VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
--------------------oOo----------------

KHĨA LUẬN TÓT NGHIỆP
Đề tài:
TUYÉN CHỌN CHỦNG VI NÁM NỘI SINH PHÂN LẬP
TÙ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CU A PHÂN BÓ TẠI ĐÀ LẠT VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG SINH TỐNG HỢP HUPERZIN A

Giáo viên hướng dẫn : TS. LÊ THỊ MINH THÀNH
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ LAN ANH
Lớp

: KSCNSH 1301

HÀ NỘI -2017


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHŨ VIÉT TẲT.................................................................4
DANH MỤC HÌNH ẢNH..................................................................................5
LỜI CẢM ƠN....................................................................................................7
MỞ ĐẦU............................................................................................................8
1.

Tính cấp thiết..........................................................................................8

2.

Mục tiêu đề tài:.......................................................................................9

3.

Nội dung đề tài:......................................................................................9

CHƯƠNG I : TÓNG QUAN..........................................................................11
3.1

Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serratà)...........11

ỉ. 1.1 Lịch sử nghiên cứu................................................................................11
3.1.2
3.1.3
3.2

Mô tả cây............................................................................................12
Phân bổ...............................................................................................12
Tổng quan hoạt chất Huperzinc A.................................................13

3.2.2

Giới thiệu về Huperzine A...................................................................13

ỉ. 2.2 Cơ chế hoạt động của Huperzine A.......................................................14
3.3

Tổng quan về vi nấm nội sinh trong thực vật................................14

1.3

. ỉKhái niệm vi nấm nội sinh trong thực vật..........................................14


1.3.2

Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật..........................................15

1.3.3

ủng dụng cùa vi nấm nội sinh.............................................................16

1.4

Tình hình nghiên cứu cây Thạch từng răng cưa sinh tong họp

Huperzine A trong nước và trên thế giói....................................................18
1.4.2

Các nghiên cứu trên thế giới..............................................................18

1.4.3

Các nghiên cứu trong nước................................................................20

1.5

Nghiên cứu định danh vi nấm............................................................20

1.5.2

Định danh vi nấm nội sinh theo phương pháp truyền thống.............21


1.5.3

Định danh bang phương pháp sinh

1.6

học phân tử............................23

Phuong pháp xác định các hoạt chất..................................................28


1.6.2 Phương pháp đo quang phố UV- VIS..............................................................28
ỉ .6.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid
chromatography).............................................................................................32
PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu..........................35
2.1

2.2

Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu.......................................35
2.1.1

Thời gian và địa điêm........................................................................35

2.1.2

Đoi tượng nghiên cứu.......................................................................35

Hóa chất và trang thiết bị thí nghiệm...................................................35
2.2.1


Hóa chất:...........................................................................................35

2.2.2

Mơi trường nuôi cấy và dung dịch.....................................................35

2.2.3

. ỉ Môi trường phân lập và nuôi cay vi nấm nội sinh.........................35

2.2.2.2 Dung dịch............................................................................................36
2.2.3 Trang thiết bị thi nghiệm........................................................................36
2.3 Phuong pháp nghiên cứu..........................................................................37
2.3.1

Phương pháp hoạt hóa và thu sinh khối vi nấm................................37

2.3.2

Phương pháp tách chiết....................................................................37

2.3.3 Phương pháp xác định khá năng sinh tông hợp Huperzine A trong
vi nam nội sinh từ cây Thạch tùng răng cưa...................................................38
2.3.4

Định danh vi nâm nội sinh hang phương pháp sinh học phân từ... 39

2.3.5


Thực hiện phân ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS.........................40

2.3.6

Định danh vì nam nội sinh hằng phương pháp truyền thống...........42

PHẦN 3: KÉT QUẢ.......................................................................................43
3.1

Kết quả hoạt hóa và nhân nuôi các chủng vi nấm nghiên cứu .... 43

3.2 Kết quả xác định khả năng sinh tổng họp Huperzine A của các
chúng nam nghiên cứu...................................................................................46
3.2.1 Ket quả xác định hang phương pháp UV- VIs...............................................46
3.2.2 Kêt quả xác định hoạt chât Huperzine A trong dịch chiết nấm hang
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC..........................................52
3.3

Kết quả định danh chủng vi nấm sinh tổng họp Huperzine A............54


3.3.1

Kết quà định danh theo phương pháp truyền thong..........................54

3.3.2

Kết quá định danh các chủng nấm nội sinh hang phân tích trình tự

vùng rADN - ITS.............................................................................................55

PHẦN 4: KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................59
4.1

Kết luận.................................................................................................59

4.2

Kiến nghị...............................................................................................59

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................60


Từ viết tắt

DANH MỤC CÁC CHỬ VIÉT TẢT
Chữ viết đầy đủ

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

B1AST

Basic Local Alignment Search Tool

AFLP


Amplified Fragment Length Polymorphism

dATP

Dcoxyadenosinc triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ETS

External transcribed spacer

HTKL

Hình thái khuân lạc


ITS

Internal transcribed spacer

LSU

Large subunit

NCBI

National Center for Biotechnology Informatic

PDA

Potato Dextrose Agar

PCR

Polymerase chain reaction

rADN

Ribosomal acid deoxyribonucleic

rARN

Ribosomal acid ribonucleic

RAPD


Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

ssu

Small subunit


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cây Thạch tùng răng Círa[6].....................................................................12
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học cùa Huperzine A.............................................................13
Hình 1.3 Một phần thuộc nhóm nấm VAM( Glomus sp), với các sợi nấm và
các túi khí trong rễ cây [12]........................................................................................15
Hình 1.4: sơ đồ câu trúc vùng ITS - rADN.............................................................26
Hình 3.1: Đặcđiếm hình thái

khuấn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL1.45

Hình 3.2: Đặcđiểm hình thái

khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTK.L2.46


Hình 3.3: Đặcđiểm hình thái

khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL3.46

Hình 3.4: Hỉnh ảnh một số dịch chiết nấm cúa một số chúng vi nấm nội sinh
từ cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt.........................................................47
Hình 3.5: Hình ánh sinh khối (bên trái) và dịch chiết (bên phái) thu được từ
Ml.10.............................................................................................................................50
Hình 3.6: Hình ảnh phổ khối phố của chủng nấm Ml. 10(a) và chất chuẩn
Huperzine A trong dung môt methanol (b)................................................................51
Hình 3.7: Hình ảnh so sánh khối phổ của chủng vi nấm nội sinh Ml. 10 và
mẫu chất chuấn HupA trong dung mơi methanol......................................................51
Hình 3.8: sắc ký đồ HPLV ( uv 210, 230, 310 nm ) của chất chỉ thị
Huperzine A (A) và M1.10 (B)...................................................................................52
Hình 3.9: Khuẩn lạc của chúng vi nấm M1.10..........................................................54
Hình 3.10.’ Anh vi hình thải của chủng nấm nội sinh Ml. 10.................................54
Hình 3.11: Ket quả chạy điện di sản pham PCR chúng vi nấm Ml. 10 trên gel
agarose (1: Marker, 2: Chủng M1.10)........................................................................56
Hình 3.12: Ket quá giải trình tự gen của chúng nam Ml.10.....................................56


DANH MỤC BẢNG
Bàng 3.1: Ket quả hoạt hóa các chủng vi nấm nội sinh từ cây Thạch tùng răng
cưa phân bố tại Đà Lạt, Việt Nam..............................................................................43
Báng 3.2: Kết quà đo quang phổ uV - VIS của 109 chúng vi nấm nghiên cứu ...48
Bàng 3.3: Báng thời gian lưu và phân tách các peak trong sắc ký đồ cùa chất
chuân Huperzine A (A) và chúng vi nâm M1.10 (B)................................................53
Báng 3.4: Mức độ tưomg đồng gen ITS1 của chùng nấm khi so sánh với trình
tự các chủng trên GenBank.........................................................................................57



LỜI CẢM ƠN
Kớí lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gùi lời cám ơn tới TS. Lê Thị Minh
Thành - Phó giám đốc Trung tâm giong và bão tồn nguồn gen vi sinh vật Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bão, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực
hiện khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn Ths. Mần Hồng Phước, KS. Hoàng Thị Hồng
Anh cùng tập thê cán bộ Trung Tám Giong và Bào Tồn Nguồn Gen Vi Sinh
Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lãm Khoa học và Còng nghệ Việt
Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tơi trong suốt
thời gian thực hiện khóa luận.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy có giáo trong khoa
Cơng nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã dạy do, hướng dan và
truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tòi xin gửi lời cảm on đến gia đình, bạn bè và nhũng người
ln hên cạnh, động viên, giúp đõ' tơi trong suốt q trình học tập đê tơi có
được kết quả như ngày hơm nay.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Lan Anh


MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết
Bệnh Alzheimer là một chứng mất trí phổ biến nhất. Đây là một loại
bệnh gây ra sự thối hóa tồn bộ não bộ và khơng the phục hồi. Hiện nay, các
thuốc điều trị bệnh Alzheimer chủ yếu dựa vào ức chế hoạt động của cúa
enzyme cholinesterase góp phần bồ sung lượng acetylcholine thiếu hụt cho

bệnh nhân. Tuy nhiên, các thuốc này gây ra tác dụng phụ trên đường tiêu hóa
như buồn nơn, tiêu chảy, chóng mặt, rối loạn giấc ngú gây ánh hường tới sinh
hoạt cùa họ. Hupcrzinc A là một alkaloid thuộc nhóm scrquitcrpcn có trong
thành phần của cây Thạch tùng răng cưa có khả năng xuyên qua hàng rào
mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính
bàng

microgram.

Huperzine

A

có

tác

dụng

ức

chế

việc

sinh

ra

acetylcholinesterase - là một enzyme phá hùy chất trung gian dẫn truyền thần

kinh acetylcholine. Khi cnzym này bị bất hoạt, nồng độ acetylcholicn trong
não tăng lên, giúp trí nhớ tốt và các chức năng nhận thức được cải thiện. Vì
vậy, việc đưa hoạt chat Huperzine A có trong thạch tùng răng cưa được xem
là liệu pháp cứu cánh đối với những người mắc Alzheimer và các bệnh sa sút
trí tuệ khác.
Hoạt chất Huperzine A này được tìm thấy chú yếu từ một cây thảo
dược truyền thống của Trung Quốc - Huperzia serrata (Thunb. ex Murray)
Trev. (Thạch tùng răng cưa). Các nghiên cứu về hoạt chất Huperzine A trong
cây H. serrata và cách chiết xuất hợp chất này làm nguyên liệu trong sàn xuất
thuốc chừa trị các bệnh rối loạn về trí nhớ đã thu được các thành tựu rất đáng
quan tâm. Tuy nhiên, với đường hướng chiết xuất hoạt chất Huperzine A từ
cây H. serra địi hói phái mất nhiều thời gian, chi phí nhiều cho trồng trọt
để có thể thu được sản lượng cây đủ cho chiết xuất hoạt chất Hupcrzinc A làm
nguyên liệu cho ngành công nghiệp sàn xuất thuốc, từ đó dẫn đến hiệu quả
kinh tế khơng cao. Mặc dù các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng nhân


giống in vitro có thế sản xuất HupA cao
hơn cây trồng tự nhiên nhưng nó
cũng chưa đáp ứng được nhu cầu của ngành
công
nghiệp
dược
phàm,
bởi
thời
gian nhân được giống cây đế thu làm
nguyên liệu sán xuất thuốc cũng kéo dài
hàng năm. Gần đây, nấm nội sinh được phân
lập từ các loại cây trồng đã được

chấp nhận như là một nguồn nguyên liệu
quan trọng của ngành công nghiệp
dược. Một lượng lớn các hợp chất có cấu trúc
mới
và
hoạt tính
sinh
học khác
nhau đã được chiết xuất từ các nấm nội sinh
này. Do đó, việc nghiên cứu phân
lập các chùng nam nội sinh trong cây H.
serrata có khả năng sàn sinh hoạt
chất HupA đã được các nhà khoa học quan
tâm
nhằm
thay
thế,
tăng
cường
lượng HupA cho ngành cơng nghiệp dược. Ĩ
Việt
Nam,
Thạch
tìing
răng
cưa
được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng ờ độ cao
1.000
m.
Đây

là
loài
cây
dược
liệu quý hiếm, thuộc danh sách "đỏ" trong
Chương trình Nghiên cứu bảo tồn
và phát triền nguồn gen bán địa quý hiếm
về
cây
thuốc,
nhưng
chưa
được
quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng
trong điều trị bệnh tại Việt Nam.
Mặt khác, các nghiên cứu về nấm nội sinh
trong cây Thạch tùng răng cưa Việt


Nam là chưa có cơng bố. Vì vậy, đề tài
“Tuyến chọn chủng vi nấm nội sinh
phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa
phân bố tại Đà Lạt - Việt Nam có
khả năng sinh tống hợp hoạt chất
Huperzine A ” được thực hiện với hy vọng
xác định được những chủng nấm nội sinh có
khả
năng
sản
xuất

hoạt
chất
HupA nhằm hướng tới một nguồn nguyên
liệu lớn có hiệu q kinh tế cho
ngành cơng nghiệp dược trong nước và
trong điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại
Việt Nam.
2.

Mục tiêu đề tài:
Tuyến chọn được chủng vi nấm nội sinh có khả năng tổng hợp
Huperzine A từ các chúng vi nấm phân lập được từ cây Thạch tùng
răng cưa phân bố tại Đà Lạt, Việt Nam.

3.

Nội dung đề tài:
•

Hoạt hóa các chủng vi nam nội sinh được phân lập từ cây Thạch
tùng răng cưa tại Đà Lạt, Việt Nam


•

Sàng lọc các chùng vi nấm nội sinh có khả năng tổng hợp
Hupcrzine A từ các chùng vi nấm nội sinh trên.

•


Định danh các chủng vi nấm nội sinh bằng phương pháp truyền
thống và sinh học phân tử.


CHƯƠNG 1 : TỐNG QUAN
1.1

Tống quan về cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serratà)

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) là một loài thân thảo, thuộc họ
Lycopodiaceae , ở Trung Quốc còn được biết đen dưới tên Qian Ceng Ta.
Một số thành phần hoá học đã được phân lập từ thực vật thuộc nhóm
alkaloids, flavones, Triterpenes và acid phenolic.
Cây thuốc này đã được sứ dụng từ gần 1000 năm trong y học cổ truyền
Trung Quốc, nó thường được sử dụng trong trường họp sốt, cảm lạnh, sưng
phù, bầm tím, kinh nguyệt, viêm khớp dạng thấp, tâm thần phân liệt, nhiễm
trùng da, nhiễm trùng dưới da, suy nhược cơ tim và suy nhược cơ[41]. Các
bán ghi chép sớm nhất về cây này được tìm thấy trong quyến dược điền có
tên “ Ben cao shi yi” từ thời Trung Quốc cổ đại (năm 739). Trong ghi chép,
Thạch tùng răng cưa là một loại dược liệu được dùng trong điều trị bệnh thấp
khóp, câm lạnh, giúp thư giãn cơ và thúc đấy lưu thơng tuần hồn máu[41].
Vào những năm 1980, các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện ra Huperzine
A từ cây này, thì nó đã được nối tiếng ra tồn thế giới, như là một chất ức chế
AchE có thể đảo ngược, mạnh mẽ và chọn lọc thuốc bang in vitro và invivo và
tạo ra những hiệu quá nhất định trọng việc điều trị bệnh Alzheimer [27],
Hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới, do số lượng người mắc
bệnh Alzeimer ngày càng gia tăng nên nhu cầu sứ dụng Thạch tùng răng cưa
đe sàn xuất thuốc cũng dần lớn theo, trong khi đó, Thạch tùng răng cưa lại là
dược liệu quý hiếm cần đến sự canh tác ngặt nghèo cũng như phát triền rất

chậm (trung binh khoáng 15 năm cho một chu kỳ sinh trướng) và đã được đưa
vào danh sách những lồi thực vật có nguy cơ tuyệt chủng [15], Vì vậy, kỳ
thuật nhân giống cây nhanh bằng phương pháp in vitro đã được các nhà khoa
học nghiên cứu và thực hiện đế giái quyết được vấn đề trên.


Phân loại khoa học
Giới : Plante
Ngành : Lycopodiophyta
Lớp : Lycopodiopsida
Bộ : Thơng Đất (Lycopodialcs)
Họ : Thơng Đất (Lycopodiaceae)
Chi : Huperzia
Lồi : Huperzia Serrata
Tên gọi khác : Chân sói
Tên

khoa

học

:

Hupcrzia

Scrrata

(Thunb.)

Trevis,


(Lycopodium

serratum thunb.)
1.1.2 Mơ tủ cây

Hình 1.1: Cãy Thạch tùng răng fzr«[6|
Huperzia serrata là cây mọc ở đất, thường mọc ở dưới tán rừng quanh
năm ẩm ướt, thân đứng cao 15-40cm, đơn hay lường phân 1-2 lần, đường kính
khoảng 2mm, hình trụ. Lá hình bầu dục mũi mác, dài khoảng 15mm rộng 3mm,
tương đối móng, gân giữa rõ, mép có răng. Túi bào tử ờ nách nhánh lá giống lá
thường, túi bào tứ hình thận, màu vàng tươi. Sinh sản bằng bào tứ trong mơi
trường có nước mưa, có khả năng mọc trồi sau khi bị cắt hoặc gãy.
1.1.3

Phân hố
Thạch tùng răng cưa chủ yếu được tìm thấy ở các khu rừng ơn đới với

độ cao 900- 3500m ớ khu vực đông bắc Ân Độ như Tây Bengal (Darjeeling),


Sikkim,
Arunachal
Pradesh,
Assam,
Meghalaya và Manipur, và ớ các ngọn
đồi Nilgiri Tamilnadu. Ngoài Ấn Độ, nó cịn
được
tìm
tấy

ở
Trung
Quốc,
Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn
Quốc,
Indonesia,
Fiji,
Samoa,
Mexico, Mỹ (Hawaii), Thái Lan, bán đão
Malaysia
(Paham),
Nga
(Đông
Siberia / Amur / Ussuri), Đài Loan, úc và Cuba
.
Ó nước ta, chi gặp ở những vùng có độ cao từ 1000m trớ lên như Cao
Bằng, Lào Cai, Quảng Trị, Quảng Nam- Đà Nằng, Khánh Hòa, Lâm Đồng.
1.2

Tổng quan hoạt chất Huperzine A

1.2.1 Giới thiệu về Huperzine A
Hupcrzinc A, đôi khi được gọi là Sclagin, là một alkaloid được tách
chiết từ thảo mộc Lycopodium serratum , có cấu trúc hóa học Ci5H|xN 2O
(hình 1.2). Nó được xác định lần đầu tiên vào những năm 1980, nhưng những
chiết xuất cùa cây đã được sứ dụng ớ Trung Quốc hàng thế ký như một loại
thảo dược để điều trị chấn thương, căng thẳng, sưng tấy, tâm thần phân liệt,
vv. Herbs là một chất ức chế mạnh mẽ, có the đáo ngược và chọn lọc
acetylcholinesterase, hoạt động này thậm chí mạnh hơn galantamine, một loại
thuốc được FDA chấp thuận để điều trị bệnh AD và các rối loạn về trí nhớ khác

từ nhẹ đến trung bình. Khi sự suy giám chức năng cholinergic trong não là một
yếu tố chính ảnh hưởng đến sự thiếu hụt trí nhớ trong AD, Huperzine A đã nổi
lên như một ứng cứ viên đầy hứa hẹn cho việc điều trị bệnh nhân AD.


H2N
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học cua Huperzine A
Huperzine A thường được sử dụng đe điều trị bệnh Alzheimer và các
bệnh thối hóa thần kinh khác như Parkinson vì khả năng của nó đế cãi thiện
trí nhớ và khả năng nhận thức trong khi hoạt động như một chất báo vệ thần


kinh. Huperzine A thường được coi như là
một chât bô sung tự nhiên trong
các cá nhân khịe mạnh vì các hiệu ứng
nootropic của nó.
1.2.2 Cơ chế hoạt động của Huperzine A
Huperzine A làm tăng lượng acetylcholine trong não bằng cách ngăn
chặn hoạt động của cholinesterase. Hupcrzinc A cũng có một số hoạt động
như một chất đối kháng thụ the NMDA. Nó là băo vệ than kinh, cho thấy đe
bào vệ nơ-ron từ thiệt hại do glutamate, peroxides, và beta-amyloids. Trong
các nghiên cứu chuột, nó đã được hiến thị đế thúc đấy neurogenesis.
Bốn trong số năm loại thuốc được FDA chấp thuận để điều trị bệnh
Alzheimer là chất ức chc cholinesterase. Acetylcholine đã được chứng minh
là đóng một vai trị quan trọng trong việc hình thành những ký niệm
mới. Mức acetylcholine cao làm tăng cường độ truyền dẫn thần kinh đến vỏ
não. Nó cũng ức chế sự phóng thích glutamate, do đó ngăn chặn kích thích
phản hồi của vỏ não. Hiệu quả rịng là làm cho mạch vỏ não có thể phân ứng
nhanh với đầu vào cảm giác có liên quan, đồng thời giám phán hồi kích thích
có thể cản trở việc thu hồi bộ nhớ.

Các chất ức chế cholinesterase hiện đang có mặt trên thị trường để
điều trị bệnh Alzheimer khá hiệu quả trong việc cài thiện trí nhớ ở những
bệnh nhân này. Những loại thuốc này cũng có thể làm chậm sự tiến triền của
bệnh thông qua các hiệu ứng báo vệ thần kinh cùa chúng . Tuy nhiên, việc sử
dụng bốn loại thuốc được FDA chấp thuận hạn chế bởi những tác dụng phụ
nghiêm trọng của chúng đối với đường tiêu hóa, phối và cơ. Acetylcholine
được sir dụng trong nhiều bộ phận của cơ the khác với não và tăng
acetylcholine trong cơ thể gây ra nhiều rối loạn. Huperzine A khơng có giới
hạn này bới vì nó có vẻ có ái lực rất mạnh đối với cholinesterase trong não.
1.3

Tổng quan về vi nấm nội sinh trong thực vật

1.3.1 Khái niệm vi nấm nội sinh trong thực vật
Vi nấm nội sinh là những vi sinh vật sống ớ mô sâu thực vật nhưng


không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [4,44], Vi nấm nội sinh là


thành phần chiếm tì lệ cao trong hàng
ngũ đơng đáo endophyte thực vật hiện
nay. Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ
với
cây
chủ,
chúng
sử
dụng
các

chất dinh dưỡng trong cây đề tồn tại, mang
lại nhiều lợi ích cho cây như tạo ra
các sán phẩm trao đối chất có hoạt tính sinh
học
như
các
hormon
sinh
trướng,
các chất kháng sinh có khá năng bảo vệ cây
khỏi các vi sinh vật gây bệnh.

Hình 1.3 Một phần thuộc nhóm nấm VAM( Glomus sp), vói các sợi nấm và các
túi khí trong rễ cây 112|
1.3.2 Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật
Hầu như tất cá các loài thực vật trong các hệ sinh thái tự nhiên đều có
tính cộng sinh với các loài vi nấm nội sinh. Các vi nấm nội sinh này có the có
lợi cho cây chú bằng cách ngăn ngừa sinh vật gây bệnh hoặc các sinh vật ký
sinh trên chúng, cũng có thể sản xuất các chất ức chế sự phát triển của các đối
thù cạnh tranh, bao gồm các vi sinh vật gây bệnh. Vi nấm nội sinh còn làm
tăng biếu hiện cùa gen liên quan đến khá năng phòng bệnh, làm cho cây có
khả năng chống lại nhiều mầm bệnh tiềm ẩn. Ví dụ, gliotoxin và gliovirin:
được sán xuát bời T.virens và chúng kiềm hãm sự phát triền của các loài
Rhizotonia và Pythium. Một số nghiên cứu đã chí ra rang, các cây trồng có vi
nấm nội sinh sẽ phát triến nhanh hơn, có tính kháng và cứng hơn so với cây


khơng chứa vi nấm nội sinh. Ngồi ra nấm giúp cây hấp thụ chất dinh dưỡng
từ đất, đồng thời cây là nhà máy cung cấp các loại thông qua quang hợp cho
nấm - chức năng mà chúng khơng có.



Ngồi những tác dụng có lợi, các loại vi nấm nội sinh cịn có thế là
những tác nhân gây bệnh khơng rõ ràng cho cây. Một số lồi nấm nội sinh
thế hiện như lồi hoại sinh tiềm ấn, chúng có thế không gây triệu chứng và
phát triển cùng với các giai đoạn của cây chủ, nhưng các vi nấm này có thê
phát triển khơng hạn chế và tái sản sinh khi mà cây chủ già hoặc chết đi. Sự
cạnh tranh dịch tiết cúa cây: dịch tiết cứa cây kích thích sự nảy mầm những
túi bào tử nấm Phytium (nấm gây bệnh cho cây), từ đó hình thành nên sợi
nấm và lây nhiễm vào cây. Nấm Trydoderma làm giảm sự nảy mầm cùa nấm
Phytium bằng cách sứ dụng dịch tiết đó vi thế mà các bào tứ Phytium không
thế nảy mầm.
Vi nấm nội sinh có thê được truyền từ phần này sang phần khác của cây
chủ theo chiều dọc( di truyền từ the hệ này sang thế hệ khác) hoặc ngang
(giữa các cá thề). Một số vi nấm nội sinh thương xuyên truyền theo chiều dọc
cũng có thể tạo ra các bào tứ trên cây được truyền theo chiều ngang.
1.3.3 ủng dụng của vì nấm nội sinh
1.3.3.1

Trong nơng nghiệp
Các chất có hoạt tính sinh học được sán xuất trực tiếp từ vi nấm nội

sinh, hay là sán phấm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực
vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và thực hiện một số chức năng
báo vệ, cung cấp các chất có lợi cho cây chủ [44], Bên cạnh đó, vi nấm nội
sinh cũng có thể là nguyên nhân gây biến đổi sinh lý cây chủ giúp cây chú
chống lại được với điều kiện sống bất lợi.
Năm 1999, Pereira và cộng sự đã cấy nhiễm nấm nội sinh vào cây
chuối khơng chì giúp cây có khả năng kháng lại thuốc diệt nấm mà nó cịn đột
biến đế duy trì sự đối kháng [4], Beauveria Bassiana là loại nấm diệt côn

trùng bằng cách gây bệnh lên côn trùng ở giai đoạn ấu trùng và thành trùng.
Nấm này được cấy nhiễm vào một số hạt ngũ cốc đề chống lại các côn trùng
tấn công cây chù trong một số giai đoạn sinh trướng và phát triến. Tuy nhiên,
trong sổ một số cây đã tìm thấy sự có mặt của lồi này, chửng tị nấm này có


dạng nội sinh tự nhiên không liên quan tới
quá trinh nấm xâm nhập vào cây.
Ngoài ra, một số nấm gây bệnh trên côn
trùng cũng đã được phân lập trên một
số cây trồng khác [4], Nấm Trichoderma sp.
được
sử
dụng
đế
báo
vệ
cây
trồng chống các bệnh trong cơng trình nghiên
cứu
cùa
Well
và
cộng
sự
(1972)
thơng báo: ở điều kiện ngồi đồng, nấm
Trichoderma hazianum đã ngăn chặn
được bệnh ớ thân, rề cây gây ra bới
Clerotium rolfsii. Koga và cộng sự đã

thực hiện cấy nhiễm nấm chi Acremoniitm
vào các cây để chúng có thể truyền
cho cây chủ khả năng kháng lại sự cạnh tranh
với
các
lồi
gây
hại
cho
cây.
Kết quả nghiên cứu cơng bố đã cấy nhiễm
thành cơng vào cây có đi trâu
(Festuca arundinacea) và cỏ hắc mạch
(Loỉium
perenné),
các
cây
này
đã
kháng lại được sâu kéo màng cõ Poa p.
teterreỉla
[4,20],
1.3.3.2 Trong y dược
Các chất có hoạt tính sinh học được sản sinh bởi các vi nấm nội sinh
được đánh giá là có tiềm năng phát triển trong lĩnh vực y dược. Theo các
nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyến hóa
thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid,
benzopyranones,

chinones,


flavonoid,

acid

phenolic,

quinon,

steroid,

terpenoid, tetralon,... [26], Các chất này được đánh giá là có tiềm năng phát
triển trong lĩnh vực y dược, được ứng dụng rộng rãi như hóa chất nơng


nghiệp, thuốc kháng sinh, ức chế miền dịch, chất chống oxy hóa và chất
chống ung thư [7],
Taxol (biệt dược của paclitaxel) là hợp chất được chiết xuất từ cây
thông đỏ, có khá năng làm gián đoạn sự phân chia và sự phát triến cùa tế bào,
ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư. Ket hợp với đặc tính không gây độc
taxol trở thành chất hàng đầu trong điều trị ung thư từ những thập niên 90 và
được chí định cho bệnh nhân ung thư vú di căn hoặc bệnh nhân ung thư
buồng trúng giai đoạn muộn. Nhu cầu về taxol rất lớn mà hàm lượng Taxol
trong thiên nhiên có giới hạn. Bới vậy, Taxomyces andreanae là nấm nội sinh
thực vật có khả năng sinh tổng hợp taxol được phân lập từ mạch libe bên


trong vó cây thơng đó Pacific bới Stierle,
A.,
Strobel,

G.,
and
Stierle,
D.
(1993) [39] đã góp phần làm tăng tỷ lệ chữa
bệnh lên cao hơn.
1.4

Tình hình nghiên cứu cây Thạch từng răng cưa sinh tổng hợp
Huperzine A trong nước và trên thế giói

1.5

. ỉ Các nghiên cứu trên thế giói
Trước thực trạng các bệnh lý về thần kinh như Alzheimer hay

Parkinson ngày càng gia tăng và vẫn chưa có thuốc điều trị cụ thể, việc tìm
kiếm phương pháp điều trị mới bao gồm các thuốc tháo dược, HupA được cho
là có cơng nhiều tiềm năng và được quáng bá rộng rãi như một tác nhân giúp
tăng cường trí nhớ. Trên cơ sở đó, Ohba và cộng sự, 2015 đã nghiên cứu và
chứng minh được nguồn HupA có trong Thạch tùng răng cưa đã được sứ
dụng như một chất ức chết tiềm năng của AchE và hoạt tính của nó đối với
các chức năng nhận thức đã được chứng minh ở chuột. Hơn nữa, phân tích
meta chi tiết của các thứ nghiệm lâm sàng ngầu nhiên cho thấy một tác động
có lợi cùa hupcrzinc A đối với các chức năng nhận thức của bệnh Alzhzcimcr.
Hầu hết Huperzine A dùng trong sản xuất thuốc đều được tách chiết từ
cây Thạch tùng răng cưa, nhưng chi cho số lượng rất nhở (0.007%). Nhung
cây này lại có nhược điếm là phát triến rất chậm cũng như khu vực phân bố
hạn chế, phải mất ít nhất 15 năm cho quá trình sinh trưởng cùa cây [28], Ni
cấy mơ cho cây này ít khi thành cơng (dựa vào kinh nghiệm nghiên cứu trước

đó của các nhà khoa học). Do vậy, khơng thế khai thác được một lượng lớn
hóa chất từ cây này để sư dụng làm thuốc [28], [30], Đã có nhiều phương
pháp sán xuất HupA từ thực vật được khám phá [28],[22],[31]. Mặc dù một
sổ loài khác trong Huperziaceae tạo ra lượng HupA lớn hơn, nhưng những
lồi này thậm chí cịn hiếm hơn trong tự nhiên, thậm chí làm cho chúng trớ
thành những ứng cứ viên ít mong muốn hơn làm nguồn tự nhiên cho sản xuất
HupA. Chính vì vậy mà đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học nhằm
thu được nguồn HupA cao hơn. Những nồ lực đầu tiên về nuôi cay in vitro


cùa Freeberg và cộng sự đã giúp Xiaoqiang Ma và David R.Gang (2005)