CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tách chiết và phân lập, xác định cấu trúc của hai chất là polyphenol và flavonoid có
trong đài hoa bụp giấm.
Xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm trà bụp giấm hịa tan.
Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa và ức chế alfa glucosidase của sản phẩm trà bụp
giấm hòa tan.
2.2 Đối tượng nghiên cứu
Đài hoa bụp giấm tươi mua tại TP. Cần Thơ, phơi khô để sử dụng.
Maltodextrin DE 15-17 mua tại công ty TNHH Phát Triển Khoa Học Vinasing.
Đường Biên Hịa.
2.3 Hóa chất, dung mơi
Các dung môi methanol (MeOH), ethanol (EtOH), n-hexan (Hx), ethyl acetate
(EtOAc), Folin-Ciocalteu, DPPH*, acid ascorbic, acarbose, Na2CO3 10%, H2SO4
10%, Chlorofom được mua của các cơng ty và đạt tiêu chuẩn phân tích. Bản sắc ký
lớp mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 của hãng Merck.

22


2.4 Dụng cụ, trang thiết bị
Bảng 2.1 Một số dụng cụ, trang thiết bị sử dụng trong thực nghiệm
STT

Dụng cụ

Thiết bị

Giấy lọc
1

Quantitative Filter

Cân phân tích Sartorious ED 224S, đợ chính xác

Paper (Φ110mm,

10-4g, lượng cân tối đa 200g

0.35µm)
2

Ống đong 100ml

Tủ sấy dụng cụ Memmert UNB 200
Máy cô quay chân không hiệu EYELA N – 1200A
kèm bếp cách thủy EYELA OSB – 2100 và máy

3

Ống đong 250ml

làm lạnh EYELA CCA – 1111 tại Viện Hàn lâm
Khoa học Vật liệu Ứng dụng, quận 12, TP. Hồ Chí
Minh

4

5

6

7

8

Vial 1.5ml (có sẵn
nắp)
Đầu lọc Syringe
(Φ13mm, 0.45µm)
Erlen 100 ml
Becher 100 ml, 500
ml, 1000 ml
Ống đong 100ml,
250 ml, 1000ml

Đèn UV bước sóng 254 – 365nm tại Viện Hàn lâm
Khoa học Vật liệu Ứng dụng, quận 12, TP. Hồ Chí
Minh
Thiết bị ghi phổ cợng hưởng từ hạt nhân Bruker ở
tần số 500MHz tại phịng Cợng hưởng từ hạt nhân
– Viện hóa học, Hà Nợi
Brix kế
Lị nung
Máy đo quang phổ hấp thụ

9

Nhiệt kế

Máy sấy đông khô Eyela


10

Buret

Máy cô quay chân không STRIKE 102

11

Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại, hiệu SCHOTT

12

Máy xay xát

23


2.5 Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp chiết xuất
Phương pháp chiết xuất dùng để nghiên cứu sơ bộ khi chưa biết thành phần hóa học
của dược liệu. Nghiên cứu sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân
cực mạnh để phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu. Sau mỗi lần chiết với một
loại dung môi ở nhiệt độ thường, làm khô dược liệu rồi tiếp tục chiết với dung môi
tiếp theo. Mỗi phân đoạn chiết, ta cất loại dung môi để thu được cao chiết và tiến
hành phân tích riêng. Để thu hồi dung mơi, sử dụng máy cô quay chân không cho
hiệu suất cao.
2.5.2 Các phương pháp sắc kí
2.5.2.1 Sắc kí bản mỏng [9-10]
Sắc ký bản mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dược liệu vì đơn giản, ít tốn
thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao.

Sắc ký bản mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển
qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa
chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được cố định trên các
phiến kính hoặc kim loại. Pha đợng là mợt hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được
trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển
qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên bản mỏng
theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký
đồ trên bản mỏng.
2.5.2.2 Sắc kí cột
Sắc ký cợt (coloumn chromatography), là phương pháp vơ cùng quan trọng trong q
trình cô lập các chất tự nhiên. Sắc ký cột dùng để tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp
hoặc tinh chế các chất.
Trong đó, pha tĩnh được dùng là silicagel nhồi vào cợt, chất cần phân tích cho vào
phía trên pha tĩnh silicagel, triển khai một cách liên tục bằng nhiều hệ dung môi khác
24


nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh. Việc chọn hệ dung môi phù hợp quyết định
đến kết quả chạy cột, dung môi được chọn dựa vào kết quả sắc ký lớp mỏng. Ngồi
ra, khi lựa chọn cợt cần dựa vào lượng mẫu cần phân tách, sao cho tỉ lệ chất hấp
phụ/chất cần tách từ 25 – 50 và độ cao cột chất hấp phụ/độ cao cột chất cần tách lớn
hơn 8. Với những chất khó tách lượng chất hấp phụ phải lớn hơn.
Đối với phân đoạn chất có màu, theo dõi quá trình sắc ký dựa trên màu sắc, hứng
từng phân đoạn dựa theo màu sắc riêng. Đối với mẫu khơng màu thì tiến hành từng
phân đoạn nhỏ có đánh số và kiểm tra trên sắc ký bảng mỏng.
2.5.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ cộng
hưởng từ hạt nhân (NMR) [9-10]
NMR dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân nguyên tử khi đặt chúng
trong một từ trường. Có nhiều kỹ thuật xác định phổ cợng hưởng từ hạt nhân khác

nhau được áp dụng. Mỗi kỹ thuật dùng để xác định những đặc tính cợng hưởng từ
nhất định của hạt nhân. Tuỳ vào mục đích và mức đợ phức tạp của cấu trúc, người ta
có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định phổ của cùng một
loại hạt nhân (1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR,

13

C-NMR,

DEPT), hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ 2 chiều (COSY,
NOESY, HSQC, HMBC, ...).


Phổ 1H-NMR: cho biết mơi trường hố học của proton trong phân tử. Các proton

có mơi trường hố học khác nhau sẽ có chuyển dịch hoá học khác nhau, thường nằm
trong khoảng 0 – 14 ppm. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng mơi
trường hố học (như 3 proton của nhóm CH3) thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh
này có thể là đỉnh đơn, đơi, ba... tới 7 đỉnh thành phần (đỉnh 7). Diện tích của mỗi
đỉnh tỉ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích đỉnh có thể biết số proton
của đỉnh đó. Một thông số quan trọng khác của phổ proton là hằng số ghép (J) tính
bằng Hz, cho biết tương tác của proton với các proton kế cận.

25




Phổ 13C-NMR: cung các cấp thông tin về môi trường hố học của carbon. Đợ


chuyển dịch của carbon nằm trong khoảng 0 – 240 ppm. Đây là ưu điểm rất lớn của
phổ 13C-NMR vì các tín hiệu phổ sẽ ít bị trùng lặp và đặc trưng đối với mỗi chất. Với
kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với
1 carbon (hơn 1 carbon nếu chúng có chung mơi trường hố học) của phân tử.


DEPT: Một kỹ thuật khác được sử dụng để phân tích phổ

13

C-NMR là phổ

DEPT. Trong kỹ thuật này, phổ kế biến đổi các tín hiệu gửi tới mẫu đo. Khi đó nhận
được 3 phổ đồ bổ sung. Phổ DEPT-135 không cho pic của cacbon bậc 4, nhưng cho
các tín hiệu CH và CH3 ở cùng mợt phía, cịn CH2 ở phía bên kia. Phổ DEPT-90 chỉ
cho các tín hiệu của các CH. Kết hợp phổ 13C-NMR và các phổ DEPT, người nghiên
cứu sẽ có các thơng tin cơ bản về khung carbon của hợp chất.


Phổ HMQC thể hiện tương tác trực tiếp giữa proton và cacbon liên kết với nhau.

Một trục của phổ là phổ 1H-NMR, trục kia là phổ 13C-NMR.


Phổ HMBC thể hiện tương tác xa giữa các proton và cacbon liên kết cách xa

nhau hơn 1 liên kết (phổ biến nhất là tương tác qua 3 liên kết).
Phổ công hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500 MHz, phổ 13CNMR, DEPT, HMBC, HSQC được đo trên máy Bruker 125 MHz (Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam).
2.5.4 Phương pháp tinh chế [9-10]



Kết tinh trong dung mơi: hịa tan bão hịa tinh thể sau phân lập vào mợt

lượng nhỏ dung mơi ở nhiệt đợ nóng, khi làm lạnh hoặc bay hơi dung dịch có hiện
tượng q bão hịa và hợp chất chính kết tinh trong khi tạp chất chưa đạt được nồng
đợ bão hịa vẫn nằm trong trong dung dịch, lọc lấy tinh thể. Kết tinh lại nhiều lần sẽ
thu được hợp chất có đợ tinh khiết theo u cầu.


Lặp lại q trình sắc kí cợt giống như giai đoạn phân lập, lựa chọn phân

đoạn tinh khiết hơn hoặc thay đổi dung môi rửa giải hay tỉ lệ thành phần của dung
môi rửa giải.

26




Tiến hành sắc kí cợt như giai đoạn phân lập, nhưng thay đổi kiểu sắc kí, ví

dụ như giai đoạn phân lập sử dụng sắc kí hấp phụ pha thuận trên silica gel, giai
đoạn tinh chế sử dụng sắc kí phân bố pha đảo hoặc sắc kí thấm qua gel.


Sử dụng sắc ký lỏng điều chế để tinh sạch các hợp chất phân lập được để đạt độ

tinh khiết theo yêu cầu sử dụng làm chất chuẩn phân tích.
2.5.5 Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất

Sắc kí lớp mỏng: TLC được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết dựa vào sự có
mặt của vết duy nhất hoặc vết chính là vết của đối tượng phân tích. Chất càng tinh
khiết khi khơng có vết phụ hoặc vết phụ càng nhỏ [11], [12].
2.5.6 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất [12]
Các hợp chất đối tượng nghiên cứu của đề tài đều là những chất đã biết cấu trúc. Dữ
liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận
dạng chuẩn. Việc nhận dạng chất dựa vào: So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lí, hằng
số vật lí của chất với tài liệu khoa học hoặc thông tin đã công bố. Tập hợp các dữ liệu
chuẩn đó có thể khẳng định được hợp chất là đúng đối tượng nghiên cứu.
Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có: Đo phổ tử ngoại khả
kiến; đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC,
HSQC).
2.5.7 Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH [13]
Nguyên tắc: các chất kháng oxy hóa sẽ trung hịa các gốc DPPH bằng cách cho
hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng
sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Tính kết quả:
% Ức chế gốc tự do = 100 x (ODc – ODm)/ ODc
Trong đó:
ODc: đợ hấp thụ quang học của chứng âm.
27


ODm: độ hấp thụ quang học của mẫu thử.
Vẽ đồ thị tương quan giữa nồng độ mẫu thử và % ức chế gốc tự do DPPH. Tính IC50
của mẫu thử và chứng dương là vitamin C. So sánh giá trị IC50 của mẫu thử và chứng
dương để đưa ra kết luận. Giá trị IC50 càng thấp chứng tỏ hoạt tính kháng oxy hóa
càng mạnh.
2.5.8 Phương pháp sấy thăng hoa [14]
Khái niệm: là q trình làm khơ vật liệu ở nhiệt độ thấp (T<0C), áp suất thấp (P<4

mmHg), vật liệu trước khi sấy được tiến hành cấp đông sao cho tâm vật liệu sấy có
nhiệt đợ (T<0C) để nước bên trong vật liệu sấy hoàn toàn ở trạng thái rắn (nước đá),
khi cấp nhiệt bằng phương pháp tiếp xúc hoặc bức xạ thì nước bên trong vật liệu
thăng hoa từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi đồng thời trên toàn bợ thể tích vật liệu
sấy nên sản phẩm sấy có cấu trúc xốp, ít bị co rút biến dạng, nhiệt đợ cuối q trình
sấy thấp nên sản phẩm sấy ít bị biến tính giữ được chất lượng dinh dưỡng và giá trị
cảm quan.
Nguyên tắc: sự biến đổi trạng thái hơi nước có hai trường hợp: lỏng – hơi và rắn –
hơi có thể trình bày theo giản đồ:

Hình 2.1 Giản đồ trạng thái của nước
28


Sự biến đổi trạng thái hơi nước trong giản đồ áp suất hơi bão hồ P và nhiệt đợ T.
Giao điểm của các đường cong biên đươc gọi là điểm ba. Với các giá trị của thơng số
điểm ba, có khả năng tồn tại cả ba pha (nước đá – nước lỏng – hơi nước). Trạng thái
đó trong nhiệt đợng lực học được gọi là trạng thái cơ bản biểu diễn trên giản đồ P –
T bằng điểm ba thể. Dưới điểm ba thể khơng thể có pha lỏng bền vững và nước sẽ ở
trạng thái rắn (nước đá) hoặc ở trạng thái hơi. Nói cách khác, với áp suất thấp, trở
kháng của môi trường xung quanh nhỏ đến mức để mạng tinh thể nước đá dễ dàng bị
phân rã và lập tức nó chuyển thành trạng thái hơi. Trên đường cong nước đá – hơi,
hệ thức giữa áp suất và nhiệt độ phải tương ứng với trạng thái cân bằng giữa pha rắn
và pha hơi. Quá trình thăng hoa được trình bày như sự dịch chuyển qua đường cong
đó từ trái sang phải. Đối với nước, thông số điểm ba là áp suất P= 4,58 mmHg và
nhiệt độ T = 0,0098C. Nhiệt đợ đó tương ứng với nhiệt đợ nóng chảy của nước ở áp
suất khí quyển bình thường. Vì vậy, khi đốt nóng dần dần nước đá trong khơng khí,
thì nó sẽ chuyển qua trạng thái lỏng và sau đó bắt đầu bay hơi.

29



2.5.9 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Xác định các chỉ tiêu cơ bản của

Nguyên liệu

nguyên liệu: độ ẩm, hàm lượng tro,…

Xác định thơng số nhiệt đợ, thời gian,
Trích ly

tỷ lệ ngun liệu : nước thích hợp.

- Lọc
Xác định nồng đợ dịch trích sau cơ đặc

Cơ đặc

thích hợp.

Xác định tỷ lệ maltodextrin, đường

Phối trợn

phối trợn thích hợp.

- Đơng lạnh
- Sấy thăng hoa
- Bao gói


Kiểm tra chất lượng sản phẩm tồn

Trà hịa
tan

diện.

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

30