẹ, giữ trong đá lạnh 3 phút, 150 μl dung dịch
III, lắc đều. Sau đó, hỗn hợp được bổ sung 450 μl dung dịch 24 : 1, trộn đều và ly tâm
12000 vòng/phút, trong 10 phút. Thu dịch trên, chuyển sang ống eppendorf mới, bổ sung
300 μl isopropanol, trộn đều, ủ -20°C trong 30 phút hoặc -84°C trong 5 phút. Sau khi ly
tâm 12000 vòng/phút, trong 15 phút, tủa được rửa bằng cồn 70%, ly tâm 12000
vòng/phút, trong 5 phút. Thu tủa và làm khơ, hịa tủa trong 20 μl đệm TE có bổ sung
RNase. Ủ mẫu ở 37°C trong 30 phút để loại bỏ hoàn toàn RNA. Điện di kiểm tra sản

phẩm trên gel 0,8% agarose.
2.3.6. Điện di ADN trên gel agarose
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của điện trường, các phân tử ADN tích điện âm có
kích thước khác nhau sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau. Bản
gel agarose được xem là thích hợp cho việc làm giá đỡ phân tách các phân tử ADN. Bản
gel được nhuộm trong ethidium bromid trong khoảng 3-5 phút, rửa lại bản gel bằng nước
và soi dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm.
2.3.7. Xử lý ADN plasmid bằng enzym cắt giới hạn
Nguyên tắc: Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn
hay khơng, các plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc được cắt bằng enzym giới hạn. Mỗi
enzym giới hạn được nhận biết và cắt sợi ADN kép ở một trình tự nucleotid đặc hiệu, ở
điều kiện nhiệt độ thích hợp (thường là 37°C, tùy thuộc từng loại enzym). Các enzym
này được thiết kế ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai.
Tiến hành:
Hỗn hợp phản ứng cắt được trộn với tỷ lệ sử dụng theo hướng dẫn của hãng sản
xuất. Ủ trong 2-3 giờ ở 37°C, sau đó điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose.
2.3.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose
Nguyên tắc: Sử dụng loại cột có chứa các hạt sepharose để bắt giữ các phân tử
ADN sợi kép được gắn với các loại ion trong đệm gắn (Bingding buffer - BB). Khi hỗn
hợp ADN đi qua cột, các phân tử ADN sẽ gắn vào mạng lưới, các thành phần khác như
protein, muối, … sẽ bị rửa trôi bằng đệm rửa (Wash bufer - WB). Sau đó, để tách ADN
ra khỏi cột người ta sử dụng loại đệm có độ ion hóa thấp là đệm rửa giải mẫu (Elution
buffer - EB). Có thể thay thế đệm này bằng nước khử ion vô trùng, nước có khả năng
tạo nên một lớp vỏ hydrat và tách ADN ra khỏi cột.
Tiến hành:
Thu phần gel có ADN quan tâm vào ống eppendorf. Bổ sung 2 lần thể tích đệm
gắn ADN (BB). Ủ hỗn hợp ở 60°C trong khoảng 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn.
Dùng pipet hút dịch đưa vào cột (có kèm theo kit của hãng), để ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới ống. Bổ sung 500 μl đệm rửa
18