CHƢƠNG 2

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị
2.1.1 Hóa chất
-

LDPE của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ hơn 300 micron.

-

PA 6 của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt từ 5 - 50 micron, cỡ hạt trung ình
từ 15 – 20 micron.

-

PET của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ hơn 300 micron.

-

PVC của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt nhỏ hơn 250 micron.

-

PMMA của hãng Goodfellow, dạng ột, cỡ hạt 85 micron.

-

Chitin from shrimp shells (Poly-(1→4)-β-N-acetyl-D-glucosamine) của hãng
Sigma-aldrich, code C7170.

-

Nile red (for microscopy) của hãng Sigma-aldrich, code 72485.

-

Acetone (> 99%) của hãng Scharlau.

-

Methanol 99.8 % của hãng Merck.

-

n-Hexan 98.5 % của hãng Merck.

-

H2O2 (30%) của hãng Merck.

-

FeSO4.7H2O (99.5 – 102 %) của hãng Merck.

-

H2SO4 (95 - 97%) của hãng Merck.

-


Nƣớc c t sử dụng trong phân tích là nƣớc siêu tinh khiết có điện trở > 18,3
MΩ⋅cm.

Cách pha hóa ch t

32


-

Dung dịch lƣu trữ Nile red 500 mg/L: hòa tan 5 mg Nile red trong 10 mL
acetone, ảo quản lạnh trong chai nâu.

-

Dung dịch lƣu trữ Nile red 250 mg/L: hòa tan 5 mg Nile red trong 20 mL
acetone, ảo quản lạnh trong chai nâu.

-

Dung dịch lƣu trữ Nile red 50 mg/L: hòa tan 5 mg Nile red trong 100 mL
acetone, ảo quản lạnh trong chai nâu.

-

Dung dịch Nile red 10 mg/L: pha loãng 5 lẩn dung dịch Nile red 50 mg/L trong
acetone, ảo quản lạnh trong chai nâu.

-


Dung dịch Nile red 5 mg/L: pha loãng 10 lẩn dung dịch Nile red 50 mg/L trong
acetone, ảo quản lạnh trong chai nâu.

-

Dung dịch Nile red 5 mg/L (trong methanol): hòa tan 0,5 mg Nile red trong 100
mL methanol, ảo quản lạnh trong chai nâu.

-

Dung dịch Nile red 5 mg/L (trong n-hexan): pha loãng 10 lẩn dung dịch Nile red
50 mg/L (trong acetone) ằng n-hexan, ảo quản lạnh trong chai nâu.

-

Thuốc thử Fenton: Kết hợp giữa H2O2 và dung dịch FeSO4 0,05M (hòa tan 7.5 g
FeSO4.7H2O (278.02 g/mol) trong 500 mL nƣớc c t và 3 ml H2SO4 98%).

-

Dung dịch từng loại vi nhựa đƣợc chuẩn ị ằng cách cho khoảng 0,2 mg vi
nhựa vào 1 lít mẫu trắng (nƣớc iển đã qua màng lọc GF/C)

-

Dung dịch hỗn hợp các loại vi nhựa và chitin đƣợc chuẩn ị ằng cách cho
khoảng 0,2 mg mỗi loại vào 1 lít mẫu trắng (nƣớc iển đã qua màng lọc GF/C).

-


Dung dịch dùng để khảo sát độ thu hồi và độ lặp lại đƣợc chuẩn ị ằng cách
xác định đúng số hạt vi nhựa cần khảo sát cho vào 1 lít mẫu trắng (nƣớc iển đã
qua màng lọc GF/C), trình ày trong mục 2.2.2.2

T t cả hóa ch t, thuốc thử đƣợc lọc qua màng lọc GF/C trƣớc khi sử dụng

33


2.1.2 Thiết bị và dụng cụ
-

Thiết ị kính hiển vi huỳnh quang Olympus BX53

-

Thiết ị quang phổ hồng ngoại iến đổi Fourier (Thermo iS50 FT-IR).

-

Bếp cách cát (Harry gestigkeit) có điều chỉnh nhiệt độ, công su t.

-

Tủ s y (Memmert) có điều chỉnh nhiệt độ, thời gian.

-

Cốc thủy tinh 250 ml (Duran)


-

Chai thủy tinh 1000 ml (Duran)

-

Lam kính thủy tinh

-

Mặt kính đồng hồ

-

Bộ lọc chân khơng Glassco

-

Đ a petri thủy tinh đƣờng kính 60 mm có nắp đậy

-

Màng lọc sợi thủy tinh GF/C, Whatman, code: 1822-047, đƣờng kính 47 mm, cỡ
lọc 1.2 µm.

-

Màng lọc cellulose acetate (CA), Sartorius, đƣờng kính 47 mm, cỡ lọc 0.45 µm.


-

Nhíp gắp ằng inox

-

Rây inox 5 mm

34


Hình 2.1 Kính hiển vi huỳnh quang và hệ thống ATR-FTIR
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến ảnh huỳnh quang
Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát ảnh huỳnh quang với a ộ lọc huỳnh
quang với các thơng số sau:
-

Bộ lọc 1: Bƣớc sóng kích thích/phát xạ tƣơng ứng 430/470 nm.

-

Bộ lọc 2: Bƣớc sóng kích thích/phát xạ tƣơng ứng 515/560 nm.

-

Bộ lọc 3: Bƣớc sóng kích thích/phát xạ tƣơng ứng 650/670 nm.

2.2.1.1 Khảo sát dung mơi mang Nile red
Nile red có khả n ng hòa tan cao và phát huỳnh quang mạnh trong nhiều loại dung

môi hữu cơ nhƣ metanol, ethanol, ethylacetate, acetonitril, dichloromethane,
toluene, n-hexane và cyclohexane [86]. Các cơng trình đã cơng ố gần đây cho th y
các dung môi nhƣ n-hexan [86], methanol [87], acetone [89] đều cho hiệu quả cao
trong việc nhuộm MPs.
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát với 3 loại dung môi gồm: nhexan, methanol và acetone. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong cùng điều kiện

35


với các MPs nhƣ PA 6, PE, PET, PVC, PMMA và một polyme tự nhiên là Chitin.
Dựa vào ảnh huỳnh quang thu đƣợc chúng tôi lựa chọn loại dung môi để pha NR
cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bố trí thí nghiệm theo ảng sau;
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi mang NR
Polyme

NR/Acetone

NR/Methanol

NR/n-hexan

PA 6
PE
PET
PVC
PMMA
Chtin
2.2.1.2 Khảo sát nồng độ thuốc nhuộm Nile red
Nồng độ thuốc nhuộm NR có ảnh hƣởng đến cƣờng độ huỳnh quang thu đƣợc

[86][87][89][91]. Ở ngƣỡng nồng độ th p, cƣờng độ huỳnh quang t ng theo nồng
độ thuốc nhuộm, vì khi t ng nồng độ thuốc nhuộm sẽ làm t ng tần xu t tƣơng tác
giữa thuốc nhuộm và đối tƣợng nhuộm. Tuy nhiên khi vƣợt quá mức nồng độ thuốc
nhuộm tối ƣu thì xu hƣớng này ị đảo ngƣợc và giá trị huỳnh quang giảm dần theo
mức t ng của nồng độ thuốc nhuộm [91].
Để khảo sát nồng độ làm việc của NR chúng tơi tiến hành ố trí thực nghiệm dựa
trên q trình nhuộm NR ở các nồng độ khác nhau iến thiên từ 0,05 đến 5 mg/L
với ch t nhựa là PA 6, đánh giá ảnh huỳnh quang thu đƣợc (trong cùng điều kiện
xác định) tƣơng ứng với 3 ộ lọc huỳnh quang, từ đó kết luận nồng độ NR làm việc
tối ƣu. Bố trí thực nghiệm theo ảng sau:

36


Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NR
Polyme

Nồng độ NR
(mg/L)

PA 6

0,05

PA 6

0,1

PA 6


0,5

PA 6

2,5

PA 6

5,0

Bộ lọc 1

Bộ lọc 2

Bộ lọc 3

2.2.1.3 Khảo sát độ nhạy của các bộ lọc huỳnh quang
Tiến hành khảo sát độ nhạy của các ộ lọc huỳnh quang ằng cách xác định giá trị
exposure time (thời gian phơi sáng) th p nh t để có thể phát hiện rõ nét ảnh huỳnh
quang của mẫu.
Thời gian phơi sáng ảnh hƣởng lớn đến khả n ng phát hiện tín hiệu huỳnh quang,
đây là khoảng thời gian máy ảnh tiếp xúc với ánh sáng (photon) phát ra từ mẫu [92].
Thời gian phơi sáng càng dài, đầu dò sẽ nhận đƣợc càng nhiều photon, dẫn đến
cƣờng độ điểm ảnh t ng lên và hình ảnh sáng hơn, thời gian phơi sáng quá cao dẫn
đến ảnh huỳnh quang quá sáng và khó xác định đƣợc hình dạng của vi hạt. Trong
khi thời gian phơi sáng ngắn q có thể khơng phát hiện hoặc phát hiện đƣợc ảnh
huỳnh quang nhƣng mờ và không rõ nét. Do đó việc xác định thời gian phơi sáng
phù hợp để có thể phát hiện ảnh huỳnh quang một cách nhanh chóng và ch t lƣợng
là r t quan trọng, từ đó có thể điều chỉnh (t ng) thời gian phơi sáng để thu đƣợc tín
hiệu huỳnh quang sáng và rõ nét tƣơng ứng với các ộ lọc.


37


Để khảo sát chúng tơi tiến hành ố trí thí nghiệm với nhựa gồm PA 6, PE, PET,
PVC, PMMA. Các hạt nhựa sẽ đƣợc nhuộm với dung dịch Nile red. Ảnh huỳnh
quang của các hạt nhựa này sẽ đƣợc ghi nhận ở các mốc thời gian phơi sáng lần lƣợt
là 1 ms, 10 ms, 50 ms, 100 ms, 200 ms và 500 ms tƣơng ứng với 3 ộ lọc huỳnh
quang.
Kết quả dự kiến sẽ xác định đƣợc ộ lọc có thể phát hiện tín hiệu huỳnh quang ở
thời gian phơi sáng th p nh t.
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát độ nhạy của các ộ lọc huỳnh quang
Polyme

Thời gian phơi sáng

Nile red
1 ms

PA 6

+

PE

+

PET

+


PVC

+

PMMA

+

10 ms

50 ms

100 ms

200 ms

500 ms

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Dựa vào kết quả thu đƣợc từ quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến ảnh huỳnh
quang, chúng tôi tiến hành thẩm định phƣơng pháp phân tích với các thơng số thẩm
định nhƣ: Độ đặc hiệu, độ thu hồi và độ lặp lại
2.2.2.1 Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp
Trong môi trƣờng tự nhiên ngoài polyme tổng hợp (hạt vi nhựa) cịn có sự hiện diện
của các vật liệu hữu cơ tự nhiên nhƣ Chitin (vỏ của các loài động vật nhƣ tôm,
cua..), ột gỗ, các ch t éo (lipid), vi tảo... các vật liệu hữu cơ tự nhiên này cũng

38



nhuộm với Nile Red [86][87][89][91]. Sự có mặt của các vật liệu hữu cơ tự nhiên
này làm sai lệch kết quả phân tích hạt vi nhựa (gây sai số dƣơng), do đó cần phải
phân hủy các vật liệu hữu cơ tự nhiên này đồng thời không làm ảnh hƣởng đến kết
quả phân tích. Đã có những nghiên cứu với các phƣơng thức phân hủy khác nhau
nhƣ sử dụng acid HCl, acid HNO3, NaOH, H2O2, Fenton, enzim…[93]. Theo
NOAA, thì thuốc thử Fenton đƣợc sử dụng để phân hủy các vật ch t hữu cơ hiện
diện trong mẫu [94], một số nghiên cứu đã cho th y Fenton có thể loại ỏ trên 80%
mà không ảnh hƣởng đến vi nhựa [95]. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng
thuốc thử Fenton để phân hủy Chitin, vật liệu hữu cơ tự nhiên thƣờng có trong nƣớc
iển.
Để khảo sát độ đặc hiệu của phƣơng pháp chúng tơi tiến hành các thí nghiệm trên 5
loại nhựa (PA 6, PE, PET, PVC, PMMA) và Chitin. Bố trí thí nghiệm theo ảng 2.4
Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu
Phân hủy
Fenton

Polyme

Nhuộm Nile
red

PA 6

+

+

PE


+

+

PET

+

+

PVC

+

+

PMMA

+

+

Chitin

+

+

Nhựa + Chitin


+

+

39

Ảnh huỳnh
quang

Phổ FTIR


Từ kết quả thu đƣợc tiến hành đánh giá:
-

Ảnh huỳnh quang của 5 loại nhựa và Chitin

-

Ảnh huỳnh quang của mẫu hỗn hợp gồm 5 loại nhựa và Chitin

-

Phổ hồng ngoại FTIR của 5 loại nhựa và Chitin

2.2.2.2 Đánh giá độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp
Để đánh giá độ thu hồi và độ lặp lại của phƣơng pháp, chúng tơi tiến hành các thí
nghiệm với hai loại vi nhựa chuẩn là PE và PVC. Với mỗi loại nhựa khảo sát ở a
mức nồng độ khác nhau là 3 hạt/L, 5 hạt/L và 10 hạt/L (khoảng nồng độ thƣờng có
trong nƣớc iển [83][96]). Các hạt nhựa đƣợc thêm vào mẫu trắng (ở đây chúng tôi

sử dụng là nƣớc iển đã lọc qua màng lọc GF/C), mỗi mức nồng độ làm lặp lại 6 lần
(n = 6) [97][98]. Tiến hành thí nghiệm cho từng loại nhựa nhƣ sau:
-

Tạo mẫu trắng thêm chuẩn: hạt nhựa PE (hình 2.4), PVC (hình 2.5) đƣợc chuyển
lên lam kính thủy tinh (đã đƣợc làm sạch) và đƣợc đặt trên nền tối màu đen, xác
định đúng số hạt cần khảo sát, dùng mẫu trắng chuyển các hạt này vào chai thủy
tinh 1 lít, dùng màng nhôm ao phủ miệng chai, đậy nắp và lƣu giữ (hình 2.6).

-

Xử lý mẫu theo quy trình, nhuộm với thuốc thử Nile red.

-

Xác định số hạt tìm đƣợc trên kính hiển vi huỳnh quang.

Dựa vào số hạt thêm vào và số hạt tìm lại, tính tốn hiệu su t thu hồi và độ lặp lại
nhƣ sau:
-

Độ thu hồi của phƣơng pháp đƣợc tính theo cơng thức:
%R 

X
*100


Trong đó:
 X: Số hạt tìm lại, đƣợc xác định qua kính hiển vi huỳnh quang.


40


 µ: Số hạt thêm vào.
-

Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc tính theo cơng thức:
% RSD 

SD
*100
x

Trong đó:
 SD: Độ lệch chuẩn của 6 kết quả lặp lại, SD 

 ( x  x)

2

i

n 1

 n: số lần thí nghiệm (n = 6)


xi : Số hạt tìm lại của lần thử nghiệm thứ ‗i‘.




x : Số hạt tìm lại trung ình của n lần thử nghiệm.

Bố trí thí nghiệm xác định độ thu hồi và độ lặp lại theo ảng 2.5

Hình 2.2 Số hạt PE thêm vào: 3 – 5 – 10 hạt

41


Hình 2.3 Số hạt PVC thêm vào: 3 – 5 – 10 hạt

Hình 2.4 Mẫu trắng thêm chuẩn 3 hạt PE

42


Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát độ thu hồi và độ lặp lại
Mẫu trắng thêm chuẩn

Phân hủy Fenton

1

3 hạt MPs

+

+


2

3 hạt MPs

+

+

3

3 hạt MPs

+

+

4

3 hạt MPs

+

+

5

3 hạt MPs

+


+

6

3 hạt MPs

+

+

7

5 hạt MPs

+

+

8

5 hạt MPs

+

+

9

5 hạt MPs


+

+

10

5 hạt MPs

+

+

11

5 hạt MPs

+

+

12

5 hạt MPs

+

+

13


10 hạt MPs

+

+

14

10 hạt MPs

+

+

15

10 hạt MPs

+

+

16

10 hạt MPs

+

+


17

10 hạt MPs

+

+

18

10 hạt MPs

+

+

Stt

43

Nhuộm NR

Ảnh huỳnh quang


2.2.3 Phân tích mẫu thực
Để phân tích hạt vi nhựa trong mẫu nƣớc iển, chúng tôi lên kế hoạch l y mẫu ở
khu vực iển Cần Giờ theo vị trí dự kiến nhƣ sau:


Hình 2.5 Vị trí l y mẫu dự kiến
Kế hoạch l y mẫu:
-

Phƣơng tiện l y mẫu đƣợc sử dụng là ghe, thuê của ngƣ dân khu vực l y mẫu.

-

Vị trí l y mẫu đƣợc xác định là khu vực iển Cần Giờ, tọa độ l y mẫu đƣợc ghi
nhận ằng ứng dụng ―google map‖ trên điện thoại di động Samsung A71. Mẫu
đƣợc l y tại 03 vị trí dọc theo ãi iển 30/4.

-

Đơ sâu l y mẫu: mẫu đƣợc l y ở tầng nƣớc mặt, độ sâu l y mẫu khoảng 30 cm.

-

Tổng số lƣợng mẫu đƣợc l y là 60 mẫu, trong đó mỗi vị trí l y 20 mẫu, thể tích
mỗi mẫu 01 lít.

Phân tích mẫu theo quy trình, xác định số vi nhựa ằng phƣơng pháp hiển vi huỳnh
quang, định danh vi nhựa ằng phƣơng pháp quang phổ FTIR hoặc quang phổ
Raman. Đánh giá kết quả phân tích ằng kiểm định ANOVA (single factor) và
Tukey (post - hoc test).

44