ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƢỜNG


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NI CẤY ĐẾN
QUÁ TRÌNH BIỂU HIỆN CỦA β-MANNANASE TRONG
ESCHERICHIA COLI BL21

HUỲNH THỊ NGỌC LAN

Đà Nẵng, năm 2020


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƢỜNG


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NI CẤY ĐẾN
Q TRÌNH BIỂU HIỆN CỦA β-MANNANASE TRONG
ESCHERICHIA COLI BL21

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Khóa: 2016-2020
Sinh viên: Huỳnh Thị Ngọc Lan
Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Lê Vũ Khánh Trang

Đà Nẵng, năm 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết
quả nghiên cứu của tôi và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác trƣớc
đây. Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa
học.

Đà Nẵng, tháng 7 năm 2020
Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Ngọc Lan

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu
sắc nhất đến ThS. Lê Vũ Khánh Trang đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình tơi trong
suốt q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh – Môi trƣờng,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng và các thầy cô trong bộ môn Công nghệ
Sinh học tạo môi trƣờng thuận lợi, cung cấp đầy đủ trang thiết bị, dụng cụ cho tôi thực
hiện đề tài một cách thuận tiện nhất.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ từ phía gia đình và bạn bè trong suốt
quá trình thực hiện đề tài. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Chúc tất cả mọi ngƣời sức khỏe và thành đạt.
Đà Nẵng, tháng 7 năm 2020

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Thị Ngọc Lan

ii


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................................ 1
2. MỤC TIÊU .............................................................................................................. 2
3.

4.

Ý NGHĨA KHOA HỌC ...................................................................................... 2
3.1.

Ý nghĩa lý luận ............................................................................................. 2

3.2.

Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................................... 2

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ MANNANASE ....................................................................... 3
1.1.1. Mannanase ..................................................................................................... 3
1.1.2. Ứng dụng của Mannanase ............................................................................... 5

1.3. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH BIỂU HIỆN ENZYME .......... 9
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ............................................................................... 10
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .................................................................. 10
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 10
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 12
2.1. VẬT LIỆU .......................................................................................................... 12
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................ 12
2.2.1. Bố trí thí nghiệm........................................................................................... 12
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 12
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 17
3.1. SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN E. COLI WT VÀ
E.COLI BL21/PBAD3014MANB THEO THỜI GIAN .............................................. 17
3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA MẬT ĐỘ TẾ BÀO ĐẾN SỰ BIỂU HIỆN CỦA
MANNANASE .......................................................................................................... 18
iii


3.3. ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN SỰ BIỂU HIỆN CỦA
MANNANASE .......................................................................................................... 19
3.4. ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI ĐIỂM THU TẾ BÀO ĐẾN SỰ BIỂU HIỆN CỦA
MANNANASE .......................................................................................................... 20
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 24
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 30

iv


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT


E.coli WT

Escherichia coli Wild type

E.coli

Escherichia coli

LB

Luria Bertani

LBG

Locust bean gum

PBS

Phosphate Buffered Saline

SD

Standard Deviatio

OD

Optical Density

MOS


Mannan oligosacchride

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Hoạt độ enzyme tại các điểm thời gian bổ sung chất cảm
ứng

18

3.2

Hoạt độ enzyme tại các nồng chất cảm ứng

20

3.3

Hoạt độ enzyme tại các điểm thời gian thu tế bào


21

vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Cấu trúc khơng gian của mannanase

4

1.2

Cấu trúc mannan và các hợp chất của mannan

5

2.1

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

12


2.1

Mối tƣơng quan giữa OD và mật độ tế bào ở E.coli
BL21/pBAD3014

14

2.2

Mối tƣơng quan giữa OD và mật độ tế bào ở E.coli WT

14

3.1

Đƣờng cong sinh trƣởng của E.coli WT và E.coli
BL21/pBAD3014 ManB

17

3.2

Tốc độ tăng trƣởng của E.coli WT và E.coli
BL21/pBAD3014 ManB

18

3.3


Ảnh hƣởng của thời điểm bổ sung chất cảm ứng đến sự
biểu hiện của enzyme mannanase

19

3.4

Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến sự biểu hiện
của enzyme mannanase

20

3.5

Ảnh hƣởng của thời điểm thu tế bào đến sự biểu hiện của
enzyme mannanase

21

vii


TÓM TẮT

Mannan endo-1,4-beta-mannosidase hay 1,4-β-D-mannanase (EC 3.2.1.78) (tên
thƣờng gọi là β-mannanase), là enzyme nội phân có khả năng xúc tác phân cắt ngẫu
nhiên liên kết β-1,4-mannosidic trong chuỗi chính của cơ chất β-1,4-mannans,
glucomannans, galactomannans và một lƣợng nhỏ mannose, glucose và galactose. Nguồn
thu β-mannanase rất phong phú từ vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, thực vật và cơn trùng.
β-mannanase có rất nhiều ứng dụng đặc biệt trong các ngành công nghiệp sản xuất cà

phê, sản xuất nƣớc quả; công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp dƣợc phẩm;
chế biến thức ăn chăn ni cho đến dầu khí. Việc thu enzyme β-mannanase từ các nguồn
tự nhiên không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng hiện nay nên β-mannanase tái tổ hợp
nhằm tăng sản lƣợng enzyme này đã và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu. Trong nghiên
cứu trƣớc, nhóm nghiên cứu đã biến nạp thành công vecto pBAD3014ManB vào trong
E.coli BL21 và kiểm tra lại đã có mặt protein. Vì vậy, nghiên cứu này đƣợc thực hiện để
khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện của mannanase, nhằm xây dựng
mơ hình tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy, tăng cƣờng khả năng sinh tổng hợp mannanase.
Qua khảo sát đã thu nhận đƣợc hoạt độ enzyme cao nhất ở các điều kiện sau: thời gian bổ
sung chất cảm ứng tại giá trị OD600nm= 0,6 và nồng độ chất cảm ứng L-arabinose là
0,9mg/ml; thời gian thu tế bào sau 8 giờ tính từ lúc bổ sung chất cảm ứng.

viii


MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Mannan endo-1,4-beta-mannosidase hay 1,4-β-D-mannanase (EC 3.2.1.78) (tên
thƣờng gọi là β-mannanase), là enzyme nội phân có khả năng xúc tác phân cắt ngẫu
nhiên liên kết β-1,4-mannosidic trong chuỗi chính của cơ chất β-1,4-mannans,
glucomannans, galactomannans và một lƣợng nhỏ mannose, glucose và galactose
(Yamabhai và cs, 2014). Nguồn thu β-mannanase rất phong phú, từ vi khuẩn (Mendoza
và cs, 1995), nấm mốc, nấm men, thực vật (hạt hay vỏ cây) (Mo, Bewley, 2003) và côn
trùng (Chauhan và cs, 2012).
β-mannanase có rất nhiều ứng dụng, đặc biệt trong các ngành công nghiệp sản xuất
cà phê, sản xuất nƣớc quả; công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy (Kansoh, Nagieb,
2004); công nghiệp dƣợc phẩm; chế biến thức ăn chăn ni cho đến cơng nghiệp dầu khí.
Chính vì có nhiều ứng dụng nhƣ vậy nên β-mannanase đang nhận đƣợc sự quan tâm rất
lớn từ các nhà khoa học và đã đƣợc sản xuất trên quy mơ cơng nghiệp. Có ngành chỉ sử

dụng riêng β-mannanase là đủ nhƣng cũng có ngành phải kết hợp β-mannanase với một
số enzyme khác để đạt hiệu quả cao nhất.
Việc thu enzyme β-mannanase từ các nguồn tự nhiên không đủ cung cấp cho nhu
cầu sử dụng hiện nay nên β-mannanase tái tổ hợp đƣợc tạo ra nhằm tăng sản lƣợng
enzyme này đã và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu. Các vật chủ thƣờng đƣợc các nhà
nghiên cứu chọn để biểu hiện gen β-mannanase là vi sinh vật có khả năng sinh trƣởng và
phát triển nhanh nhƣ Escherichia coli (E.coli) (Lobo và cs, 2013). Trong nghiên cứu
trƣớc, nhóm nghiên cứu đã biến nạp thành cơng vecto pBAD3014ManB vào trong E.coli
BL21 và kiểm tra lại đã có mặt protein. Quá trình lên men chủng tái tổ hợp chịu ảnh
hƣởng của nhiều yếu tố khác nhau nhƣ: thời gian thu tế bào, thời gian bổ sung chất cảm
ứng, nồng độ chất cảm ứng. Việc khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình biểu hiện
của mannanase nhằm tìm ra điều kiện thích hợp để thu hoạt lực enzyme cao nhất. Xuất
phát từ thực tiễn cũng nhƣ góp phần vào việc xây dựng mơ hình tối ƣu hóa điều kiện lên
men nhằm thu đƣợc lƣợng enzyme cao nhất mà chi phí thấp nên đề tài “Ảnh hƣởng của
điều kiện ni cấy đến q trình biểu hiện của β-mannanase trong Escherichia coli

1


BL21” đã đƣợc thực hiện để sàng lọc một số yếu tố ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi
cấy đến quá trình biểu hiện của enzyme β-mannanase.

2. MỤC TIÊU
Tìm ra đƣợc các điều kiện thích hợp nhất cho việc biểu hiện và thu enzyme
mannanase về thời điểm bổ sung chất cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng và thời điểm thu tế
bào.

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC
3.1. Ý nghĩa lý luận
Góp phần làm sáng tỏ sự ảnh hƣởng của các yếu tố: thời gian nuôi cấy, nồng độ chất

cảm ứng, thời điểm bổ sung chất cảm ứng,… đến quá trình biểu hiện hiện β-mannanase
trong E.coli BL21/pBAD3014 ManB. Cung cấp luận cứ và cơ sở khoa học cho việc xây
dựng mơ hình tối ƣu điều kiện lên men để thu nhận enzyme mannanase.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc thu nhận sản lƣợng
enzyme cao nhất có thể mà tốn kém chi phí thấp nhất.

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của E.coli BL21/pBAD3014 ManB.
- Khảo sát thời điểm bổ sung chất cảm ứng.
- Khảo sát nồng độ chất cảm ứng.
- Khảo sát thời điểm thu tế bào.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ MANNANASE
1.1.1. Mannanase
Mannan endo-1,4-β-mannosidase hay 1,4-β-D-mannanase (tên thƣờng gọi là βmannanase), là enzyme nội phân có khả năng xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết β-1,4mannosidic trong chuỗi chính của cơ chất β-1,4-mannans, glucomannans, và
galactomannans. Chúng giải phóng β-1,4-manno-oligomers chuỗi ngắn và có thể đƣợc
thủy phân thành mannose bởi β-mannosidase. Ngồi khả năng thủy phân, một số
mannanase có thể chuyển đổi glycosyl. Trong suốt q trình chuyển đổi, các
oligosaccharide đóng vai trị chất nhận thay thế nƣớc. Đây là nhóm enzyme glycoside,
thủy phân các liên kết glucoside mà vẫn giữ nguyên cấu hình (Sunna và cs, 2000).
Nguồn thu mannanase rất phong phú, từ vi khuẩn nhƣ Bacillus subtilis (Mendoza và
cs, 1995; Zhang và cs, 2006), Streptomyces lividans (Arcand và cs, 1993),
Cadicellulosiruptor (Gibbs và cs, 1999); nấm mốc, nấm men nhƣ Aspergillus
fumigatus IMI 385.708 (Puchart V,2004), Aspergillus terreus (Hemant Soni và cs, 2016);

hạt nảy mầm (Mo, Bewley, 2003) và côn trùng (Chauhan và cs, 2012). Hiện nay, ngƣời ta
đã nhân dòng gen mannanase ở vi khuẩn Bacillus subtilis (Mendoza và cs, 1995; Zhang
và cs, 2006), Streptomyces lividans (Arcand và cs, 1993), Thermoanaerobacterium
polysaccharolyticum (Cann và cs, 1999), Cadicellulosiruptor (Gibbs và cs, 1996), nấm
sợi (Clostridium cellulovorans), thực vật (Marraccini và cs, 2001; Mo, Bewley, 2003;
Yuan và cs, 2006) và côn trùng (Chauhan và cs, 2012).
- Cấu tạo:
Mannanase có nguồn gốc khác nhau thì hoạt tính sinh học, thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Ví dụ nhƣ: từ nấm mốc Sclerotium Rolfsii là một glucoprotein có
M=46.5 kDa; từ vi khuẩn ƣa nhiệt Thermotoga Neapolitana 5068 là enzyme một cấu tử,
có M=45 kDa; từ Aspergillus niger có M=45 kDa; từ loại nhuyễn thể biển Littovena
Reesei có M=42 kDa.
Endo-beta-1,4-mannanase của Pseudomonas cellulose bao gồm 423 axit amin, với
cấu trúc chia thành 3 vùng: vùng A từ Prolin 44 đến Isoleucin 323, vùng B từ Leucin 32
3


đến Tryptophan 360 và vùng C từ Threonin 392 đến Threinin 419. Các chuỗi Arg 39-Lys
43, Arg 324-Gly 331, Arg 361-Thr 391, và Leu 420-Lys 423 có chức năng nối các vùng
trên lại với nhau. Toàn bộ phân tử endo-beta-1,4-mannanase đƣợc cấu tạo bởi 8 chuỗi
xoắn anpha và 8 chuỗi beta (Braithwaite và cs, 1995).

Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian của Mannanase.
Dựa trên trình tự amino acid, β-mannanases đƣợc phân nhóm glycoside hydrolase
GH5 và GH26 theo dữ liệu Carzarate Active Enzyme. Những nghiên cứu liên quan đến
cấu trúc tinh thể của β-mannanases ở cả hai họ GH từ vi khuẩn và nấm mốc đã cho thấy
khe trung tâm hoạt động với ít nhất bốn tiểu phần và các gốc glutamate (ái nhân hoặc
acid/base) hiện diện lần lƣợt trên sợi 4 và 7. Hơn nữa, phân tích cấu trúc phức hợp phối
tử cho thấy β-mannanase của GH5 và GH26 có mặt chứa các gốc thơm đƣợc phân bố
trong khe trung tâm tƣơng tác với mặt α kỵ nƣớc của các vòng đƣờng trong cơ chất.

Nhiều β-mannanase cũng chứa một hay nhiều vùng gắn carbohydrate (carbohydratebinding domain, CBMs) là nhân tố thúc đẩy tƣơng tác giữa enzyme và cơ chất (Boraston
và cs, 2004).
- Cơ chế tác dụng của mannanase:
β-mannanase có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-mannosidic trong chuỗi
polysaccharide galactomannan, glucomannan, galactoglucomannan và mannan.

4


Hình 1.2. Cấu trúc mannan và các hợp chất của mannan.
Trong đó:
(a): Mannan; (b): Galactomannan; (c): Glucomannan; (d): Galacoglucomannan.
Sự thủy phân mannan và các hợp chất của mannan bằng β-1,4-mannanases tạo ra
các sản phẩm là β-D- mannooligosaccharides và hỗn hợp các oligosacchrides có chứa Dmannose, D-glucose, D-galactose.
Mannan là polysaccharides có chứa các gốc đƣờng mannose với tỷ lệ hơn 90%.
Mannanase phân cắt liên kết β-1,4-mannosit trong mạch mannan do vậy nó xúc tác thủy
phân mannan, glucomannan, galactoglucomannan tạo thành mannobiose, mannotriose và
hỗn hợp oligosaccarit. Quá trình này phụ thuộc vào cấu tạo của cơ chất và lƣợng sản
phẩm tạo thành.

1.1.2. Ứng dụng của Mannanase
β-mannanases đã đƣợc ứng dụng trong một số lĩnh vực liên quan đến thực phẩm,
chăn nuôi, dƣợc phẩm, cơng nghiệp giấy và dầu khí:

5


- Trong công nghiệp thực phẩm: β-mannanases đƣợc ứng dụng trong sản xuất cà
phê hòa tan và các loại nƣớc quả.
Trong sản xuất cà phê hòa tan, polysaccharide trong hạt cà phê bao gồm mannan,

arabinogalactat và cellulose chiếm đến một nữa trọng lƣợng khơ của hạt cà phê trong đó
mannan chiếm đến 20-30%. Phần lớn mannan này có trong dịch chiết cà phê làm dịch
chiết cà phê rất nhớt gây khó khăn và tiêu tốn năng lƣợng cho q trình lọc và sấy phun.
Việc sử dụng mannanase trong sản xuất cà phê làm giảm độ nhớt của dịch chiết cà phê từ
đó giảm tiêu hao năng lƣợng và hạ giá thành sản phẩm. Mặc khác các sản phẩm thủy
phân của mannan là các loại đƣờng và oligosaccharide làm tăng vị tự nhiên của cà phê
(Chauhan và cs, 2014).
Trong công nghiệp sản xuất nƣớc quả, mannan là thành phần chủ yếu của thành tế
bào quả do đó nó thƣờng làm giảm năng suất lọc và tăng hàm lƣợng cặn lơ lửng trong sản
phẩm nƣớc quả. Việc sử dụng mannanase trong công nghiệp sản xuất nƣớc quả một mặt
là tăng năng suất lọc, đảm bảo độ trong của dịch quả, mặc khác làm tăng hiệu suất thu hồi
dịch quả (Gubitz và cs, 2000).
- Trong công nghiệp dƣợc phẩm:
Bã cơm dừa là phần còn lại sau khi ép hết chất béo của dừa, nó chứa một lƣợng lớn
mannan. Sự phân giải bã cơm dừa nhờ mannanase làm tăng giá trị sử dụng của dừa và
làm giảm ô nhiễm môi trƣờng do phế phụ của việc ép dừa. Dƣới tác dụng của mannanase,
mannan phân cắt thành các oligosaccharide ứng dụng trong công nghiệp dƣợc phẩm với
vai trò là giá thể cho vi sinh vật đƣờng ruột giúp hệ vi sinh vật có lợi cho tiêu hóa
(Bifidobacterrium sp. và Lactobacillus sp.) phát triển ổn định. Trong những năm gần đây,
oligosaccharide là mối quan tâm lớn trong công nghiệp dƣợc phẩm và công nghiệp thực
phẩm. Đặc biệt là oligosaccharide dị thể đóng vai trị trong glycoprotein và glycolipid.
Chúng là thành phần của màng tế bào đóng vai trò là các thụ thể nhận biết hormon, chất
độc, kháng thể, virus và vi khuẩn. Các kỹ thuật mới bao gồm cả công nghệ enzyme đang
nghiên cứu theo hƣớng tổng hợp các chất có cơ sở là oligosaccharide dùng trong điều trị
và chẩn đốn.
- Trong cơng nghiệp sản xuất thức ăn gia súc:
Mannanase đƣợc sử dụng để phân cắt galactomannan có trong thành phần thức ăn
gia súc đặc biệt nhiều trong các cây họ đậu nhƣ đậu tƣơng; cỏ linh lăng; hạt guar. Bã hạt
6



guar là phế phụ phẩm trong công nghiệp sản xuất guar gum chứa nhiều các acid amin cần
thiết cho sự phát triển của động vật. Tuy nhiên, galactomannan có trong thịt quả làm tăng
độ nhớt thức ăn trong hệ tiêu hóa, do đó làm giảm khả năng tiêu hóa thức ăn và hấp thụ
chất dinh dƣỡng (Petty và cs, 2002). Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, trong thức
ăn chỉ cần có 2-4% galactomannan đã có thể làm giảm hiệu quả của việc hấp thụ thức ăn.
Mannanase đƣợc sản xuất thành các chế phẩm thƣơng mại nhằm bổ sung vào các phế thải
công nghiệp nhƣ vỏ đậu tƣơng, bột đậu tƣơng, bã cơm dừa, thịt quả cọ, thịt quả vừng, thịt
quả cải dầu làm thức ăn cho gia súc (Jackson và cs, 1999). Ví dụ, chế phẩm Hemicell của
Chemgen Corporation (Mỹ) đƣợc thêm vào thức ăn gia súc làm tăng hiệu quả sử dụng
thức ăn, tăng lƣợng sữa đối với bò, giảm lƣợng mỡ trong lợn, tăng trọng lƣợng ở gà, tăng
số lƣợng và chất lƣợng của trứng gà.
- Trong khai thác dầu mỏ và khí đốt:
Một loại dịch nhớt cao thƣờng đƣợc sử dụng để cấp vào đầu mũi khoan. Dịch này
chứa các hạt nhỏ làm nhiệm vụ lấp đầy các kẻ nứt xuất hiện do áp suất thủy tĩnh, giữ cho
mũi khoan không bị gãy dƣới tác dụng của áp suất lớn. Các chất có độ nhớt cao thƣờng
đƣợc sử dụng là galactomannan. Mannanase đƣợc sử dụng để làm giảm độ nhớt dịch này
(Pilitz và cs, 2000).
- Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy:
Mannanase đƣợc sử dụng cùng xylanase nhằm tẩy trắng lớp vỏ gỗ mềm (Gibbs và
cs, 1996) làm giảm lƣợng Clo sử dụng trong phƣơng pháp hóa học. Thêm vào đó việc sử
dụng enzyme trong làm trắng giấy và bột giấy cho chất lƣợng giấy tốt hơn, điều này là
chìa khóa cho sự phát triển công nghiệp làm trắng giấy mà không cần sử dụng Clo.
Việc sử dụng hemicellulase là cách làm trắng giấy gián tiếp, cho cấu trúc sợi gỗ
chặt hơn so với sử dụng Clo hay các chất hóa học khác. Cùng với xylanase, mannanase
đƣợc sử dụng để loại bỏ hemicellulose ở bột giấy không tan. Bột giấy không tan đƣợc sử
dụng tạo sợi visco, ether và ester cellulose. Trong quá trình tạo sợi visco, một lƣợng lớn
hemicellulose có thể ảnh hƣởng đến độ trơn bóng và độ bền của sợi. Trong giai đoạn
acetate hóa, một lƣợng nhỏ galactomannan ảnh hƣởng xấu đến độ trƣơng nở của sợi
acetetate. Mannanase và xylanase kết hợp với nhau trong bột giấy loại bỏ thêm 50%

mannan và 11% xylan ra khỏi bột giấy so với sử dụng riêng lẻ hai loại enzyme.

7


1.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP
Enzyme có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực công nghiệp. Các nguồn thu từ tự
nhiên không đủ cung cấp cho nhu cầu của thị trƣờng vì vậy enzyme tái tổ hợp đƣợc ra
đời nhằm cung cấp một lƣợng lớn enzyme trong khoảng thời gian ngắn.
Protein tái tổ hợp (protein ngoại lai) là protein tự nhiên đƣợc cải biến bằng công
nghệ DNA tái tổ hợp nhằm nâng cao hoặc thay đổi hoạt tính của chúng. Hiện nay, protein
tái tổ hợp là vấn đề đƣợc quan tâm nghiên cứu, mang nhiều hứa hẹn trong tƣơng lai.
Trong số các hệ biểu hiện protein ngoại lai thì vi khuẩn Gram âm E. coli vẫn là một
trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm nhất vì chúng có tốc độ sinh trƣởng
nhanh với mật độ tế bào cao trên môi cơ chất không đắt tiền cũng nhƣ các đặc điểm di
truyền đã đƣợc nghiên cứu đầy đủ.
E.coli là vi khuẩn Gram âm, hình que đƣợc đặt theo tên của Tiến sĩ Theodor
Escherich, nhà khoa học đầu tiên mô tả chúng vào năm 1885 (Thedor Escherich, 1988).
Có nhiều E.coli khác nhau trong tự nhiên, chủ yếu đƣợc tìm thấy trong đƣờng ruột của
động vật. Phần lớn tất cả các chủng E.coli đƣợc thƣơng mại hóa dùng trong phịng thí
nghiệp thƣờng sử dụng ngày nay đều có nguồn gốc từ hai dòng phân lập riêng rẽ là K-12
và B. K-12 đƣợc phân lập từ một bệnh nhân vào năm 1920 và cuối cùng đã trở thành các
chủng phịng thí nghiệm phổ thơng là MG1655 cùng các dẫn xuất của nó là DH5α và
DH10b. Lịch sử của chủng B phức tạp hơn, nó có khả năng đƣợc phân lập vào năm 1918
nhƣng lần đầu tiên đƣợc gọi là chủng B vào năm 1942. Chủng BL21 và các chủng cải
biến của nó là ví dụ phổ biến nhất cho E.coli B. E.coli sinh trƣởng và phát triển nhanh
chóng với thời gian thế hệ chỉ mất 20 phút điều này có ích cho việc ni cấy đƣợc áp
dụng cho các quy trình lên men quy mô lớn. Bộ gen của E.coli là bộ gen đầu tiên đƣợc
giải trình tự hồn tồn (1997), những hiểu biết sâu rộng về cơ chế biểu hiện protein của
nó làm cho việc sử dụng đơn giản hơn trong các thí nghiệm trong đó biểu hiện protein

ngoại lai và lựa chọn thể tái tổ hợp đang đƣợc quan tâm.
Protein ngoại lai tổng hợp trong tế bào chất ở E. coli thƣờng đi kèm với sự cuộn
xoắn khơng chính xác và tích tụ ở dạng thể vùi. Mặc dù sự tạo thành thể vùi thuận lợi cho
tinh sạch nhƣng việc tái cấu trúc để đảm bảo chức năng sinh học chƣa hiệu quả. Việc tiết
protein vào khoang chu chất sẽ có nhiều ƣu điểm, nhất là giảm sự phân cắt protein đích,
tinh sạch dễ dàng, protein độc với tế bào khu trú trong khoang chu chất. Hầu hết các
8


protein đƣợc tiết ra khoang chu chất là protein dạng tan, có chức năng sinh học. Khoang
chu chất của tế bào E. coli chứa các enzyme xúc tác việc tạo thành hoặc tái sắp xếp cầu
disulfide, vì vậy các protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli thƣờng đƣợc định hƣớng
vận chuyển đến đây. Ngồi E.coli cịn có các hệ thống biểu hiện khác thƣờng đƣợc dùng
nhƣ nấm men S. cerevisae (Stalbrand và cs, 1989; Setati và cs, 2001) và Pichia pastoris
(Xu và cs, 2002; Tan và cs, 2005).

1.3. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH BIỂU HIỆN ENZYME
- Nhiệt độ:
Nhiệt độ có ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng của enzyme. Tốc độ phản ứng của
enzyme chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định nếu vƣợt quá nhiệt độ đó tốc độ
phản ứng của enzyme sẽ giảm. Phần lớn các enzyme hoạt động mạnh nhất ở 40-50oC.
Nhiệt độ tối ƣu của mỗi loài khác nhau nếu đƣa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ƣu thì hoạt
tính enzyme sẽ giảm. Khi đó enzyme khơng có khả năng khơi phục lại hoạt tính. Ngƣợc
lại, nếu nhiệt độ quá thấp sẽ hạn chế hoạt động của enzyme.
- pH:
pH môi trƣờng thƣờng ảnh hƣởng đến phản ứng và độ bền của enzyme. Nhiều
enzyme hoạt động ở pH trung tính, số khác hoạt động ở pH acid yếu, pH kiềm hay pH
acid. Ngƣời ta thƣờng sử dụng pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến thực
phẩm, trong tuyển chọn vi sinh vật…
- Thời gian nuôi cấy:

Thời gian nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến việc
sản sinh enzyme. Mật độ tế bào trong môi trƣờng lên men ảnh hƣởng lớn đến quá trình
sinh tổng hợp protein của chủng tái tổ hợp. Khi mật độ tế bào thấp, quá trình sinh tổng hợp
enzyme đƣợc thực hiện liên tục, nếu thu sớm thì protein chƣa tổng hợp đƣợc tối đa, nếu thu
muộn thì sinh ra các chất ức chế và phân hủy protein mới đƣợc tạo thành. Vì khi mơi
trƣờng thiếu dinh dƣỡng, tế bào sẽ tiết ra protease để thủy phân, chuyển hóa các tế bào chết
và các sản phẩm phụ thành nguồn dinh dƣỡng cho tế bào, do đó các sản phẩm protein tái tổ
hợp thƣờng bị thủy phân bởi protease (Shojaosadati và cs, 2008).

- Nồng độ chất cảm ứng:

9


Promoter là một trình tự nucleotide phía đầu 5’ của điểm khởi đầu phiên mã, đóng
vai trị then chốt trong việc biểu hiện gen. Chất cảm ứng là một trong các yếu tố ảnh
hƣởng đến hoạt động của promoter, các chất cảm ứng chỉ có tác dụng ở một nồng độ nhất
định, vƣợt quá nồng độ này chúng sẽ gây rối loạn, ức chế hoạt động promoter từ đó làm
ảnh hƣởng đến việc sản sinh và biểu hiện của enzyme.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, hiện nay có một số nghiên cứu về ni cấy, sinh tổng hợp và các tính
chất hóa lý của endo-1,4-β-mannosidase đã đƣợc công bố ( Cao Thị Vân Hậu, 2003;
Đặng Thị Thu và cs, 2003; Lê Thị Thu Giang và cs, 2003). Chọn chủng, xác định động
thái sinh trƣởng, nhân dịng và phân tích gen mã hóa cho endo-β-1,4-mannanse từ
Bacillus subtilis G1 ( Nguyễn Sỹ Thanh và cs, 2006).
Trong nghiên cứu của Đỗ Biên Cƣơng cùng cs đã cho những báo cáo đầu tiên về
nhân bản và biểu hiện của mannan endo-1,4-β-mannosidase từ Aspergillus niger ở Pichia
pastoris.


1.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới, mannanase đã đƣợc sản xuất trên qui mô công nghiệp. Chế
phẩm enzyme thƣơng mại có ứng dụng trong nhiều ngành cơng nghiệp nên đã có nhiều
nghiên cứu về mannanase.
Nhiều nghiên cứu về tinh chế và các đặc tính của mannanase từ các chủng khác
nhau nhƣ từ Bacillus stearothermophilus của Talbot và cs (1990), Trichoderma reesei
của Stalbrand, Bacillus subtilis KU-1 của Zakaria và cs (1998), Sclerotium (Athelia)
rolfsii của Sachslehner và cs (1999), Bacillus licheniformis của Zhang và cs (2000),
Bacillus sp. chủng JAMB-750 của Takeda và cs (2004), Aspergillus fumigatus IMI
385.708 của Puchart (2004), Paenibacillus sp. ĐZ3 của Chandra và cs (2011), từ
Aspergillus terreus của Hemant Soni và cs (2016),…
Trong hai nghiên cứu gà thịt broiler gần đây, β-mannanase đã cho thấy sự cải thiện
năng suất đáng kể, kháng đƣợc cầu trùng Eimeria sp. và vi khuẩn Clostridium
perfringens (Mathis và cs, 2002) giúp giảm tổn thƣơng đƣờng ruột ở gia cầm. Trong
trƣờng hợp khơng có thuốc kháng sinh, Piao và cs (2003) kết luận rằng β-mannanase đã
10


giúp cải thiện năng suất tƣơng tự nhƣ khi tăng 100 kcal/kg ME trong khẩu phần ăn ở gà
đến 54 ngày tuổi. Trong nghiên cứu khác của Mehri và cs (2010) cho thấy việc bổ sung
mannanase vào khẩu phần thức ăn làm tăng tế bào lympho và giảm tỷ lệ heterophil vì vậy
nó làm tăng cƣờng hệ thống miễn dịch ở gà.
Trong một cuộc khảo sát tăng trƣởng ở heo đã sử dụng tổng số 5350 con heo,
Quinn và cs (2002) quan sát thấy rằng β-mannanase đã cải thiện 3,2% ADG. Ngồi ra
cịn giảm đáng kể tỷ lệ heo chết và tỷ lệ loại thải.
Amany L. Kansoh và cs (2004) đã khảo sát ra đƣợc khi bổ sung cùng lúc xylanse và
mannanase sẽ cho hiệu quả sử lý trắng giấy cao hơn so với việc bổ sung lần lƣợt từng
loại.
Trong nghiên cứu của Chauhan và cs (2014) cho thấy đƣợc mannanase thu từ

Bacillus nealsonii PN-11 bổ sung vào trong quá trình thủy phân dịch chiết từ hạt cà phê
đã giảm độ nhớt gấp đơi từ 50 mPas xuống cịn 26±1,56 mPas. Việc sử dụng mannanase
sẽ giúp giảm tiêu hao năng lƣợng trong q trình sấy khơ, cho giá trị kinh tế cao hơn.
Trong một nghiên cứu khác của ông và cs cũng cho thấy rằng mannanase thu từ Bacillus
nealsonii PN-11 phân giải LBG thành MOS, các MOS tăng cƣờng sự phát triển của
Lactobacillus casei, ức chế sự phát triển của Samonella enterica cho thấy các đặc tính
prebiotic tiềm năng.

11


CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
Chủng vi khuẩn E.coli BL21 (ký hiệu: WT) và E.coli BL21 mang gen mã hóa βmananase (E.coli BL21/pBAD 3014 ManB) đƣợc cung cấp từ Bộ môn Công nghệ sinh
học, Khoa Hóa, Trƣờng Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Bố trí thí nghiệm
Chủng E.coli
BL21/pBAD3014ManB
Hoạt hóa

Ni cấy

Dịch tế bào

Khảo sát thời điểm bổ
sung chất cảm ứng

Khảo sát nồng độ

chất cảm ứng

Khảo sát đƣờng
cong sinh trƣởng

Khảo sát thời
điểm thu tế bào

Xác định hoạt độ
enzyme mannanase
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.

2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
a. Phương pháp giữ giống
Vi khuẩn E.coli BL21/ pBAD 3014 ManB đã đƣợc giữ giống trong môi trƣờng LB
chứa 50% glycerol, bảo quản ở -20oC.
12


b. Phương pháp hoạt hóa
Từ ống giống tiến hành cấy ria trên đĩa thạch mơi trƣờng thạch LB có bổ sung
ampicillin (100µg/ml), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Từ các khuẩn lạc đơn thu đƣợc trên đĩa
thạch, chọn một khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10ml môi trƣờng LB lỏng có bổ
sung ampicillin (100µg/ml) ni cấy tĩnh qua đêm.

c. Phương pháp ni cấy
Vi khuẩn đƣợc ni cấy trong bình thủy tinh 150 ml có chứa 30 ml LB, ampicillin
(100µg/ml) và bổ sung dịch hoạt hóa vi khuẩn sao cho canh trƣờng nuôi cấy đạt giá trị
OD600nm= 0,1. Tiến hành nuôi cấy lắc ở 37oC, 140rpm.


d. Khảo sát đường cong sinh trưởng của E.coli WT và E.coli BL21/
pBAD3014ManB
- Xây dựng đƣờng tƣơng quan giữa OD và mật độ tế bào log (CFU/ml)
Dịch canh trƣờng nuôi cấy qua đêm đƣợc pha lỗng trong mơi trƣờng LB (có bổ
sung ampicillin đối với E.coli BL21/pBAD3014) để đạt đƣợc các nồng độ OD600nm lần
lƣợt là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Sau đó tiến hành pha lỗng đến 10-9 và cấy trang lên đĩa mơi
trƣờng thạch LB ở nồng độ 10-8 và 10-9. Kết quả tƣơng quan giữa OD và mật độ tế bào
log (CFU/ml) đƣợc thể hiện ở Hình 2.2 và Hình 2.3:

13


Log(CFU/ml)

9.4

y = 2.1052x + 8.2599
R² = 0.9938

9.2
9
8.8
8.6
8.4

0

0.2

0.4


0.6

OD600nm

Hình 2.2. Mối tƣơng quan giữa OD và mật độ tế bào ở E.coli BL21/pBAD3014.
9.5

y = 1.3046x + 8.7742
R² = 0.9928

Log (CFU/ml)

9.3
9.1
8.9
8.7
0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6


OD600nm

Hình 2.3. Mối tƣơng quan giữa OD và mật độ tế bào ở E.coli WT.
- Dựng đƣờng cong sinh trƣởng: Tiến hành đo giá trị OD 2 giờ/lần từ canh trƣờng
nuôi cấy. Dựa vào kết quả giá trị OD và phƣơng trình tƣơng quan để dựng đƣờng cong
sinh trƣởng.
- Tính tốc độ tăng trƣởng của tế bào vi khuẩn đƣợc tính theo cơng thức:

𝐥𝐧 𝑿𝒕 − 𝐥𝐧 𝑿𝟎
𝒕 − 𝒕𝟎
Trong đó:
-

Xt: mật độ tế bào ở thời điểm t

-

X0: mật độ tế bào tại thời điểm t0

-

t0: thời điểm ban đầu (0 giờ)

14


e. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện của
mannanase
- Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung chất cảm ứng

Từ dịch nuôi cấy, tại các thời điểm OD600nm đạt giá trị lần lƣợt là 0,3; 0,6; 0,9; 1,2
bổ sung L-arabinose nồng độ 0,7mg/ml, tiếp tục đƣợc nuôi cấy lắc ở 37oC, 140rpm. Thu
tế bào sau 4 giờ tính từ lúc bổ sung chất cảm ứng.
- Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng
Từ dịch nuôi cấy, tại giá trị OD600nm đã đƣợc khảo sát ở thí nghiệm trên bổ sung
chất cảm ứng L-arabinose với các nồng độ 0; 0,5; 0,7; 0,9; 1,1; 1,3mg/ml, tiếp tục nuôi
cấy lắc ở 37oC, 140rpm. Thu tế bào sau 4 giờ tính từ lúc bổ sung chất cảm ứng.
- Ảnh hưởng của thời gian thu tế bào
Tại thời điểm OD600nm bổ sung chất cảm ứng và nồng độ L-arabinose thích hợp
đƣợc lựa chọn ở thí nghiệm trên, tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của thời gian thu
tế bào sau 2; 4; 6; 8; 24 giờ tính từ lúc bổ sung chất cảm ứng.

f. Phương pháp thu nhận enzyme nội bào
Để đảm bảo đồng nhất số lƣợng tế bào ở tất cả các mẫu thí nghiệm, tiến hành thu tế
bào theo cơng thức sau:

V=

𝟐𝟎
𝑶𝑫

Trong đó:
- V: là thể tích thu của dịch ni cấy
- OD: là giá trị OD đo đƣợc tại thời điểm thu dịch nuôi cấy
Dịch ni cấy thu đƣợc đem ly tâm lạnh (4000 vịng, 30 phút ở 4oC). Loại bỏ phần
dịch nổi sau đó rửa lại với nƣớc cất 2 lần và tái huyền phù trong 100 µl PBS (50mM, pH
6,5) thu đƣợc dịch tế bào.
Các tế bào đƣợc phá vỡ bằng sóng siêu âm ở 50oC trong 2 phút với mỗi chu kỳ 15
giây phá: 10 giây nghỉ. Sau đó đem ly tâm lạnh (10000 vòng, 1 phút), thu dịch nổi
(Nguyễn Thu Hiền và cs, 2013).


15