BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Tuấn Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP
PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN
Leptospira interrogans GÂY RA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Tuấn Hùng

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC XIN TÁI TỔ HỢP
PHÒNG BỆNH DO XOẮN KHUẨN

Leptospira interrogans GÂY RA

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy
2. GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh

Hà Nội – 2022


LỜI CÁM ƠN
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS.TS.
Nghiêm Ngọc Minh - Nguyên Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen và PGS.TS.
Võ Thị Bích Thủy – Trưởng Phịng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong suốt q trình học tập và
nghiên cứu, tơi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình và khích lệ động viên của các
thầy hướng dẫn, đây chính là động lực lớn lao giúp tôi không ngừng phấn đấu và
cố gắng vượt qua nhiều khó khăn để có thể hồn thành Luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp tại Phịng Hệ gen học vi sinh,
Phịng R&D Cơng ty Vetvaco đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, đồng hành và giúp đỡ
tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu tại đơn vị. Bằng những tình cảm
chân thành nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Trong q trình nghiên cứu và học tập, tơi đã nhận được những ý kiến đóng
góp quý báu của các nhà khoa học, cán bộ nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu hệ gen,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Những nhận xét và góp ý chun
mơn sâu sắc trong các buổi báo cáo, hội thảo đã giúp tơi hồn thiện tốt nhất Luận

án của mình.
Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, tập thể cán bộ
Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong q trình học tập và nghiên cứu tại
đây.
Sau cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, người thân và
bạn bè đã ln đồng hành và là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với tơi trong
suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành Luận án.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2022

Nguyễn Tuấn Hùng


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là: Nguyễn Tuấn Hùng, nghiên cứu sinh Học viện Khoa học và
Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chuyên ngành Công
nghệ sinh học xin cam đoan:
1- Đây là Luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy:
PGS.TS Võ Thị Bích Thủy và GS.TS Nghiêm Ngọc Minh.
2- Cơng trình này khơng trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được
công bố tại Việt Nam.
3- Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hồn tồn chính xác, trung thực và
khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về những cam kết này.
Hà Nội, ngày


tháng

năm 2022

Nguyễn Tuấn Hùng


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Từ viết tắt

Tên tiếng Việt

µl

Microliter

Micro Lít

APS

Ammonium persulphate

Ammonium persulphate

bp

Base pair


Cặp bazơ

BSA

Bovine serum albumin

Huyết thanh bị

CBB

Coomasie Brilliant Blue

Thuốc nhuộm gel SDS

cs

et.al

Cộng sự

dH2O

Distilled water

Nước khử ion

DNA

Deoxyribonucleic acid


Axit Deoxyribonucleic

DNase

Deoxyribonuclease

Enzyme nuclease


dNTP

Deoxyribonucleotide
DANH MỤC CHỮ VIẾTDeoxyribonucleotit
TẮT
Triphosphate
Triphosphate

E.coli

Escherichia coli

Vi khuẩn Escherichia coli

Ethylene Diamine Tetraacetace
EDTA
IPTG

Acid
Isopropyl β-D-1-


Axit aminopolycarboxylic
Chất cảm ứng biểu hiện gen

Kb

thiogalactopyranosid
Kilobase

Kilobasơ

kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

LB

Luria - Bertani

Môi trường LB

LD50

Lethal Dose, 50%

Liều gây chết 50%

L. interrogans


Leptospira interrogans

ml

Milliliter

Milli Lit

OD

Optical density

Mật độ quang học

PBS

Phosphate buffer saline

Nước muối đệm phốt phát

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi

Xoắn

Polimeraza


khuẩn

Leptospira

interrogans


Từ viết tắt

Tên đầy đủ
Sodium dodecyl sulfate

Tên tiếng Việt


SDS-PAGE

polyacrylamide gel

Điện di trên polyacrylamide

electrophoresis
TAE buffer

Tris-acetate-EDTA

Dung dịch đệm TAE
Enzyme DNA polymerase chịu

Taq


Taq polymerase

TE

Tris EDTA

Đệm TE chứa Tris

N,N,N,N-

Hóa chất được sử dụng trong

Tetramethylethylenediamine

đúc gel polyacrylamide

TEMED

nhiệt


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số TT

Tên Bảng

Trang

Bảng 1.1.


Nhóm huyết thanh và một số serovar của L.interrogans

6

Bảng 2.1.

Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR trong nghiên cứu

32

Bảng 2.2.

Hỗn hợp phản ứng PCR (10 µl)

33

Bảng 2.3.

Thành phần phản ứng cắt vector

37

Bảng 2.4.

Thành phần phản ứng nối gen vào vector

38

Bảng 2.5.


Thành phẩn gel acrylamide

40

Bảng 2.6.

Cơng thức chia nhóm và dung dịch tiêm mẫm cảm

46

Bảng 2.7.

Chuẩn bị các ống nghiệm và thêm vào các chất

48

Bảng 3.1.

Số lượng và trình tự các vùng giàu epitop của gen LipL21 được

66

dự đốn bằng các cơng cụ tin sinh
Bảng 3.2.

Trình tự mồi đặc hiệu nhân dịng đoạn gen LipL21

69


Bảng 3.3.

Kết quả kiểm tra ngưng kết với chất bổ trợ nhũ dầu

86

Bảng 3.4.

Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin

87

Bảng 3.5.

Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin trên động vật thí nghiệm

87

Bảng 3.6.

Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phản ứng vi ngưng kết

88

Bảng 3.7.

Kết quả kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc

95


Bảng 3.8.

Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma

96

Bảng 3.9.

Kết quả kiểm tra tạp nhiễm Salmonella

97

Bảng 3.10.

Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin trên động vật thí nghiệm

98

Bảng 3.11.

Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phản ứng vi ngưng kết

99

Bảng 3.12.

Kết quả tiêm thử nghiệm vắc xin trên bản động vật tại thực địa.

100



DANH MỤC CÁC HÌNH
Số TT

Tên Hình

Trang

Hình 1.1.

Hình dạng Leptospira interrogans dưới kính hiển vi điện tử qt

8

Hình 1.2.

Leptospira interrogans dưới KHV nền đen (x400)

9

Hình 1.3.

Sơ đồ lây truyền Leptospira

13

Hình 1.4.

Tỷ lệ nhiễm Leptospirosis hàng năm


16

Hình 2.1.

Chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR nhân gen

33

Hình 2.2.

Mơ tả q trình tiêm vắc xin rLipL21 và đánh giá hiệu quả tạo

54

miễn dịch trên chuột thí nghiệm
Hình 3.1.

Hình ảnh sau khi ly tâm thu xoắn khuẩn

55

Hình 3.2.

Hình ảnh điện di DNA tổng số

56

Hình 3.3.

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mồi 16S rRNA


56

Hình 3.4.

Điện di đồ sản phẩm PCR mồi 16S rRNA sau tinh sạch

57

Hình 3.5.

Hình ảnh trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA của 5 chủng

58

Leptospira
Hình 3.6.

Cây phát sinh chủng loại các chủng xoắn khuẩn nghiên cứu

59

Hình 3.7 A.

Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi OmpL1 ở Tm 55oC

61

Hình 3.7 B.


Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LigA ở Tm 55 oC

61

Hình 3.7 C. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LigB ở Tm 55 oC

61

Hình 3.7 D. Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL21 ở Tm 50 oC

61

Hình 3.7 E.

Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL32 ở Tm 50 oC

62

Hình 3.7 F.

Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi LipL41 ở Tm50 oC

62

Hình 3.8A.

Điện di đồ sản phẩm nhân bản tồn bộ gen LipL21

63


Hình 3.8B.

Điện di đồ sản phẩm PCR nhân bản gen LipL21

63

Hình 3.9.

Trình tự nucleotit của gen LipL21

64

Hình 3.10.

Trình tự axit amin của gen LipL21

65

Hình 3.11.

Cấu trúc 3D gen LipL21 của 5 chủng xoắn khuẩn

65

Hình 3.12.

Tạo, sàng lọc và kiểm tra dịng tái tổ hợp pJET1.2-LipL21 ở tế

71


bào E.coli DH10b
Hình 3.13.

Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của 05 chủng Leptospira và
trình tự gen LipL21 trong plasmid

72


Số TT
Hình 3.14.

Tên Hình
Tạo, sàng lọc và kiểm tra dịng tái tổ hợp pET32a-LipL21 ở tế

Trang
75

bào E.coli BL21
Hình 3.15.

Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của Leptospira interogen và

76

trình tự gen LipL21 trong plasmid
Hình 3.16.

Điện di đồ sản phẩm protein tái tổ hợp LipL21 ở E. coli BL21


77

Hình 3.17.

Điện di đồ sản phẩm protein được biểu hiện trong các điều kiện

78

nhiệt độ ni cấy cảm ứng khác nhau
Hình 3.18.

Điện di đồ sản phẩm protein được biểu hiện trong các điều kiện

79

nồng độ cảm ứng IPTG khác nhau.
Hình 3.19.

Điện di đồ sản phẩm protein được biểu hiện trong các điều kiện

80

thời gian cảm ứng IPTG khác nhau
Hình 3.20.

Định lượng bằng Bradford các phân đoạn tinh sạch

81

Hình 3.21.


Điện di đồ sản phẩm biểu hiện của pET32a-LipL21

81

ở E. coli BL2 đã tinh sạch
Hình 3.22.

Kết quả ngưng kết giữa kháng nguyên là protein tái tổ hợp

82

LipL21 với nồng độ khác nhau 100µg, 250µg, 500µg và kháng
thể thu được từ thỏ
Hình 3.23.

Kết quả của phản ứng MAT giữa chủng Leptospira sống và

83

huyết thanh thu được
Hình 3.24.

Phản ứng vi ngưng kết của protein tái tổ hợp LipL21 được phối

86

trộn với nhũ dầu với liều tiêm là 1ml và 2ml
Hình 3.25.


Tỷ lệ chuột tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 sống/ chết sau công

89

cường độc xoắn khuẩn Leptospira
Hình 3.26.

Hình ảnh chụp các thay đổi mơ bệnh học của thận và gan ở

89

chuột thí nghiệm
Hình 3.27.

Kết quả phản ứng Western blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp

91

rLipL21 và kháng thể đặc hiệu
Hình 3.28.

Máy tạo nhũ L4RT (Hãng Silverson - Anh Quốc)

94


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1

1. Tính cấp thiết của luận án

1

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

2

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

3

4. Những đóng góp mới của luận án

3

5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án

3

6. Bố cục của luận án

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

5

1.1.

Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis

5

1.1.1.

Đặc điểm sinh học của xoắn khuẩn Leptospira

5

1.1.1.1.

Phân loại học

5

1.1.1.2.

Cấu trúc hình thái

8

1.1.1.3.


Đặc tính ni cấy xoắn khuẩn Leptospira

8

1.1.1.4.

Sức đề kháng của mầm bệnh

9

1.1.1.5.

Tính sinh miễn dịch

10

1.1.2.

Đặc điểm dịch tễ học

11

1.1.2.1.

Nguồn bệnh

11

1.1.2.2.


Đường xâm nhập của mầm bệnh

12

1.1.2.3.

Đặc tính gây bệnh của xoắn khuẩn Leptospira

13

1.1.3.

Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis

14

1.1.3.1.

Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên thế giới

14

1.1.3.2.

Tình hình nghiên cứu bệnh Leptospirosis trên gia súc và người ở

16

Việt Nam

1.2.

Nghiên cứu hệ gen xoắn khuẩn Leptospira

18


1.2.1.

Đặc điểm toàn bộ hệ gen xoắn khuẩn Leptospira

18

1.2.2.

Đặc điểm hệ gen quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn

19

Leptospira
1.2.3.

Cơ chế tạo kháng thể trong cơ thể của xoắn khuẩn Leptospira

20

1.3.

Tình hình nghiên cứu vắc xin phịng bệnh Leptospirosis


22

1.3.1.

Tình hình nghiên cứu vắc xin phịng bệnh Leptospirosis trên

22

thế giới
1.3.2.

Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis tại

24

Việt Nam
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

28

2.1.

Nguyên liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

28

2.1.1.

Vật liệu


28

2.1.2.

Hóa chất

29

2.1.3

Trang thiết bị

29

2.2.

Phương pháp nghiên cứu

30

2.2.1

Tạo kháng nguyên tái tổ hợp rLipL21 mang các epitope

30

2.2.1.1.

Nuôi cấy, tăng sinh 5 chủng xoắn khuẩn Leptospira


30

2.2.1.2.

Tách chiết DNA tổng số

30

2.2.1.3.

Định lượng, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số

31

2.2.1.4.

Thiết kế cặp mồi của gen 16S rRNA và 6 gen quyết định kháng

31

nguyên: OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, và LigB
2.2.1.5.

Kỹ thuật PCR

32

2.2.1.6.

Tinh sạch sản phẩm PCR


33

2.2.1.7.

Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger

34

2.2.1.8.

Xây dựng cây phát sinh chủng loại và định danh chính xác 5

34

chủng Leptospira về mặt phân tử
2.2.1.9.

Xác định mức độ tương đồng về trình tự nucleotit và trình tự axit

35

amin, các vùng giàu epitop trên các đoạn gen quyết định
kháng nguyên
2.2.1.10.

Phản ứng gắn đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng

35


2.2.1.11.

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng

36

phương pháp sốc nhiệt


2.2.1.12.

Tách chiết và định lượng DNA plasmid

36

2.2.1.13.

Cắt vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu và vector biểu

37

hiện bằng enzyme giới hạn
2.2.1.14.

Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn

38

2.2.1.15.


Gắn gen mã hóa protein LipL21 vào vector biểu hiện

38

2.2.1.16.

Biểu hiện gen đích trong chủng E. coli BL21

38

2.2.1.17.

Điện di DNA trên gel agarose

39

2.2.1.18.

Điện di protein trên gel polyacrylamide có chất khử (SDS-

40

PAGE)
2.2.1.19.

Ni cấy tế bào vi khuẩn E. coli và thu protein tổng số trong

41

phân đoạn dịch chiết và kết tủa tế bào

2.2.1.20.

Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký protein

42

qua cột ái lực His-bind
2.2.2.

Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc

42

hiệu kháng protein tái tổ hợp rLipL21
2.2.2.1.

Chuẩn bị dung dịch tiêm để gây miễn dịch

43

2.2.2.2.

Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng kháng nguyên tái tổ hợp

44

rLipL21
2.2.2.3.

Kỹ thuật phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể


46

2.2.2.4.

Kỹ thuật phản ứng vi ngưng kết (Microscopic Agglutination

47

Test: MAT)
2.2.2.5.

Kĩ thuật Western Blot xác định kháng nguyên rLipL21

48

2.2.3.

Kỹ thuật sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21

51

2.2.3.1.

Kiểm tra tính sinh miễn dịch với hàm lượng protein tái tổ hợp

51

rLipL21 khác nhau
2.2.3.2.


Kỹ thuật tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21

51

2.2.3.3.

Định liều tiêm vắc xin

52

2.2.3.4.

Quy trình kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21

2.2.3.5.

Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch

53

2.2.3.6.

Chế tạo thử nghiệm 600 liều vacxin tái tổ hợp phòng bệnh

54

3

Leptospirosis

2.3.

Phân tích và xử lý kết quả trong nghiên cứu

54


2.4.

Địa điểm tiến hành nghiên cứu

54

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

55

3.1.

55

Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh
chủng loại

3.1.1.

Nuôi cấy, tăng sinh xoắn khuẩn

55


3.1.2.

Tách chiết DNA tổng số

55

3.1.3.

Nhân gen 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu

56

3.1.4.

Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rRNA

57

3.1.5.

Giải trình tự gen 5 chủng xoắn khuẩn

57

3.1.6.

Xây dựng cây phát sinh chủng loại

59


3.2.

Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và

60

vùng giàu epitop của gen
3.2.1.

Nhân gen với các cặp mồi của 6 gen quyết định kháng nguyên

60

3.2.2.

Tinh sạch và giải trình tự đoạn gen quyết định kháng nguyên

63

xuất hiện trên cả 5 chủng xoắn khuẩn
3.2.3.

Xác định trình tự nucleotit, trình tự axit amin và vùng giàu

63

epitop của các gen quyết định kháng nguyên LipL21
3.2.3.1.

Trình tự nucleotit


63

3.2.3.2.

So sánh trình tự axit amin

65

3.3.3.3.

Xác định vùng giàu epitop

66

3.3.

Nhân dòng gen quyết định kháng nguyên và biểu hiện

69

protein LipL21
3.3.1.

Nhân dòng đoạn gen quyết định kháng nguyên vào vector

69

pJET1.2 trong hệ biểu hiện E.coli DH 10B
3.3.2.


Chèn gen LipL21 vào vector biểu hiện pET32a

73

3.3.3.

Biểu hiện và tối ưu các điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp

76

LipL21
3.4.

Kiểm tra tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp rLipL21

82

3.5.

Qui trình chế tạo vắc xin tái tổ hợp rLipL21 phòng bệnh

84

Leptospirosis
3.5.1.

Xác định chất bổ trợ phối trộn đặc hiệu với kháng nguyên tái
tổ hợp rLipL21 để tạo vắc xin tái tổ hợp


84


3.5.2.

Định liều tiêm vắc xin tái tổ hợp rLipL21 nhũ dầu cho động

85

vật thí nghiệm
3.5.3.

Kiểm nghiệm vắc xin tái tổ hợp rLipL21

87

3.5.3.1.

Đánh giá chỉ tiêu vô trùng

87

3.5.3.2.

Đánh giá chỉ tiêu an toàn

87

3.5.3.3.


Đánh giá chỉ tiêu hiệu lực

88

3.5.3.4.

Đánh giá hiệu quả tạo miễn dịch trên động vật thí nghiệm

88

3.6.

Sản xuất vắc xin và các đánh giá khác với vắc xin tái tổ hợp

92

rLipL21
3.6.1.

Sản xuất 600 liều vắc xin

92

3.6.2.

Kiểm tra các chỉ tiêu của vacxin theo tiêu chuẩn ngành

94

3.6.2.1.


Kết quả kiểm tra tạp nhiễm các loại vi khuẩn và nấm mốc

94

3.6.2.2.

Kết quả kiểm tra an toàn

97

3.6.2.3.

Kết quả kiểm tra hiệu lực

98

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

102

4.1.

Kết luận

102

4.2.

Kiến nghị


103

DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

104

TÀI LIỆU THAM KHẢO

105

PHỤ LỤC

121


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là một trong những bệnh truyền
nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến trên thế giới, được Tổ
chức Sức khỏe động vật Thế giới (OIE) xếp vào nhóm thứ 2 của Bệnh nguy hiểm và
được bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam. Nguyên nhân gây ra bởi một
loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans. Bệnh lây nhiễm sang người qua niêm mạc,
da, mắt hoặc các màng nhầy tiếp xúc với nước bị ô nhiễm nước tiểu động vật nhiễm
bệnh. Bệnh Leptospirosis rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm như động
vật ở ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật ni trong gia đình, đồng thời
Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong mơi trường tự nhiên. Đặc biệt bệnh này càng
khó kiểm sốt ở những nước nông nghiệp phát triển (kéo theo đàn gia súc đơng đúc)

và có tình trạng vệ sinh mơi trường kém (tạo điều kiện mầm bệnh phát triển).
Bệnh do xoắn khuẩn Leptospira là loại vi khuẩn gram (-) gây ra nên có thể
điều trị khỏi bằng kháng sinh đặc trị penicillin hoặc các kháng sinh thay thế
ampicillin, amoxicillin, tetracyclin, doxycyclin, erythromyxin, streptomycin và
cephalosporin,... Tuy nhiên cần phát hiện bệnh sớm, xác định type gây bệnh, giai
đoạn mắc bệnh thì mới có phác đồ điều trị hiệu quả. Sau khi khỏi bệnh, vật ni có
miễn dịch nhưng chỉ với type huyết thanh mắc bệnh. Do vậy vẫn có thể bị lại với
type khác.
Hiện nay, trong thời đại công nghệ 4.0, sinh học công nghệ cao rất phát triển
nên các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu về sinh học phân tử, các gen tiềm
năng làm vacxin tái tổ hợp,…Trong quá trình nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa
học trên thế giới và Việt Nam đang tập trung vào các loại vắc xin có khả năng
phịng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao và lâu
dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng và động vật. Đặc biệt quan tâm với
loại vắc xin nhược độc được thiết kế trên cơ sở trình tự gen và các yếu tố độc lực
của các tác nhân gây bệnh để tối ưu hóa mức độ an tồn của các loại vắc xin. Đây là
một bước đột phá thực sự, ứng dụng công nghệ di truyền trong chế tạo vắc xin nói


2

chung và vắc xin Leprospirosis nói riêng. Thực tế, nhiều protein ngồi màng của
xoắn khuẩn Leptospira đã được tìm thấy và thu hoạch, đó là ứng cử viên cho cơng
nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp. Quá trình thu hoạch, tái tổ hợp và tinh sạch các
protein này đơn giản, hơn nữa protein tái tổ hợp có giá trị tương tự như kháng
nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để phát hiện Leptospires. Các báo cáo cũng cho
thấy rằng vắc xin phịng bệnh Leptospirosis tái tổ hợp có miễn dịch cao hơn so với
các loại vắc xin thông thường. Do đó, các nghiên cứu về cơng thức tối ưu, chất bổ
trợ, liều lượng và liệu trình để phát triển các loại vắc xin Leptospirosis đạt hiệu quả
cao, an toàn cho người và động vật sử dụng là rất cần thiết.

Cho đến thời điểm hiện tại, Việt Nam chưa có đơn vị nào sản xuất vắc xin
Leptospirosis tái tổ hợp trong khi đó dịch tễ của bệnh cho thấy có 5 serovar khác
nhau gây bệnh trên động vật nên việc tìm ra gen quyết định kháng nguyên cùng
xuất hiện trên cả 5 chủng Leptospira gây bệnh để làm cơ sở sản xuất vắc xin tái tổ
hợp phòng bệnh Leptospirosis là rất cần thiết. Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira
interrogans gây ra.”
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Xác định một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá trị ứng dụng
trong chế vắc xin tái tổ hợp chống lại Leptospirosis tại Việt Nam.
Nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng và chống lại bệnh gây ra do
xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
Nuôi cấy, định danh phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại 5 chủng
xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam.
Xác định các gen quyết định kháng nguyên trên 5 chủng và vùng giàu
epitope của gen được lựa chọn.
Nhân dòng đoạn gen quyết định kháng nguyên vào vector PJET1.2 trong hệ
biểu hiện E.coli DH10b. Biểu hiện gen đích trong chủng E. coli BL21.
Sản xuất và tinh sạch protein tái tổ hợp rLipL21.
Kiểm tra khả năng gây miễn dịch cho thỏ của kháng nguyên rLipL21.


3

Sản xuất vắc xin tái tổ hợp rLipL21 và kiểm nghiệm vắc xin trong qui mơ
phịng thí nghiệm.
Sản xuất qui mơ pilot 600 liều vắc xin tái tổ hợp phịng bệnh Leptospirosis.
Đánh giá hiệu quả việc tiêm thử nghiệm vắc xin tái tổ hợp trên đàn gia súc
tại một số địa phương.

4. Những đóng góp mới của luận án
Bộ dữ liệu phân tử về các gen quyết định kháng nguyên tiềm năng có thể sử
dụng cho sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh Leptospirosis phù hợp với
đặc điểm dịch bệnh của Việt Nam.
Tạo thành công protein tái tổ hợp rLipL21 phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ
hợp phịng chống bệnh Leptospirosis. Hồn chỉnh quy trình sản xuất vắc xin tái tổ
hợp Leptospira đạt tiêu chuẩn Việt Nam. Lần đầu tiên sản xuất và thử nghiệm thành
công vắc xin tái tổ hợp Leptospira trên quy mô pilot.
5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
Xác định được các gen gây đáp ứng miễn dịch của xoắn khuẩn Leptospira
interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam, đây là các gen tiềm năng để sử
dụng trong nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh Leptospirosis
cho động vật tại Việt Nam.
Tạo được protein tái tổ hợp phịng bệnh Leptospirosis đảm bảo tính kháng
ngun và tính sinh miễn dịch cao.
Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin tái tổ hợp Leptospira đạt tiêu chuẩn
Việt Nam
Sản xuất thử nghiệm 600 liều vắc xin tái tổ hợp Leptospira, kiểm chứng chất
lượng và các chỉ số an toàn, khả năng bảo hộ miễn dịch trên mơ hình in vivo.
Sau q trình thử nghiệm pilot thành cơng, quy trình sản xuất vắc xin tái tổ
hợp phòng bệnh Leptospirosis sẽ được chuyển giao cho Công ty Thuốc Thú y Trung
ương VETVACO để sản xuất quy mô công nghiệp, phục vụ cho công tác phòng
chống dịch bệnh cho động vật tại Việt Nam.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 121 trang, trong đó phần Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài liệu 23
trang; Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 27 trang; Kết quả và thảo luận 47


4


trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục cơng trình của tác giả 1 trang; Tài
liệu tham khảo 17 trang gồm 140 tài liệu; Trong luận án có 20 bảng, 34 hình và 4
bài báo trong phần Phụ lục.


5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm xoắn khuẩn Leptospira và bệnh Leptospirosis
1.1.1. Đặc điểm vi sinh vật học của xoắn khuẩn Leptospira
1.1.1.1. Phân loại học
Theo khóa phân loại khoa học Leptospira được xếp vào
Giới: Bacteria
Ngành: Spirochaetes
Lớp: Spirochaetes
Bộ: Spirochaetales
Họ: Leptospiraceae
Giống: Leptospira
Dựa trên sự tương đồng của bộ gen, các xoắn khuẩn thuộc giống Leptospira
spp. đã được chia thành 20 loài [1], bao gồm những lồi gây bệnh và khơng gây
bệnh (hoại sinh):
Những loài xoắn khuẩn gây bệnh: L. Interrogans, L. Kirschneri, L.
Borgpetersenii, L. Santarosai, L. Noguchii, L. Weilii, L. Alexanderi và L. Alstonii.
Những lồi hoại sinh (khơng gây bệnh): L. Biflexa, L. Wolbachii, L. Kmetyi, L.
Meyeri, L. Vanthielii, L. Terpstrae và L. Yanagawae.
Trước năm 1989, chi Leptospira được chia thành hai loài Leptospira
interrogans bao gồm tất cả các chủng gây bệnh và Leptospira biflexa gồm các
chủng hoại sinh (không gây bệnh). Sự phân chia này dựa trên các đặc tính kiểu hình
và sự sinh trưởng của chúng như các chủng hoại sinh có khả năng mọc được ở nhiệt
độ 11-13oC và sinh trưởng với sự có mặt của 8-azaguanine (225 μg/ml) [2].

Một số loài trung gian gây bệnh hoặc hoại sinh: L. Inadai, L. Broomii, L.
Fainei, L. Wolffii và L. Licerasiae [3, 4]. Tuy nhiên, cũng có một số lồi lại bao gồm
cả các chủng xoắn khuẩn gây bệnh và không gây bệnh. Ngày nay hệ thống phân loại
mới dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử và khác hẳn với hệ thống phân loại trước đây
dựa trên khảo sát huyết thanh học [5].
Các serovar Leptospira gây bệnh được xếp vào các nhóm khác nhau dựa vào
mối quan hệ kháng nguyên, thông qua việc xác định bằng phản ứng ngưng kết hay


6

theo kiểu hấp phụ ngưng kết chéo với kháng nguyên tương đồng [3]. Mặc dù khơng
dựa vào nhóm huyết thanh để phân loại Leptospira nhưng chúng rất có ý nghĩa về
mặt dịch tễ học. Các nhóm huyết thanh của L. interrogans và một số phân loài phổ
biến được thể hiện qua Bảng 1.1
Bảng 1.1. Nhóm huyết thanh và một số serovar của L. interrogans
Số TT

Nhóm

Serovar (s)

huyết thanh
1

Icterohaemorrhagiae

icterohaemorrhagiae, copenhageni,
lai, zimbabwe


2

Hebdomadis

hebdomadis, jules, kremastos

3

Autumnalis

autumnalis, fortbragg, bim,
weerasinghe

4

Pyrogenes

pyrogenes

5

Bataviae

bataviae

6

Gryppotyphosa

7


Canicola

8

Australis

australis, bratislava, lora

9

Pomona

pomona

10

Javanica

javanica

11

Sejroe

sejroe, saxkoebing, hardjo

12

Panama


panama, mangus

13

Cynopteri

cynopteri

14

Djasiman

djasiman

15

Sarmin

sarmin

16

Mini

mini, georgia

17

Tarassovi


tarassovi

18

Ballum

ballum, aroborea

19

Celledoni

celledoni

20

Louisiana

louisiana, lanka

gryppotyphosa, canalzonae,
ratnapura
canicola


7

Số TT


Nhóm

Serovar (s)

huyết thanh
21

Ranarum

ranarum

22

Manhao

manhao

23

Shermani

shermani

24

Hurstbridge

hurstbridge

[3].

Theo các nhà nghiên cứu huyết thanh học, hiện nay có trên 260 serovar gây
bệnh được xếp vào 24 serogroup huyết thanh và 60 serovar thuộc nhóm hoại sinh
[6]. Các serovar gây bệnh được phân chia thành các serogroup dựa trên mối quan hệ
kháng nguyên được xác định bằng phản ứng ngưng kết và tiếp theo được chia thành
các serovar theo kiểu hấp thụ ngưng kết.
Việc phân loại kiểu hình của Leptospira đã được thay thế bằng kiểu gen,
trong đó gen phổ biến bao gồm tất cả các serovar của cả L. interrogans và L. biflexa.
Hiện tại, các serovar gây bệnh cịn được tìm thấy trong 10 loài Leptospira
interrogans, L. noguchii, L. santarosai, L. meyeri, L. borgpetersenii, L. kirschneri,
L. weilii, L. inadai, L. fainei và L. alexanderi. Trong đó, một serovar mới đã được
bổ sung L. fainei serovar Hurstbridge [7], Hệ thống phân loại mới dễ bị lẫn lộn bởi
vì nhiều serovar và serogroup gây bệnh cũng như khơng gây bệnh có thể nằm trong
cùng một lồi, ngược lại một serovar hoặc serogroup cũng có thể nằm trong nhiều
lồi khác nhau. Điều này cho thấy khơng có sự tương đồng giữa hệ thống phân loại
dựa trên cấu trúc kháng nguyên bề mặt và hệ thống phân loại dựa trên cấu trúc gen.
Sự nhận dạng và phân loại đến loài trong chi Leptospira là rất quan trọng, bởi vì
chúng có tính gây bệnh trên các lồi động vật khác nhau. Việc tái phân loại
Leptospira dựa trên nền tảng kiểu gen là chính xác về mặt danh pháp và cung cấp
cơ sở vững chắc cho định loại xoắn khuẩn này trong tương lai. Bên cạnh đó, việc
phân loại dựa vào cơ sở phân tử cũng gặp một số khó khăn đối với các nhà nghiên
cứu lâm sàng, bởi vì hệ thống này không tương hợp rõ ràng với hệ thống serovar
(chủng)/serogroups (nhóm huyết thanh) lâu nay đã được sử dụng trong chẩn đoán
xác định xoắn khuẩn Leptospira và trong các nghiên cứu về dịch tễ học [8].


8

Hiện nay một số kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để xác định và mô
tả đặc điểm của Leptospira spp. đã xác định được 20 loài Leptospira spp. trong đó
có 9 lồi Leptospira gây bệnh [6]. Việc phân loại này dựa trên kết quả phân tích

phát sinh loài, gen 16S rRNA được xem như thử nghiệm sàng lọc ban đầu để xác
định Leptospira trong các mẫu lâm sàng nghi ngờ nhiễm Leptospira [9, 10].
1.1.1.2. Cấu trúc hình thái
Leptospira là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có hình móc câu, xoắn,
chuyển động khơng theo quy luật nào, có thể di chuyển thẳng, xoay trịn, theo hình
sóng… Leptospira có kích thước: khoảng rộng 0,1-0,2 µm; dài 6-20 µm, khoảng
cách giữa các vịng xoắn là 0,5 µm [3]. Vi khuẩn bắt màu nâu đen với phương pháp
nhuộm thấm bạc, bộ phận di động của vi khuẩn gồm một trục ở giữa và thân xoắn
như lị xo quanh trục. Ngồi cùng có một vỏ mềm co giãn được chứa nhiều kháng
nguyên, tiếp theo là màng bao bọc tế bào chất bao gồm 3-5 lớp, ở giữa là nhân
khơng có màng ngăn cách với nguyên sinh chất đảm nhận chức năng di truyền. Do
có cấu trúc đặc biệt như vậy nên Leptospira vận động rất uyển chuyển và có khả
năng co giãn dễ dàng, chúng có thể chui qua da, niêm mạc của gia súc hoặc của
người khi ngâm nước hoặc có vết trầy xước. Khi cho qua lọc Seitz với kích thước lỗ
lọc 0,1-0,45 µm, hầu hết các vi khuẩn đều bị giữ lại nhưng chỉ có xoắn khuẩn
Leptospira có thể chui qua được dễ dàng.

Hình 1.1. Hình dạng Leptospira interrogans dưới kính hiển vi điện tử quét [11].
1.1.1.3. Đặc tính ni cấy xoắn khuẩn Leptospira
Leptospira có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy nhân tạo. Vi khuẩn phát
triển ở nhiệt độ thích hợp 28-30oC. pH hơi kiềm 7,2 – 7,5 và thời gian phân


9

chia của mỗi thế hệ kéo dài khoảng 7-10 ngày đối với các chủng mới phân lập, do
vậy khó phát hiện bằng phương pháp ni cấy thơng thường ở phịng thí nghiệm.
Mơi trường ni cấy xoắn khuẩn Leptospira cần phải có huyết thanh thỏ tươi như
mơi trường Terskich, mơi trường Korthof. Trong các môi trường này xoắn khuẩn
Leptospira mọc chậm khoảng 1 tuần, làm mơi trường đục nhẹ. Ngồi ra vi khuẩn có

thể phát triển trong phơi gà. [11].
Xoắn khuẩn có thể phát triển trong mơi trường Ellinghausen- McCulloughJohnson-Harris (EMJH) nhưng sự phát triển của Leptospira rất chậm, có đơi khi kéo
dài đến 3 tháng. Ở nhiệt độ 28-30oC có thể nhận thấy được sự phát triển của các
chủng gây bệnh sau 4-7 ngày ni cấy, cịn sự phát triển của các chủng hoại sinh
chỉ sau 2-3 ngày ở nhiệt độ 11-130C. Do đó có thể dựa vào khả năng phát triển ở
130C để phân biệt các loài Leptospira hoại sinh hay loài Leptospira gây bệnh [3].
Trong cùng một điều kiện mơi trường ni cấy những lồi hoại sinh sẽ phát
triển nhanh hơn các loài gây bệnh do chúng thường sống trong mơi trường nước
đọng hay hịa lẫn trong đất ẩm cho nên khi nuôi cấy phải thường xuyên kiểm tra, ít
nhất mỗi tuần 1 lần dưới kính hiển vi nền đen để có được kết quả chính xác [12].

Hình 1.2. Leptospira interrogans dưới KHV nền đen (x400) [13].
Trong quá trình ni cấy Leptospira, để tránh sự vấy nhiễm của các vi khuẩn
trong giai đoạn đầu nuôi cấy, đặc biệt các mẫu có nguồn gốc từ động vật bệnh có
biểu hiện triệu chứng lâm sàng hoặc từ môi trường, cần bổ sung thêm kháng sinh 5fluorouracil vào môi trường nuôi cấy làm hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn vấy
nhiễm khác nhưng không làm giảm sự tăng trưởng của Leptospira [3, 11].
1.1.1.4. Sức đề kháng của mầm bệnh