Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
MỤC LỤC
PHẦN I: MỞ ĐẦU 3
PHẦN II: NỘI DUNG 4
I. CÁC ENZYME CẮT GIỚI HẠN 4
1. Enzyme cắt giới hạn 4
2. Vai trò của các enzyme cắt giới hạn 4
3. Tính chất của enzyme giới hạn 5
3.1 Trình tự nhận biết của RE 5
3.2 Các kiểu cắt của RE 7
4. Danh pháp 10
5. Phân loại enzyme giới hạn 11
5.1. Enzyme loại I 12
5.2. Enzyme loại III 13
5.3. Enzyme loại II 14
6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả cắt của RE 16
6.1. Độ tinh sạch của DNA 16
6.2. Mức độ methyl hóa của DNA 16
6.3. Đặc tính methyl hóa của RE 18
7. Ứng dụng của RE 18
II. CÁC ENZYME BIẾN ĐỔI 19
1. Enzyme polymerase 19
1.1 DNA polymerase 19
1.2. RNA polymerase 26
2. Enzyme gây biến đổi đầu cuối DNA 29
2.1. T4 polynucleotide kinase 29
2.2. Alkaline phosphatase 30
3. Nuclease 31
3.1. DNase I (Deoxyribonuclease I) 31
3.2. Exo III (Exonuclease III ): 32

3.3. RNase A ( Enzyme Ribonuclease A): 32
3.4. RNase H: 33
3.5. RNase T1 (Enzyme ribonuclease T1) 33
3.6. Enzyme nuclease S1 34
III. CÁC ENZYME NỐI (LIGASE) 35
1. DNA ligase 35
1.1. T4 DNA ligase 36
1.2. E.coli DNA ligase 36
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
1
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
2. 37
3939393939393939393939393939393939T4 RNA ligase 37
PHẦN III: KẾT LUẬN 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
2
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
PHẦN I: MỞ ĐẦU
Sinh học phân tử không chỉ là một lĩnh vực mới mà còn trở nên cần
thiết trong bất cứ chuyên ngành nào của sinh vật học. Quá trình nghiên cứu
Sinh học phân tử đã diễn ra trong một thời gian dài và người ta đã ứng dụng
được những thành tựu của chúng vào các lĩnh vực khác nhau để mang lại
những lợi ích nhất định trong đời sống cũng như trong sản xuất.
Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của
sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát

triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã
cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ
genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào
trong một cơ thể sinh vật khác. Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen
do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định. Enzyme là công
cụ cơ bản trong kỹ thuật tạo dòng phân tử. Sinh học phân tử đã phát hiện và
hiểu rõ cơ chế tác động của hàng loạt enzyme, nhờ đó đã sử dụng chúng như
những công cụ hữu hiệu trong việc cắt nối và ghép các gen.
Trong tạo dòng phân tử có sự tham gia của các enzyme: enzyme
nuclease, DNA-polymerase, ligase và restriction endonuclease. Để hiểu thêm
về các enzyme tạo dòng nên tôi đã chọn đề tài "CÁC ENZYME ĐƯỢC SỬ
DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG PHÂN TỬ "
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
3
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
PHẦN II: NỘI DUNG
I. CÁC ENZYME CẮT GIỚI HẠN
1. Enzyme cắt giới hạn
Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme
giới hạn (restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự
nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại
các vị trí đặc thù.
Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phagơ (thể thực khuẩn) thì vi
khuẩn đó bị phagơ phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phagơ lại
không bị phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzyme có khả năng
cắt DNA phagơ thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người
đầu tiên tách được loại enzyme này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae
được gọi tên là HinII. Ngay sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần

lớn các loài vi khuẩn mang loại enzyme có chức năng cắt DNA lạ xâm nhập
để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của các DNA lạ. Những enzyme đó được
gọi là enzyme giới hạn.
2. Vai trò của các enzyme cắt giới hạn
Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi
khuẩn E. coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA được đưa
vào, gọi là DNA ngoại lai hay DNA lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như
bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn. Chỉ trong một số ít trường hợp
DNA lạ đó mới không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bản trong tế bào chủ.
Điều đó chứng tỏ DNA lạ được sửa đổi bằng cách nào đó dưới sự kiếm soát
của tế bào chủ. Các hiện tượng nói trên xảy ra chủ yếu khi các thể thực khuẩn
(phage) xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn.
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
4
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi
khuẩn là những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và các
enzyme cắt giới hạn. Chúng đều có đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự
của DNA vật chủ và DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau. Cụ thể, các
enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ 259 bằng cách
gắn thêm nhóm methyl (-CH
3
) ở một số base nhất định trong đoạn nhận biết
(recognition sequence) hay đoạn đích (target sequence). Hiện tượng methyl
hoá (methylation) này thường xảy ra đối với adenine và biến đổi nó thành N-6
methyladenine. Trong khi đó, các enzyme giới hạn lại đóng vai trò vô hiệu
hoá hoạt tính di truyền của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc thù
chừng nào nó chưa được sửa đổi cho giống với DNA vật chủ. Như vậy, các

enzyme giới hạn đóng vai trò là hàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn
nhằm chống lại sự xâm nhập của các phage lạ.
3. Tính chất của enzyme giới hạn
3.1 Trình tự nhận biết của RE
Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị
trí, nghĩa là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị trí
xác định. Tuỳ theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại: 260 loại
I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận biết và loại
II bao gồm các enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết. Ở đây chúng ta
chỉ xét các enzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụ hiệu năng (giống
như con dao mổ tinh vi) cho phép thao tác trên các gene trong kỹ thuật DNA
tái tổ hợp.
Enzyme giới hạn có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất
định và cắt DNA ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận.
Trong tự nhiên các enzyme hạn chế, hiện diện trong hầu hết các tế bào
vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế
bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế
nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
5
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không được nhận biết bởi các
enzyme hạn chế.
Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế của vi khuẩn cắt DNA ở những
trình tự đặc biệt, đã giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn, do nó có thể giảm
chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn
hơn. Hiện nay, các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote.
Mỗi enzyme hạn chế chỉ nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt

thường chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide. Ví dụ enzyme EcoRI tách chiết từ
E. coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt
trình tự TGGCCA. Có hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ
khoảng 250 chủng vi sinh vật.
Đoạn nhận biết thường dài từ 4-6 cặp nu, thường có cấu trúc cân đối bộ
đôi (có nghĩa là trình tự nu hướng 5’-3’ của sợi đơn này giống với trình tự nu
hướng 5’-3’ của sợi bổ sung kia, một số ít có khả năng cắt lệch trên 2 sợi đơn.
Hai enzyme Not I và SfiI nhận biết một đoạn dài 8 cặp nu, đoạn này ít tìm
thấy trong DNA genome nên thường được dùng để cắt DNA nhằm tạo thành
các đoạn lớn DNA.
Bảng 1. Trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế
STT Tên enzyme Vị trí nhận biết Đầu được tạo ra
1 EcoRI 5’…G↓AATTC…3’
3’…CTTAA↑G…5’
5’…G AATTC…3’
3’…CTTAA G…5’
2 HindIII 5’…A↓AGCTT…3’
3’…TTCGA↑A…5’
5’…A AGCTT…3’
3’…TTCGA A…5’
3 PstI 5’…CTGCA↓G…3’
3’…G↑ACGTC…5’
5’…CTGCA G…3’
3’…G ACGTC…5’
4 HpaI 5’…GTT↓AAC…3’
3’…CAA↑TTG…5’
5’…GTT AAC…3’
3’…CAA TTG…5’
5 HpaII 5’…C↓CGG…3’
3’…GGC↑C…5’

5’…C CGG…3’
3’…GGC C…5’
6 HaeIII 5’…GG↓CC…3’ 5’…GG CC…3’
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
6
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
3’…CC↑GG…5’ 3’…CC GG…5’
7 BamHI 5’…GGATCC…3’
3’…CCAT↑GG…5’
5’…G GATCC…3’
3’…CCAT GG…5’
8 BglII 5’…A↓GATCT…3’
3’…TCTAG↑A…5’
5’…A GATCT…3’
3’…TCTAG A…5’
9 SmaI 5’…CCC↓GGG…3’
3’…GGG↑CCC…5’
5’…CCC GGG…3’
3’…GGG CCC…5’
10 XmaI 5’…C↓CCGGG…3’
3’…GGGCC↑C…5’
5’…C CCGGG…3’
3’…GGGCC C…3’
Một số enzyme có thể cắt tốt ở trình tự này nhưng lại cắt ít hữu hiệu ở
trình tự khác. Thí dụ enzyme EcoRI cắt ở nơi có trình tự AATT không tốt
bằng ở những nơi có trình tự GAATTC.
3.2 Các kiểu cắt của RE
Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa

palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả
năng tự kết hợp trở lại.
Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo
ra hai đầu lệch nhau một vài base. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ
sung có thể bị bắt cặp trở lại. Như vậy, khi các DNA khác nguồn nhưng cùng
có chứa trình tự nhận biết đặc hiệu của một RE, sau khi bị cắt sẽ có các đầu
dính bổ sung giống nhau nên các đoạn DNA khác nguồn có thể nối lại để tạo
ra những phân tử lai. Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một phương
pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền.
Vị trí cắt tại liên kết phosphodiester nối giữa các đường deoxyribose
của các nucleotide tạo thành các đoạn có 2 đầu xác định 5’P, 3’OH và có trình
tự tương ứng với mỗi enzyme RE.
Các enzyme hạn chế cắt các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác
nhau (Hình 1).
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
7
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
Hình 1. Hai kiểu cắt của enzyme hạn chế.
(a) tạo ra đầu so le, và (b) tạo ra đầu bằng.
Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: BalI) cắt ở trục đối xứng để tạo ra
các đoạn DNA mang đầu bằng (blunt)
Cũng có trường hợp 2 hoặc nhiều enzyme nhận biết trình tự giống nhau,
nhưng khi cắt sinh ra các đoạn DNA không nhất thiết lúc nào trình tự tận cùng
cũng giống nhau.
Nhiều enzyme có trình tự nhận biết khác nhau nhưng khi cắt lại có thể
tạo ra những đầu tương hợp. Các đoạn này kết gắn với nhau bằng enzyme
ligase sẽ tạo ra phân tử DNA lai.
Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với

đầu 5’ dính (protruding). Một số enzyme hạn chế (ví dụ: PstI) đã tạo ra các
đoạn DNA có đầu 3’ lồi.Ví dụ:
* Restriction endonuclease EcoRI (từ E.coli) có trình tự
Eco RI cắt
5' G-A-A-T-T-C 3' 5' G 5' A-A-T-T-C 3'
3' C-T-T-A-A-G 5' 3' G-T-T-A-A 5' G 5'
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
8
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
Bảng 2: Các enzyme endonuclease hạn chế và những đoạn cắt của chúng
Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn
Bam III G G A T C C
C C T A G G
Bacillus amylolique faciens H
Bgl II A G A T C T
T C T A G A
Bacillus globigi
Hind III A A G C T T
T T C G A A
Haemophilus influenzeae R
d
Eco RII C C T G G
G G A C C
Escherichia coli R245
Hpa I G T T A A C
C A A T T G
Haemophilus parainfluenzea
Hha I G C G C

C G C G
Haemophilus haemolyticus
Taq I T C G A
A G C T
Thermus aquaticus YTI
Vì một enzyme hạn chế chỉ nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số
vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được
cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di
agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các
cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
9
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ
dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự này cũng
phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong
nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng
sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai dùng trong kỹ
thuật tái tổ hợp DNA.
4. Danh pháp
Nguồn gốc enzyme là từ vi khuẩn vì vậy tên enzyme sẽ dựa trên tên của
chủng vi khuẩn chứa nó. Theo quy tắc, các enzyme có tên gọi gồm có 3 chữ
thuộc tên chủng vi khuẩn gốc; Chữ cái đầu (viết hoa) là chữ đầu của tên giống
của vi khuẩn từ đó enzyme được trích li và 2 chữ tiếp theo là thuộc tên loài. 3
chữ này có thể thêm vài ký hiệu chỉ định để phân biệt 2 chủng cùng loài. Có
số la mã tiếp theo để phân biệt các enzyme giới hạn khác nhau mà có nguồn
gốc cùng một chủng vi khuẩn.
Ví dụ

1. EcoRI:
5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'
- E: Giống Escherichia
- Co: Loài Coli
- R: Chủng RY13
- I: Enzyme được tách lần đầu tiên
Một số ví dụ tương tự: PstI là enzyme giới hạn được tách từ
Providencia stuartii; Fnu DI, Fnu Dn và Fnu DHI, là 3 enzyme xuất phát từ
Fusobacterium nucleatum chủng D; Bst DI021 thuộc vi khuẩn Bacillus
stearothermophilus chủng D102; Một số loại khác như E.coRV, BamHI,
HaeIII, Smal, …
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
10
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
5. Phân loại enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn nằm trong một hệ thống bao gồm cả enzyme sửa đổi,
nó không thể nào tồn tại một mình được. Những chủng vi khuẩn, nếu hệ thống
giới hạn sửa đổi có một enzyme sửa đổi không hoạt động được vì lý do nào
đấy, thì chủng đó không thể nào sống nổi. Lý do chỉ vì DNA không được sửa
đổi sẽ bị enzyme giới hạn tương ứng phá huỷ.
Từ khi hệ thống enzyme giới hạn-sửa đổi B và K của Escherichia coli
được xác định tới nay đã có hơn 2500 hệ thống khác được phát hiện.Trong đó
có gần 200 trình tự đặc hiệu hoàn toàn khác nhau được enzyme nhận ra.
Tất cả enzyme này được phân loại khác nhau tuỳ theo thành phần phân
tử, điều kiện cần thiết để hoạt động, kiểu trình tự nucleotit nhận ra và vị trí cắt.
Lúc ban đầu, enzyme được phân chia ra loại I và loại II dựa chủ yếu trên tính
chất phức tạp của enzyme. Enzyme loại I là đa khả năng, mang cả hai chức

năng giới hạn và sửa đổi trong khi enzyme lọai II chỉ mang một trong hai khả
năng giới hạn hoặc sửa đổi. Sau này, các enzyme phức tạp được chia ra thêm
loại III. Đặc điểm của 3 loại enzyme này được tóm tắt trên Bảng 3.
Các enzyme giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III tuy nhiên các
enzyme giới hạn thường dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp, công
nghệ di truyền thuộc kiểu II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Đây là các
nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân
hủy DNA từ hai đầu), nên còn được gọi là enzyme endonuclease. Vì enzyme
loại I và III chiếm tỷ lệ ít và không được sử dụng nhiều, các nét chính enzyme
này sẽ được giới thiệu trước tiên. Enzyme loại II sẽ được trình bày sau cùng
một cách chi tiết hơn.
Bảng 3: Những đặc điểm của enzyme giới hạn của ba loại hệ thống
giới hạn-sửa đổi (theo bảng của Lewin, p. 508)
ĐẶC ĐIỂM ENZYME LOẠI
I
ENZYME LOẠI
II
ENZYME LOẠI
III
Cấu trúc Enzyme đa năng Enzyme đa năng Enzyme chỉ mang
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
11
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
protein có 3 đơn vị phân
tử
có 2 đơn vị phân
tử
một đơn vị chức

năng hoặc giới hạn
hoặc sửa đổi.
Vị trí nhận
biết
Tạo thành 2 trình
tự không đối xứng
5-7 bp trình tự
không đối xứng
Trình tự gồm 4-6
bp, và đa số trình tự
không đối xứng
Vị trí cắt Không đặc hiệu
Cách xa vị trí
nhận 1000 bp
Cắt phía 3' cách vị
trí nhận 24 -26 bp
Ngay trong hoặc sát
vị trí nhận
Phản ứng:
Endonuclease
Methylase
Một trong 2 phản
ứng có khả năng
xảy ra
Cùng lúc Phản ứng tách rời
5.1. Enzyme loại I
Enzyme loại I tuy đã được phát hiện đầu tiên nhưng chiếm tỷ lệ không
lớn. Enzyme này chia làm 3 họ, mỗi họ có một nhóm gen liên quan đến nhau.
EcoK và EcoB là những enzyme được tìm thấy lần đầu tiên và lại là đại
diện của một họ. Hai hệ thống này đã được nghiên cứu nhiều vì thế chúng góp

phần vào sự hiểu biết về các enzyme loại I. Enzyme này là một tổ hợp 3 loại
đơn vị. Điều đó giải thích tại sao mỗi enzyme loại I mang cả hai chức năng
giới hạn và sửa đổi. EcoK có 3 đơn vị chức năng: đơn vị R dùng để tiến hành
phản ứng giới hạn còn đơn vị M dùng để tiến hành phản ứng thay đổi và đơn
vị s là để nhận ra vị trí đích trên DNA. Sau khi một vị trí đích trên DNA được
đơn vị S nhận ra, có thể xảy ra một trong hai phản ứng là giới hạn hoặc sửa
đổi. Đơn vị M và S có khả năng tạo một kết hợp tỷ lệ 1:1 để tiến hành phản
ứng sửa đổi một cách độc lập.
Vị trí nhận ra của enzyme loại I có 2 trình tự đặc hiệu gồm 3 bp và 4 bp
cách xa nhau vài nucleotit. Ví dụ, vị trí của Eco B và Eco K là
TGA(N8)TGCT/ AGCA(N8)TCA. Hai trình tự đặc hiệu của vị trí nhận ra
không đối xứng nhưng vẫn đều được methyl hoá trên 2 chuỗi đối diện.
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
12
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
Việc DNA bị cắt đi hoặc sửa đổi là do trạng thái của vị trí đích. Nếu vị
trí đích được sửa đổi toàn bộ thì enzyme bám vào vị trí đó nhưng sẽ không tác
động gì cả và sẽ lại rời vị trí đích ra. Nếu vị trí chỉ được sửa đổi một nửa ở
một trong hai chuỗi DNA, thì đơn vị enzyme mang chức năng sửa đổi sẽ can
thiệp để cho hai chuỗi DNA của vị trí nhận đều được methyl hoá. Và nếu vị trí
đích hoàn toàn không được sửa đổi, thì sự tiếp xúc của enzyme với vị trí đích
sẽ dẫn đến phản ứng cắt do enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn loại I cắt DNA
ở các vị trí không đặc hiệu cách xa vị trí nhận hơn 1000 bp. Vị trí cắt không
xảy ra hoàn toàn ngẫu nhiên vì người ta đã quan sát có vùng DNA bị cắt trước
tiên.
Một đặc điểm đáng để ý là sau mỗi lần enzyme đã bám vào DNA để
thực hiện phản ứng cắt, thì nó sẽ không bao giờ tách khỏi DNA nữa có nghĩa
rằng nó không thể tiếp tục tham gia vào một phản ứng khác được.

Về mặt di truyền, mỗi đơn vị của enzyme được mã do một gen: hrsS mã
cho đơn vị nhận ra trình tự đặc hiệu, hrsR mã cho dơn vị dùng để tiến hành
phản ứng giới hạn và hrsM mã cho đơn vị tiến hành phản ứng sửa đổi. Khi
hrsR bị đột biến, vi khuẩn mang phenotyp r
-
m
+
tức là tế bào còn có chức năng
sửa đổi nhưng mất chức năng giới hạn DNA. Khi hrsS bị đột biến, phenotyp
trở nên r
-
m
+
và vi khuẩn mất cả hai chức năng giới hạn và sửa đổi. Và khi
hrsR bị đột biến thì sự kiện này không bao giờ dẫn đến phenotyp r
-
m
+
vì
phenotyp này dẫn đến sự chết của tế bào do hậu quả enzyme giới hạn phá huỷ
DNA genom không được sửa đổi. Tuy nhiên, các trường hợp gen hrsR bị đột
biến vẫn xẩy ra trong thực tế nhưng phenotyp sẽ là r
-
m
-
. Những gen của các
đơn vị của enzyme loại I đều có cùng một hướng trên DNA. Lúc nào hrsM
cũng đứng trước hrsS trên cùng một operon tách khỏi gen hrsR và vị trí của
gen hrsR là trước hoặc sau nhóm hai gen kia.
5.2. Enzyme loại III

Enzyme loại III lại tương đối hiếm chỉ gồm có 4 thành viên là Eco P1,
EcoP 15, Hinf III và Sty LTI. Giống như enzyme loại I, enzyme loại III có đa
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
13
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
chức năng nhưng gồm hai loại đơn vị thôi: đơn vị R dùng để tiến hành phản
ứng giới hạn còn đơn vị MS có vai trò vừa sửa đổi vừa nhận ra. Khi enzyme
đã bám vào một vị trí đích, thì hai phản ứng giới hạn và sửa đổi sẽ cạnh tranh
để xảy ra. Vị trí cắt cách xa vị trí nhận là 24-26 bp. Vị trí đích của P1 và P15
là đoạn kép AGACC/GGTCT. Vói trình tự không đối xứng này chỉ một trong
hai chuỗi DNA kép mới có thể A-methyl hoá. Như thế vị trí đích lúc nào cũng
ở hình thức sửa đổi một nửa. Đây là một đặc điểm lạ của enzyme loại III vì
khi DNA được sao chép thì sẽ sinh ra hai loại phân tử DNA con: DNA chứa
một chuỗi DNA methyl hoá của phân tử mẹ và DNA hoàn toàn không methyl
hoá. Quan sát này dẫn đến câu hỏi tại sao DNA kép con không methyl hoá
tránh được hiện tượng giới hạn. Sự thực, endonuclease loại III hoạt động đòi
hỏi phải 2 vị trị đích có mặt cùng lúc trên DNA và trình tự của chúng bắt buộc
phải có xu hướng ngược chiều nhau. Trong khi methylase chỉ cần nhận một vị
trí đích thôi để tiến hành phản ứng, thì endonuclease bắt buộc phải nhận hai vị
trí đích ngược chiều nhau. Chỉ khi nào hai vị trí ngược chiều nhau này đều
không được methyl hoá thì phản ứng giới hạn có thể xảy ra. Người ta đã hiểu
được vấn đề này sau khi nhận xét kết quả giới hạn của enzyme Eco P15 trên
DNA phagơ T3 và DNA phagơ T7. DNA phagơ T3, rõ ràng bị giới hạn được
trong khi DNA phagơ 17 không bao bị giới hạn mặc dù T7 và T3 đều cùng
một gia đình cả và DNA T7 có đến 36 vị trí đích. Thế nhưng cả 36 vị trí này
đều cùng một chiều thành ra enzyme không hoạt động được vì thiếu một vị trí
ngược chiều.
Có hai gen cấu trúc tạo thành nền di truyền cho các enzyme loại III: gen

33333res có tính chất cố định cao, còn gen mod có cả vùng cố đinh lẫn vùng
thay đổi. Sản phẩm hai gen này giống sản phẩm của hsdS và hsdM của
enzyme loại I.
5.3. Enzyme loại II
Các enzyme loại II được gặp nhiều nhất và có tính chất đơn giản hơn.
Chức năng giới hạn và sửa đổi được riêng biệt ra. Mỗi enzyme của hệ thống
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
14
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
giới hạn-sửa đổi chỉ mang một trong hai chức năng thôi. Enzyme giới hạn loại
II đòi hỏi một chất hỗ trợ duy nhất để hoạt động, đó là Mg
2+
. Chúng cắt DNA
ngay trong hoặc gần vị trí đích nhận ra. Nhờ đặc điểm này, enzyme giới hạn
loại II đã trở thành các công cụ rất cần thiết trong ngành sinh học phân tử. Mặt
khác, trình tự của vị trí đặc hiệu chúng nhận ra và cắt đi có vẻ không bị hạn
chế ở một số loại trình tự thôi. Đến nay, người ta đã phát hiện hơn 2500
enzyme loại II có khả năng nhận ra tổng số trình tự đặc hiệu khác nhau là 200.
Hiện nay, đa số enzyme mới tìm thấy là các isoschizomer của những enzyme
giới hạn đã được biết tức là chúng nhận ra những trình tự đặc hiệu của enzyme
đó. Độ dài các trình tự đặc hiệu được enzyme loại II nhận biết là từ 4 đến 8
nucleotit. Đa số trình tự là đối xứng, có nghĩa 2 trình tự bổ sung nhau đều
giống nhau. Điều này làm cho việc cắt trở nên đơn giản. Enzyme giới hạn loại
II được hình thành với 2 đơn vị phân tử giống nhau vì vậy sự liên kết này cho
phép tiến hành cắt cùng lúc cả hai chuỗi DNA.
Gen cấu trúc của hơn 50 enzyme loại II đã được xác định trình tự
nucleotit. Protein enzyme giới hạn loaị II có thể chứa từ 157 đến 576 aa, trung
bình là 300 aa. Một điều lạ được nhận xét là khi đối chiếu các trình tự

nucleotit của những gen enzyme giới hạn phân tích, thì không phát hiện một
đoạn trình tự giống nhau nào cả, trừ một số trường họp ngoại lệ rất hiếm. Kể
cả với isoschizomer mà nhận ra cùng một trình tự đặc hiệu cũng không quan
sát được các vùng DNA giống nhau trên những gen giới hạn tương tự. Như
thế, nhóm enzyme giới hạn này, tuy có chức năng giống nhau, nhưng là vô
cùng đa dạng. Nhận xét đó làm cho người ta kết luận rằng enzyme loại II
không phải xuất phát từ một phân tử tổ tiên và sự tiến hoá của chúng không
phải là do đột biến ở những vùng gen liên quan với chức năng nhận biết của
enzyme .
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
15
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả cắt của RE
6.1. Độ tinh sạch của DNA
Hiệu quả phản ứng cắt giới hạn DNA phụ thuộc rất lớn vào độ tinh sạch
của DNA. Các tạp chất tìm thấy khi chiết xuất DNA như protein, phenol,
chloroform, ethanol, EDTA, SDS và nồng độ muối cao khác, có thể sẽ ức chế
hoạt tính của enzyme. Để khắc phục hiệu quả cắt thấp do tạp chất gây ra thì
nên tăng hàm lượng enzyme lên từ 10 đến 20 unit cho 1µg DNA. Có thể tăng
dung tích phản ứng để làm loãng nồng độ các tạp chất ức chế hoặc kéo dài
thời gian ủ. Phương pháp tách chiết nhanh (miniprep) thường lẫn nhiều tạp
chất và cả DNase. Vì DNase yêu cầu Mg
2+
hoạt động nên nếu DNA sau khi
chiết tách được bảo quản trong dung dịch chứa EDTA sẽ ổn định hơn, nhưng
lại dễ bị phân rã nhanh chóng trong môi trường dung dịch phân cắt enzyme.
Tốt nhất là nên tinh chế lại DNA nếu thấy còn lẫn quá nhiều tạp chất. Muốn
phân cắt DNA tốt thì nên thêm chất polycation spermidine (nồng độ làm việc

từ 1,0 - 2,5mM). Tuy nhiên vì spermidine làm kết tủa DNA ở 4
0
C cho nên chỉ
thêm chất này vào sau khi đã thêm các thành phần phản ứng khác đã được ủ ở
nhiệt độ thích hợp trong vài phút. Cuối cùng các phương pháp tách chiết DNA
đều phải tinh chế lại bằng phenol, chloroform và kết tủa bằng ethanol trước
khi đem phân giải enzyme.
6.2. Mức độ methyl hóa của DNA
Một số enzyme cắt giới hạn bị ức chế hoạt tính cắt do đoạn nhận biết có
những nucleotide bị methyl hóa.
Chủng vi khuẩn E.coli nào chứa một trong 2 trình tự bazơ sau bị methyl
hóa, được gọi là vi khuẩn dam nếu có vị trí Adenin trong trình tự GATC bị
methyl hóa và gọi là dam nếu có chứa cytosine ở giữa trình tự CC(A/T)GG bị
methyl hoá.
Vì thế DNA của những plasmid được chiết xuất từ 2 chủng E.coli này
thường có thể bị cắt một phần hoặc không bị cắt bởi những enzyme cắt giới
hạn có đoạn nhận biết giống với một trong 2 trình tự trên. Để tránh điều này
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
16
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
xảy ra, trong kỹ thuật nhân dòng gen, người ta khuyên nên chỉ chiết tách và
dùng DNA của plasmid từ những chủng vi khuẩn E.coli không có chỗ nào bị
methyl hóa.
DNA động vật có vú hiếm khi chứa 5’-cytosine bị methyl hóa, ngược
lại chúng thường có 5’- Guanine bị methyl hóa. Mức độ methyl hóa biến động
từ vị trí này đến vị trí khác, đặc biệt theo loại tế bào từ đó DNA được chiết
xuất ra.
Mức độ methyl hóa trong DNA genome sinh vật bậc cao có thể được

nghiên cứu bằng cách sử dụng những đồng enzyme (isoschizomer), có khả
năng mẫn cảm với methyl hóa khác nhau. Thí dụ enzyme MspI cắt đoạn
CCGG cả khi Cytosine ở giữa bị methyl hoá, trong khi đó enzyme HpaII cũng
cắt đoạn CCGG nhưng lại rất mẫn cảm nếu cytosine này bị methyl hóa.
Hiện tượng methyl hóa ngăn cản hoạt tính enzyme cắt giới hạn nhiều
khi lại có lợi vì nếu những trình tự nhận biết men methylase nằm gần với trình
tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn nào đó thì có thể sẽ ức chế hoạt động cắt
tại vị trí này, vì thế sẽ làm đảo lộn tính đặc thù trình tự cắt hiển nhiên của
enzyme.
Trong trường hợp muốn sử dụng đoạn kết gắn linker nhằm biến đổi
trình tự các đầu của 1 đoạn DNA, khi đó lại cần phải bảo vệ bằng được những
vị trí cắt của enzyme hạn chế ở bên trong, bằng cách tiến hành methyl hóa
trước khi tiến hành dùng enzyme cắt thành các đoạn sau đó kết gắn với linker.
Bảng 4. Điều kiện phản ứng của một số RE
Loài VSV sinh ra Tên RE Nồng độ T
o
hoạt
động
T
o
bất
hoạt
Haemophilus aegytius HaeIII M 37 90
Thermus aquaticus TaqI H 65 90
Haemophilus haemolyticus HhaI M 37 90
Desulfovibrio desulfuricans DdeI H 37 70
Moraxella bovis MboII L 37 65
Escherichia coli EcoRV H 37 100
EcoRI H 37 70
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh

Học K22
17
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
Providencia stuarti PstI H 37 70
Microcoleus MstII H 37
Nocardia otitidis caviarum NotI 37 100
Chú thích: nồng độ muối: NaCl hoặc KCl, L≤50mM, M: từ 50-100mM,
H≥100mM
Hệ thống dung dịch đệm thường gồm một dung dịch chính pha trộn với
các nồng độ NaCl, pH rồi thêm các ion đặc thù khác nhau.
Ngoài ra nhiều phòng thí nghiệm còn sử dụng dung dịch đệm tự pha chế
trên cơ sở dùng potassium glutamate và potassium acetate để phân giải DNA.
Đặc điểm chính của những dung dịch đệm này là chúng chứa potassium
glutamate hoặc potassium acetate thay thế NaCl và dùng Tris-acetate thay thế
Tris-Cl. Hầu hết các enzyme giới hạn đều hoạt động tốt trong những dung
dịch đệm này, chỉ trừ khoảng 20% số enzyme chỉ hoạt động tốt trong dung
dịch đệm tối ưu.
Tính phổ biến của dung dịch đệm rất có lợi khi cần phân cắt DNA với
nhiều enzyme, điều này sẽ đỡ gây lãng phí hơn cho nhà nghiên cứu.
Trong quá trình sử dụng enzyme phân giải phải luôn cẩn thận bỏ vào đá
và luôn bảo quản ở nhiệt độ -20 và tuyệt đối không được làm lẫn tạp đặc biệt
với DNA plasmid, với các enzyme khác hay DNase I.
Có một số enzyme khá đắt một số khác thì rẻ hơn, tuy nhiên enzyme đắt
thường lại có chất lượng thấp.
6.3. Đặc tính methyl hóa của RE
Là khả năng của enzyme xúc tác quá trình gắn các gốc CH3 vào vị trí
các bazơ adenine hoặc cytosine trong nội tại trình tự nhận biết đặc thù. Như
enzyme EcoRI có khả năng methyl hóa các bazơ adenine trong nội tại vùng
nhận biết của enzyme này. Nhờ vậy đã ngăn cản không cho chính enzyme đó

cắt tại vị trí đó.
7. Ứng dụng của RE
Quá trình cắt như vậy được sử dụng cho nhiều mục đích nghiên cứu
khác nhau:
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
18
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
- Dùng để thiết lập bản đồ cắt giới hạn của DNA plasmid hoặc dòng
thực khuẩn thể. Bản đồ cắt giới hạn là vị trí cắt của mỗi RE trên phân tử
DNA, nhóm liên kết hay cả bộ genome.
- Phân cắt tạo ra các đoạn nhỏ từ DNA genome trước khi phân tách
bằng điện di và tiến hành lai DNA, dùng trong phương pháp RFLP.
- Tạo ra các đoạn để nhân dòng trong vector thích hợp.
- Tạo ra các đoạn DNA mẫu dò để đánh dấu, sử dụng trong phương
pháp lai DNA.
II. CÁC ENZYME BIẾN ĐỔI
1. Enzyme polymerase
1.1 DNA polymerase
1.1.1. Khái niệm
Xúc tác quá trình tổng hợp mạch đơn DNA theo chiều từ đầu 5'-3'. Phần
lớn các enzyme DNA polymerase đều sử dụng một mạch đơn làm khuôn như
DNA polymerase I, T4 DNA polymerase và Taq DNA polymerase. Có 3 loại
DNA polymerase khác nhau được chiết từ vi khuẩn E.coli là pol. I, Pol. II và
Pol. III. trong đó Pol. III đóng vai trò chình trong tái bản của vi khuẩn còn 2
enzyme Pol. I và pol .II có chức năng sửa chữa.
Có một enzyme DNA polymerase đặc biệt có chức năng phiên mã
ngược có tên là reverse transcriptase, là loại enzyme DNA polymerase phụ
thuộc vào RNA (RNA-depentdent RNA polymerase) enzyme này sử dụng

mạch khuôn là RNA (thường là mRNA) để tổng hợp lên DNA. Enzyme này
có nguồn gốc từ retrovirus, dùng RNA của virus làm khuôn để tổng hợp lên
DNA copy virus.
Một loại DNA polymerase nữa không tổng hợp mạch mới từ khuôn mà
chỉ thêm một đoạn các nu đồng nhất như poly A vào đầu tận cùng của phân tử
DNA thứ nhất, đó là enzyme terminal transferase. Enzyme này sau đó lại sử
dụng để đính poly T vào phân tử DNA thứ 2. Sau đó 2 phân tử DNA được kết
gắn với nhau qua 2 đầu bổ sung sẽ đính kết lại (ligation) rồi được nhân dòng
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
19
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
lên, quá trình này sử dụng trong tạo vector tái tổ hợp từ 2 đoạn DNA khác
nhau.
Template-independent DNA polymerase là một dạng enzyme terminal
transferase, thêm từng nu vào đầu 3’ của một đoạn mồi đơn DNA, kéo dài
thành một sợi đơn DNA dài.
1.1.2. Đặc tính của DNA polymerase
DNA polymerase muốn hoạt động được thì cần phải có một đoạn mồi
(primer). Mồi có thể là đoạn mạch đơn DNA hay RNA ngắn, bắt cặp bổ sung
với phần đoạn đầu của mạch khuôn để từ đó các polymerase mới kéo dài thêm
từng nu một gắn vào đầu 3’OH.
Tất cả các DNA polymerase đều thêm deoxynucleotit vào nhóm OH tận
cùng đầu 3’ của phân tử DNA mạch đơn ngắn, hoạt tính trùng phân xẩy ra
luôn theo hướng 5’-3’ của DNA polymerase. Mỗi một nu được gắn vào mạch
mới đối xứng với nu của mạch đối diện (mạch khuôn), theo nguyên tác dA
ghép cặp với dT, dC ghép cặp với dG. Phản ứng yêu cầu 4dNTP và ion Mg
2+
.

Rất nhiều enzyme DNA polymerase có thêm đặc tính phân rã 3’-5’.
Đặc điểm của hoạt tính này là cắt bỏ từng nucleotide và giải phóng ra 1
nucleotide có đầu 5’ mang một gốc phosphate (NMP). Trong điều kiện không
có dNTPs, hoạt tính này sẽ xúc tác phân rã từng nấc phân tử DNA, từ đầu 3’
có nhóm OH tự do, ở cả sợi đơn và sợi kép DNA. Khi có mặt dư thừa
dNTPs, hoạt tính exonuclease đối với sợi đôi DNA bị ức chế bởi hoạt tính
trùng phân của polymerase. Trong quá trình tổng hợp, hoạt tính exonuclease
có vai trò sửa chữa sai sót bằng cách cắt bỏ những nu ghép nhầm vào mạch
trong quá trình trùng phân.
Một số enzyme DNA polymerase như E.coli DNA polymerase I còn có
thêm hoạt tính 5’-3’ exonuclease. Hoạt tính này phân rã sợi DNA kép từ đầu
5’, nó cắt bỏ từ một đến vài nucleotide và có thể giải phóng ra một đoạn dài
tới 10 nu. Đặc tính này gíup enzyme bắt đầu tổng hợp lại các khía trong chuỗi
phân tử DNA kép. Hoạt tính phân rã DNA 5’-3’ exonuclease xảy ra cho phép
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
20
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
bắt đầu quá trình trùng phân từ những khía cắt (nick) trên phân tử DNA. Theo
Kelly et al. (1970) nếu phản ứng phân rã xẩy ra trước tổng hợp sẽ dẫn đến làm
chuyển vị những vị trí nick. Phản ứng phân rã này được sử dụng để đánh dấu
đồng nhất phân tử DNA sợi kép.
Hoạt tính 5’-3’ exonuclease của enzyme E.coli DNA polymerase I nằm
ở đầu amin của enzyme, đầu này có thể bị cắt bỏ bởi enzyme protease hoặc
bằng cách gây đột biến đứt đoạn phần tương ứng của gen, nếu tạo ra enzyme
DNA polymerase vẫn duy trì được hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease được gọi là
enzyme đoạn lớn E.coli DNA polymerase I hay Klenow fragment.
Một đặc tính quan trọng khác của các DNA polymerase là tính liên tục
của chúng. Tính liên tục là khả năng của một phân tử trùng phân gắn các nu

một cách liên tục vào mồi mà không cần tách rời khỏi khuôn- mồi. Hầu hết
các DNA polymerase như E.coli DNA polymerase I, Klenow fragment, T4
DNA polymerase có tính liên tục thấp, chúng thường tách rời khỏi mồi khuôn
sau khi ghép vào mạch dưới 10 nu. Ngược lại T7 DNA polymerase lại có tính
liên tục cao, nó có thể gắn hàng ngàn nu bắt đầu từ mồi mà không phải rời ra
khỏi mồi-khuôn. Đặc tính này rất tốt khi muốn tổng hợp một sợi DNA dài.
1.1.3. Enzyme polymerase
1.1.3.1. DNA polymerase I
Do Lehman phát hiện vào năm 1981, là sản phẩm của gen E. coli pol A,
gen này đã được nhân dòng trong thực khuẩn thể lamda, và được kích hoạt
mạnh bởi nhiệt độ. Enzyme có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn có khối
lượng phân tử 109.000 Da. Là enzyme có cả 2 đặc tính exonuclease 3’-5’ và
5’-3’, nhưng hoạt tính exonuclease 3’-5’ của nó so với T4 và T7 polymerase
thì yếu hơn nhiều.
Enzyme E. coli DNA polymerase I Knenow Fragment (Klenow
Fragment of E. DNA polymerase I) có khối lượng phân tử 76.000 Da, chứa
trình tự đầu C và được cắt bỏ 323 axit amin từ đầu amin, chỉ còn lại 70%
chuỗi peptide của enzyme E.coli DNA polymerase I. Enzyme này duy trì
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
21
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
được đặc tính trùng phân và hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease của E.coli
polymerase I, nhưng không có đặc tính 5’ – 3’ exonuclease.
1.1.3.2. T4 DNA polymerase
Là enzyme được mã hóa bởi coliphage T4, là sản phẩm của gen 43 của
bacteriophage T4. Nó không những được chiết xuất từ tế bào E.coli bị phage
xâm nhiễm hoặc được sản xuất từ gen 43 nhân dòng. Enzyme T4 DNA
polymerase là một chuỗi polypeptide đơn có khối lượng phân tử 12000 Da.

Ngoài hoạt tính tổng hợp DNA ra nó còn có hoạt tính phân rã theo hướng 3’-
5’ cả sợi đơn và sợi kép DNA. Enzyme này không có hoạt tính phân rã đầu 5’-
3’. T4 DNA polymerase có tính liên tục thấp, tuy nhiên khi có mặt một số
protein phụ của T4 thì nó trở lên có tính liên tục cao. Enzyme này được sản
xuất từ một nhân dòng (clone). có biểu hiện cao của gen. Nếu DNA được ủ
với T4 DNA polymerae trong điều kiện không có dNTP thì DNA sẽ bị phân rã
từng phần bởi đặc tính exonuclease. Khi có mặt 4 dNTP cho vào, thì mạch bị
phân rã sẽ được tổng hợp trở lại bởi đặc tính trùng phân polymerase. Vì vậy
nếu gốc α-phosphate của những nu thêm vào được đánh dấu phóng xạ
32
P ta
sẽ thu được một sản phẩm được đánh dấu phóng xạ cao, kỹ thuật này thay thế
cho phương pháp nick translation.
1.1.3.3. Native T7 DNA polymerase
Enzyme này do Tabor et al phát hiện vào năm 1987, được tinh lọc từ vi
khuẩn E.coli nhiễm bacteriophage T7, nó là một phức hợp gồm 2 protein với tỉ
lệ 1:1, một protein do gen 5 của T7 mã hoá, có khối lượng phân tử 80.000 Da
và một protein khác do một gen của E.coli mã hóa là thioredoxin, có khối
lượng phân tử 12.000 Da.
Cả 2 protein được sản xuất trong E.coli từ những gen được nhân dòng
trong plasmid vector.
Protein do gen 5 của T7 sản sinh, được tinh khiết có hoạt tính phân rã
3’-5’ exonuclease và không có hoạt tính liên tục trùng phân DNA.
Thioredoxin có vai trò như là môt protein phụ làm tăng ái lực của protein gen
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
22
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
5 T7 gắn chặt vào khuôn mồi, giúp quá trình tổng hợp DNA kéo dài được tới

hàng ngàn nu. Tính liên tục cao của phức hợp protein gen 5 T7 với protein
thioredoxin (T7 DNA polymerase) đã khắc phục được đặc tính liên tục thấp
của enzyme E.coli DNA polymerase I, Klenow fragment và T4 DNA
polymerase.
T7 DNA polymerase có hoạt tính phân rã 3’-5’ exonuclease cao đối với
cả sợi DNA đơn và kép. Vì thế nó không được dùng trong phân tích trình tự
DNA.
Hiện có thêm một số T7 DNA polymerase được biến đổi, nó khác là có
hoạt tính phân rã 3’-5’ exonuclease rất yếu do enzyme này mất 28 axit amin
trong vùng tạo hoạt tính exonuclease, nhưng ngược lại làm tăng hoạt tính tổng
hợp lên từ 3-9 lần.
Ứng dụng enzyme này khi cần tổng hợp những đọan DNA dài.
1.1.3.4. Taq polymerase
Taq polymerase đầu tiên được Lawyer et al phân tách vào năm 1989, từ
một loài vi khuẩn sống ở suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus.
Enzyme này chịu trách nhiệm tổng hợp cả 2 sợi đơn DNA, có khối lượng phân
tử 94kDa, hoạt động tối ưu trong phạm vi nhiệt độ từ 75-80
0
C, và không có
hoạt tính phân rã 3’-5’ exonuclease.
Enzyme cấu tạo gồm một chuỗi polypeptide đơn với số lượng thay đổi
và có hoạt tính liên tục cao.
Do Taq polymerase hoạt động mạnh trong phạm vi nhiệt độ rộng và có
nhiệt độ trùng phân tương đối cao. Điều này rất có lợi khi sử dụng chúng trong
phản ứng chuỗi trùng phân. Nhiệt độ cao đã cho phép quá trình ghép cặp giữa
mồi với nguyên bản được đặc thù hơn, vì thế sẽ làm tăng được hiệu quả, tính
đặc thù và tính nhạy cảm của phương pháp PCR.
Enzyme giữ được hoạt tính qua nhiều chu kỳ lặp lại từ nhiệt độ tiếp cặp
mồi đến nhiệt độ tách sợi đơn trong PCR, điều này đã giúp chúng ta chỉ cần
nạp enzyme một lần vào phản ứng trước khi chạy các chu kỳ tiếp theo.

Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
23
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
Taq polymerase có hiệu suất trùng phân và tính liên tục cao, do vậy có
khả năng sử dụng được cả các dNTP tương đồng, điều này cho phép nó là một
enzyme tuyệt vời dùng để xác định trình tự DNA. Nhờ đặc tính ưu việt của
Taq polymerse đã cho phép xác định được trình tự nu trên khuôn nguyên bản.
Điều này có thể làm ức chế quá trình tạo cấu trúc bậc hai của sợi DNA thường
hình thành ở nhiệt độ thấp.
1.1.3.5. Enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase)
Là enzyme tổng hợp DNA trên cơ sở lấy RNA làm khuôn, RNA-
Dependent DNA polymerase.
Enzyme này do các retrovirut sinh ra nhằm sao chép bộ gen RNA của
chúng trong tế bào ký chủ, ví dụ như virut avion myoblastosis (AMV) và
Moloney murineleukemia virus (MMLV).
Enzyme AMV được li trích từ virus AMV phân lập, trong khi đó
enzyme sao chép ngược MMLV lại được li trích từ tế bào vi khuẩn E.coli có
chứa gen nhân dòng.
Các virus này đã sử dụng chính enzyme của mình tạo ra để tổng hợp lên
một mạch DNA bổ sung (cDNA-complementary DNA) từ khuôn RNA của
virus theo chiều từ 5’-3’, khi có mặt của mồi.
Enzyme sao chép ngược AMP và MMLV là enzyme đa chức năng,
nhưng chúng được dùng chủ yếu trong phản ứng trùng phân tạo DNA trực tiếp
từ RNA. Đặc biệt nó được sử dụng khi người ta dùng đọan oligo (dT) hoặc
một tập hợp các đoạn DNA đơn ngẫu nhiên hay một trình tự DNA đơn đặc thù
nào đó, để làm mồi tổng hợp ra cDNA từ khuôn mRNA.
Hoạt tính nữa của enzyme này là khả năng trùng phân tạo ra phân tử
DNA trực tiếp từ khuôn DNA. Quá trình kết gắn dNTP vào mạch do enzyme

này xúc tác rất chậm khoảng 5nu/giây, chậm hơn 100 lần tốc độ kết gắn do
enzyme T7 DNA polymerase, đồng thời enzyme này không có hoạt tính phân
rã 3’-5’ exonuclease.
- Ứng dụng
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
24
Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS.
Nguyễn Bá Lộc
+ Tổng hợp cDNA từ mRNA để nhân dòng tạo thư viện cDNA, khi đó
người ta thường dùng 2 loại mồi là oligo (dT) cho mRNA và những đoạn
oligodeoxynucleotide ngẫu nhiên cho RNA virus. Trường hợp thứ 2 các mồi
sẽ ngắn ngẫu nhiên trên các vị trí khác nhau của các RNA và kết quả sẽ tạo ra
các cDNA khác nhau.
+ Để lấp đầy đầu 3’ của những đoạn DNA có đầu 5’ nhô ra, vì enzyme
này không có hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease.
+ Dùng trong xác định trình tự DNA, vì do enzyme này không có hoạt
tính 3’ – 5’ exonuclease nên có thể tổng hợp đi qua những vùng mà enzyme
Klenow fragment không tiến hành vượt qua được.
1.1.3.6. Enzyme terminal deoxynucleotide transferase)
Enzyme được li trích từ tuyến ức của bê, xúc tác việc kết gắn những
deoxynucleotit vào đầu 3’OH của sợi DNA đơn một cách ngẫu nhiên, đồng
thời giải phóng ra gốc phosphate vô cơ.
Enzyme hoạt động không cần khuôn mà vẫn cho phép từng nu một
nhập vào chuỗi, nhưng yêu cầu môi trường phản ứng phải có mặt của cation
hóa trị 2. Việc hấp thụ các nu nhập vào chuỗi phụ thuộc vào loại cation hóa trị
2. Mồi thường là một sợi DNA đơn, đối với sợi DNA kép thường quá trình
kéo dài có hiệu quả nhất khi đầu của DNA có chứa đầu 3’ nhô ra. Tuy nhiên,
sự có mặt của Co2+ thì enzyme này sẽ bắt đầu kéo dài từ bất kỳ đầu 3’ nào dù
là nhô ra, bằng hay lõm, mặc dù quá trình tổng hợp không có hiệu suất đồng

nhất giữa các đầu này. Sự có mặt của Co2+ làm enzyme trùng phân bị hạn chế
đối với những ribonucleotide.
Bảng 5: Tóm tắt đặc tính của một số DNA polymerase.
Enzyme
3’-5’
exonucle
ase
5’-3’
exonuclea
se
Tốc độ trùng
phân
Tính liên
tục
E.coli DNA
polymerase
Thấp Có Ngay lập tức Thấp
Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh
Học K22
25