ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH
VI TẢO THUỘC HỌ SCENEDESMACEAE TẠI MỘT SỐ
THỦY VỰC NƯỚC NGỌT THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

CHU NHẬT HÀ

Đà Nẵng, năm 2020


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH
VI TẢO THUỘC HỌ SCENEDESMACEAE TẠI MỘT SỐ
THỦY VỰC NƯỚC NGỌT THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Khóa: 2016-2020
Sinh viên: Chu Nhật Hà
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng, năm 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đề tài “Ứng dụng sinh học phân tử trong định danh vi tảo thuộc họ
Scenedesmaceae tại các thủy vực nước ngọt thành phố Đà Nẵng” là kết quả cơng trình
nghiên cứu của riêng tơi.
Các số liệu, hình ảnh, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi
chú nguồn gốc rõ ràng.

Tên sinh viên

Chu Nhật Hà

i


LỜI CÁM ƠN
Trong thời gian được học tập tại Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, tôi
đã được trang bị rất nhiều kiến thức từ cơ bản đến chuyên ngành công nghệ sinh học. Từ
việc tiếp thu kiến thức ở lớp đến việc thực hành, áp dụng kiến thức vào thực tế để tôi
khắc sâu kiến thức cho bản thân và có thêm nhiều kinh nghiệm thực tiễn. Những chuyến
đi thực tập đã đem lại cho tôi những nhận thức và đam mê hơn với ngành và nghề của
mình sau này.
Tơi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Minh Lý và
TS. Trịnh Đăng Mậu, giảng viên Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm –
Đại học Đà Nẵng, thầy đã trực tiếp hướng dẫn một cách tận tình, chỉ bảo tơi trong suốt
thời gian tơi thực hiện nghiên cứu và hồn thiện bài báo cáo khóa luận này.

Tôi vô cùng cảm ơn sâu sắc tới tất cả thầy giáo, cô giáo, cán bộ của Khoa Sinh –
Môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng đã tạo điều kiện thuận lợi và
giúp đỡ tôi trong các nghiên cứu.
Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè, những
người đã luôn giúp đỡ, ủng hộ động viên tôi trong suốt thời gian theo học tại trường nói
chung và thời gian thực hiện nghiên cứu nói riêng.
Tơi xin chân thành cảm ơn!

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................i
LỜI CÁM ƠN ............................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii
TĨM TẮT ............................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1
2. Mục tiêu đề tài ......................................................................................................... 2
3. Ý nghĩa của đề tài.................................................................................................... 2
3.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................................. 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 2
4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. Đặc điểm hình thái, sinh học của vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae .................... 3
1.1.1. Hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học ........................................................... 3
1.1.2. Một số ứng dụng của vi tảo Scenedesmaceae .............................................. 3
1.2. Ứng dụng DNA mã vạch trong định danh vi tảo ................................................. 4

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 6
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 6
2.2. Phạm vi nghiên cứu.............................................................................................. 6
2.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 6
2.3.1. Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa ............................................................ 6
2.3.2. Phương pháp phân lập vi tảo ......................................................................... 6
iii


2.3.3. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái..................................................... 7
2.3.4. Phương pháp tách chiết DNA, khuếch đại PCR ............................................ 7
2.3.5. Phương pháp hiệu chỉnh trình tự ................................................................... 8
2.3.6. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại .......................................... 8
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 10
3.1. Phân lập vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae ......................................................... 10
3.2. Đánh giá hiệu quả của các đoạn mồi ITS, rbcL, tufA........................................ 12
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi tảo họ Scenedesmaceae ................... 12
3.2.2. Khả năng khuếch đại các vùng trình tự gen ITS, rbcL, tufA ...................... 12
a. Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S1 (Bảng 3.2). ........................ 14
b. Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S2 (Bảng 3.3) ......................... 16
c. Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S3 (Bảng 3.4) ......................... 17
d. Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S4 (Bảng 3.5) ......................... 19
e. Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S5 (Bảng 3.6) ......................... 19
f. Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S6 (Bảng 3.7) .......................... 20
3.3. Thiết lập cây phát sinh chủng loại ..................................................................... 21
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 29
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 30

iv



DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

bp

Cặp nucleotit cơ bản

CTAB

Cetyltrimethylammonium bromide

CS

Cộng sự

CSDL

Cơ sở dữ liệu

dNTP

Deoxynucleotide


EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

ESS

Estimated sample sizes

GenBank

Ngân hàng Gen

GMYC

Generalized mixed Yule-coalescent

ITS

Internal transcribed spacer

PCR

Phản ứng khuếch đại gen

rbcL

Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase

RNA


Ribonucleic acid

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris/Borate/EDTA

TB

Tế bào

Tm

Nhiệt độ nóng chảy

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

2.1.


Vị trí lấy mẫu tại Đà Nẵng

6

2.2.

Thơng tin các đoạn mồi được sử dụng cho nghiên cứu

8

3.1.

Bảng tóm tắt danh mục các lồi được phân lập

10

3.2.

3.3.

3.4.

3.5.

3.6.

Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của
vùng gen mẫu S1
Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của
NCBI đối với mẫu S2

Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của
NCBI đối với mẫu S3
Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của
NCBI đối với mẫu S4
Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của
NCBI đối với mẫu S5

15

17

18

19

20

Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của
3.7.

21

NCBI đối với mẫu S6

vi


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Tên hình vẽ


Hình
3.1.
3.2.

Điện di DNA tổng số từ 6 mẫu vi tảo họ Scenedesmaceae
khác nhau
Sản phẩm khuếch đại PCR sử dụng 5 cặp mồi khác nhau

Trang
12
13

Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của
3.3.

các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở

23

vùng gen tufA – 1
Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của
3.4.

các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở

24

vùng gen tufA – 2
Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của
3.5.


các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở

25

vùng gen rbcL – 1
Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của
3.6.

các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở

26

vùng gen ITS
Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của
3.7.

các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở
vùng gen rbcL – 2

vii

27


TĨM TẮT
Một số chi trong họ Scenedesmaceae là những lồi vi tảo nước ngọt phổ biến được
tìm thấy trên khắp thế giới, là nguồn vật liệu lý tưởng cho sản xuất nhiên liệu sinh học
nhờ lượng lipid đáng kể trong tế bào. Tuy nhiên, sự đa dạng về hình thái thực tế của nó
gây nhiều tranh cãi do tính dẻo hình thái trong chi. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu

về sinh học phân tử cho vi tảo họ Scenedesmaceae, tuy nhiên lĩnh vực này vẫn còn khá
mới ở Việt Nam. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân lập và đánh giá hiệu
quả các đoạn mồi phổ quát tufA – 1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 đối với vi tảo họ
Scenedesmaceae và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Kết quả định danh
bằng cách sử dụng kết hợp các đặc tính hình thái và sinh học phân tử ghi nhận 6 loài,
thuộc 4 chi trong họ Scenedesmaceae, gồm có: Desmodesmus subspicatus, Acutodesmus
reginae,

Tetradesmus

bernardii,

Desmodesmus

sp.,

Pectinodesmus

pectinatus,

Tetradesmus obliquus. Kết quả cho thấy các cặp mồi này đều khuếch đại thành cơng các
lồi thuộc họ Scenedesmaceae, đồng thời vùng gen ITS được chứng minh là DNA mã
vạch lí tưởng đối với lồi A. reginae, P. pectinatus và vùng gen tufA – 1 đối với loài A.
reginae với mức độ tin cậy hơn 99%. Kết quả khác, cho thấy các vùng gen tufA – 1, tufA
– 2 khuếch đại vùng trình tự chưa được cơng bố đối với loài T. bernardii và tufA – 2 cho
lồi P.pectinatus trên GenBank. Tìm được mối quan hệ của loài Scenedesmus obliquus đã
được chuyển thành Tetradesmus obliquus nhờ sinh học phân tử.

viii



MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của đề tài
Vi tảo là một trong những nhóm sinh vật hiện diện đầu tiên trên trái đất, có vai trị

quan trọng trong sinh giới như đóng góp năng suất sơ cấp cho chuỗi thức ăn, tiêu thụ khí
CO2 và sản xuất ra O2 thơng qua q trình quang hợp, có ý nghĩa lớn về kinh tế cho con
người (nguồn dinh dưỡng, các hợp chất thứ cấp, sinh khối cho nhiên liệu sinh học) và là
đối tượng cho những nghiên cứu khoa học trên thế giới (Nguyễn Văn Tun, 2003).
Ngồi ra, có rất nhiều mối quan tâm và nghiên cứu trong việc sử dụng vi tảo cho các ứng
dụng như sản xuất nhiên liệu, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (Nascimento và cs, 2013;
Subhadra và Grinson-George, 2011).
Những loài thuộc họ Scenedesmaceae phổ biến ở vùng nước ngọt và nước lợ, đặc
biệt là trong điều kiện giàu dinh dưỡng. Chúng là một nhóm tảo xanh khá quan trọng về
mặt sinh thái vì chúng có thể tạo thành một phần chính của sinh khối tảo xanh trong
nhóm thực vật phù du. Nhiều loài Scenedesmus sp. dễ dàng phát triển trong mơi trường
ni cấy nhân tạo, do đó thường được sử dụng trong các nghiên cứu sinh hóa và sinh lý
thực vật. Dựa trên cơ sở dữ liệu trên Algaebase.org nhóm tảo lục, về mặt phân loại vơ
cùng đa dạng với khoảng 6758 lồi, có 895 lồi thuộc bộ Sphaerophleales, 340 loài thuộc
họ Scenedesmaceae với 130 loài thuộc chi Scenedesmus, 65 loài ở chi Desmodesmus, 15
loài của chi Tetradesmus và 4 lồi thuộc chi Pectinodesmus đã được mơ tả tính đến thời
điểm năm 2020. Nhóm tảo lục là một nhà máy quan trọng trong hệ sinh thái trên cạn và
trong nước, thường được sử dụng như chỉ thị sinh học trong quan trắc nước và nghiên
cứu sinh thái (Amengual-Morro và cs, 2012; Torres và cs, 2008).
Việc xác định vi tảo có thể là một nhiệm vụ khó khăn và phải yêu cầu kiểm tra
chúng dưới kính hiển vi với độ phóng đại lớn bởi sự cẩn thận của chuyên gia phân loại
(Bock và cs, 2011; De Clerck và cs, 2013). Tảo lục được nhận diện nhờ quan sát dưới
kính hiển vi qua các hình dạng chung của các tế bào sinh dưỡng, như vị trí của lục lạp

hay hạt tạo tinh bột và đặc điểm khác như khả năng chuyển động của tế bào.
Trên thế giới việc sử dụng các chỉ thị DNA đang được sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu phân loại đa dạng sinh học, xác định được khoảng cách di truyền và đặc trưng
cá thể nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống. Ưu việc hơn so với các chỉ thị truyền thống
1


về hình thái và sinh học, phương pháp mã vạch – DNA barcode đã được ứng dụng và
mang lại những ưu điểm như tính ổn định, chính xác, nhanh chóng (Hebert và cs, 2003).
DNA mã vạch đã được nghiên cứu trong định danh các loài thực vật trên cạn (Kelly và
cs, 2010); và số lượng lớn các nhóm tảo lục. Sự phát triển của DNA barcodes đối với tảo
lục sẽ giúp nhận dạng chính xác và nhanh chóng, bởi vì điều này đặc biệt quan trọng đối
với những loài tảo lục có đặc điểm cấu trúc khơng rõ ràng và khó để quan sát (Hall và cs,
2010).
Hiện nay, việc ứng dụng DNA mã vạch vào các loài vi tảo thuộc họ
Scenedesmaceae vẫn chưa được hoàn thiện. Sự đa dạng về hình thái và định danh chính
xác, hiệu quả là một trong những vấn đề cần được giải quyết trong lúc này. Chính vì vậy,
nên tơi đề xuất được thực hiện đề tài: “Ứng dụng sinh học phân tử trong định danh vi
tảo thuộc họ Scenedesmaceae tại một số thủy vực nước ngọt thành phố Đà Nẵng”.
1.

Mục tiêu đề tài
Định danh các loài vi tảo bằng kỹ thuật sinh học phân tử và đánh giá được mối quan

hệ di truyền của các loài thuộc họ Scenedesmaceae.

3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học và phương pháp định danh
các loài vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae bằng DNA mã vạch hiệu quả tại thành phố Đà

Nẵng.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu này là cơ sở giúp đánh giá được mối quan hệ của các loài nhờ chỉ thị
sinh học phân tử DNA mã vạch. Cung cấp cơng cụ phân tích hiệu quả để định danh các
loài vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae.

4. Nội dung nghiên cứu
 Nội dung 1: Phân lập và làm thuần các loài vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae tại
thành phố Đà Nẵng.
 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả của các đoạn mồi ITS, rbcL, tufA trong định danh
bằng sinh học phân tử đối với các loài vi tảo họ Scenedesmaceae.
 Nội dung 3: Đánh giá tính đa dạng di truyền về mặt hình thái và đặc trưng của các
loài vi tảo họ Scenedesmaceae.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Đặc điểm hình thái, sinh học của vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae

1.1.1. Hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học
Về phân loại khoa học, vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae
Giới (Domain): Plantae (Thực vật)
Ngành (Phylum): Chlorophyta
Lớp (Class): Chlorophyceae
Bộ (Order): Sphaeropleales
Họ (Family): Scenedesmaceae
Chi Scenedesmus lần đầu tiên được xây dựng bởi (Chodat, 1926). Dựa trên kính

hiển vi điện tử, các lồi chủ yếu có gai của chi Desmodesmus được đặc trưng bởi một
siêu cấu trúc vách tế bào với một lớp algenean bổ sung. Các chi Acutodesmus và
Pectinodesmus được đặc trưng bởi các đường dọc được tạo ra bởi thành tế bào cellulose
bên trong (Eberhard Hegewald và cs, 2010; Johnson và cs, 2007).
Đặc điểm nhận dạng chung của họ Scenedesmaceae: Là tảo tập đoàn, tập đoàn gồm
2- 32 tế bào. Các tế bào gắn với nhau ở sườn, sắp xếp trên 1 hàng hoặc so le. Tế bào hình
cầu, hình thoi, hình elip, hình trứng. Đầu tế bào đơi khi hơi thắt nhọn và uốn cong vào
phía trong. Thành tế bào có lớp hemicellulosic và sporopolleninic, thường nhẵn, trơn.
Các tế bào có gai hoặc khơng, chứa lục lạp đơn và một hạt tạo tinh bột. Sinh sản vơ tính
bằng bào tử gốc, tảo tập đồn tách thành các tế bào rời rạc, và giải phóng bào tử tạo ra
các thế hệ con.
1.1.2. Một số ứng dụng của vi tảo Scenedesmaceae
Việc loại bỏ catmi và đồng ra khỏi nước thơng qua q trình hấp thụ sinh học bằng
cách sử dụng Scenedesmus abundans với nồng độ tảo đủ cao có thể loại bỏ được những
kim loại này trong nước bị nhiễm (Terry và Stone, 2002).
Scenedesmus đã được tìm thấy có khả năng tích lũy carotenoid thứ cấp cùng với sự
tăng trưởng nhanh chóng (Qin và cs, 2008) đem lại cho con người nhiều lợi ích như
chống oxy hóa, kích thích tế bào miễn dịch, phối hợp với các chất chống oxi hoá khác
như vitamin C và E để giảm các nguy cơ nhiễm trùng, làm chậm quá trình lão hoá, giảm

3


tác hại của ánh sáng mặt trời, cũng như giảm nguy cơ một số bệnh về tim mạch và ngừa
một số bệnh ung thư (Landrum, 2009).
Scenedesmus obliquus là một trong loài vi tảo đầy tiềm năng cho sản xuất biodiesel
thay thế cho các nhiên liệu đang dần cạn kiệt như dầu mỏ, than đá. Với lượng lipid đạt
43% trọng lượng khô, hàm lượng lipid sẽ đạt cao hơn nếu tối ưu hóa các khâu ni cấy
và quy trình tách chiết (Mandal và Mallick, 2009).
Desmodesmus sp. có thể loại bỏ nước thải ô nhiễm, chứa một lượng lớn nitơ và phốt

pho, đặc biệt là nồng độ amoni cao, với khả năng loại bỏ 100% NH4 – N (68.691 mg/ L),
TP (4.565 mg/ L) và PO4 – P (4.053 mg/ L) và 75,50% TN (84,236 mg/ L) ở mức 10%
nước thải phân hủy kỵ khí, với sản lượng sinh khối cao nhất là 0,412g/ L sau 14 ngày
canh tác. Các chất thải được loại bỏ hằng ngày theo tỷ lệ TN, NH4 lượng N, TP và PO4
hàng ngày lần lượt là 4,542, 5,284, 0,326 và 0,290 mg/ L /ngày (Ji và c.s., 2014).
Chiết xuất khô của vi tảo nước ngọt Scenedesmus rubescens có thể ngăn chặn các
dấu hiệu lão hóa do tế bào gây ra bởi bức xạ UV. Nó tăng cường khả năng sống sót của
nguyên bào sợi, giải cứu hàm lượng collagen trong da, ức chế sự hình thành các tế bào
cháy nắng và ức chế hoạt động tyrosinase trong việc sản xuất melanin (Campiche và cs,
2018).

1.2. Ứng dụng DNA mã vạch trong định danh vi tảo
Khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph,
Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003, nhằm giúp nhận diện các mẫu vật (Hebert và
cs, 2003). Bên cạnh đó, cơng nghệ mã vạch DNA đã được chứng minh là hiệu quả đối
với việc xác định loài ở cả thực vật và động vật (Hebert và cs, 2003; Krawczyk và cs,
2014). Một đoạn gen của COI đã được chứng minh là điểm đánh dấu phổ biến để định
danh cho động vật, nhờ vào cặp mồi và trình tự (Hebert và cs, 2003). Tuy nhiên, trong
thực vật, việc khuếch đại COI thường khó khăn và nó khơng đủ khác nhau để phân biệt
hầu hết các loài. Trong khi, “rbcL + matk”, được đề xuất làm mã vạch chính cho thực
vật, thì mã vạch tiêu chuẩn cho vi tảo vẫn chưa rõ ràng (Wang và cs, 2011).
Các nghiên cứu DNA đầu tiên cho họ Scenedesmaceae được thực hiện bởi
(Paschma và Hegewald, 1986). Mã vạch DNA hiệu quả đối với tảo khá mơ hồ và hiệu
quả hơn nếu sử dụng nhiều gen cho mã hóa tảo. Những vị trí gen được đề xuất cho DNA
mã vạch cho tảo như rbcL, ITS, tufA (Hall và cs, 2010).

4


Nghiên cứu nhằm đánh giá tính khả thi của việc sử dụng rbcL và ITS1 – ITS 2 cho

51 loài vi tảo lục được phân lập tại đất nước Brazil. Mồi sử dụng phổ biến ITS1 - 5.8S --j
ITS2 khuếch đại thành công 92% các mẫu, mặt khác, cặp mồi rbcL, đã khuếch đại tới
96% mẫu. 35% các chủng có thể được xác định rõ ràng ở cấp loài dựa vào ITS1 và ITS2,
ngược lại, chỉ có 6% chủng được phát hiện chính xác nhờ trình từ mồi rbcL. Tóm lại, với
đoạn gen ITS1 và ITS2 là những chỉ thị hữu ích cho việc định danh các lồi vi tảo lục
nước ngọt (Hadi và cs, 2016).
Theo (Zou, Fei, Song, và cs, 2016) miêu tả một số phương pháp mã vạch khác nhau
dùng để phân biệt các loài đang được cải tiến, nhưng phương pháp nào là tốt nhất vẫn còn
gặp nhiều tranh cãi. Chlorella đã được phân tích tồn diện về mã vạch ở các giống như
Chlorella, Chloroidium, Dictyosphaerium và Actinastrum dựa trên các chuỗi rbcL, ITS,
tufA và 16S. Trong đó, tufA được chứng minh là mã vạch đem lại hiệu quả nhất đối với
giống Chlorella trong việc phân biệt mối quan hệ phát sinh loài.
Theo (Zou, Fei, Wang, và cs, 2016) đã đánh giá sự đa dạng Scenedesmus thông qua
các mã vạch dựa trên ký tự đã được chứng minh là cách tiếp cận hiệu quả nhất để phân
biệt loài trong cả dữ liệu đơn và dữ liệu kết hợp tạo ra nhận dạng loài nhất quán nhờ vào
các vùng gen rbcL, tufA, ITS, 18S. Tất cả các kết quả thu được đã phục hồi 11 loài, năm
trong số đó là những lồi tiềm năng.
Tại Việt Nam, vẫn chưa có những bài nghiên cứu được cơng bố về DNA mã vạch
đối với loài vi tảo, đặc biệt là những chủng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae.

5


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các loài vi tảo họ Scenedesmaceae được thu tại một số thủy vực nước ngọt thành
phố Đà Nẵng.

2.2. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm cơng nghệ sinh học tế bào và cơng nghệ

sinh học tảo, Khoa sinh- môi trường, Trường đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
Thời gian thực hiện: 6 tháng (12/2019 – 06/2020)
Bảng 2.1. Vị trí lấy mẫu tại Đà Nẵng

STT

Tên các thủy vực nước ngọt

Tọa độ

1

Hồ Bàu Tràm

16°05' B – 108°08’ N

2

Hồ Bàu Trảng

16°03’ B – 108°10' N

3

Hồ Sen ĐH Sư Phạm Đà Nẵng

16°03' B – 108°09' N

4


Hồ công viên 29/3

16°03' B – 108°12' N

5

Bờ hồ 2 Hàm Nghi

16°03' B – 108°12' N

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa
Mẫu vi tảo được thu bằng lưới thu mẫu thực vật phù du.Tại mỗi điểm thu mẫu kéo
lưới theo hình số tám hay zic zắc. Kéo lưới khoảng vài lượt, nhấc lưới lên, mở khóa ống
đáy đổ mẫu vào lọ 50ml. Thời gian phù hợp để thu mẫu là từ 7 – 9 giờ sáng. Khoảng thời
gian này nhiệt độ ổn định, các tế bào đang ổn định thích hợp cho việc thu mẫu. Mẫu tảo
phục vụ cho phân lập nên không sử dụng hóa chất trong q trình thu mẫu. Ln tạo điều
kiện cho sự trao đổi khí của mẫu tránh tổn hại mẫu.
2.3.2. Phương pháp phân lập vi tảo

6


Dựa theo phương pháp phân lập của Singh và cs (2015) để tách rời các tế bào VSV,
nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để tạo khuẩn lạc riêng lẻ,
cách biệt nhau.

 Dùng pipette mao dẫn hút tế bào tảo: Dùng pipette mao dẫn hút tảo từ hỗn hợp
nhỏ lên lame, quan sát dưới kính hiển vi, dùng pipette hút tế bào tảo mong muốn cấy lên
môi trường Agar. Lập lại thao tác nhiều lần để được giống thuần.


 Kỹ thuật cấy ria trên mơi trường agar: Cho 1µl tảo hỗn hợp lên mặt đĩa agar có
mơi trường dinh dưỡng BG11 ( Phụ lục 1) đã vô trùng. Dùng que cấy trải phân tán các tế
bào tảo ra. Sau 2-3 tuần, quan sát tảo và chọn tảo từ khuẩn lạc riêng lẻ đem cấy lại vào
đĩa agar dinh dưỡng mới và lặp lại tiến trình như vậy để được giống thuần.
Nhân sinh khối giống từ cấp 1, cấp 2, cấp 3 trong các ống nghiệm 10ml, 50ml,
250ml tương ứng chu kỳ qua với môi trường BG11. Tạo nhiệt độ thích hợp 25 0C, cường
độ chiếu sáng 1700 lux, chu kì quang 16:8. Các mẫu sau khi được làm giàu tiến hành giữ
giống trên đĩa thạch BG11
2.3.3. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái
Các tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học sẽ được chụp lại, mơ tả, và so
sánh hình thái dựa vào các tài liệu phân loại vi tảo của các tác giả (Bellinger và cs Sigee,
2015; Nguyễn Văn Tuyên, 2003; Wehr và cs, 2015) và dựa trên cơ sử dữ liệu
Algaebase.org.
2.3.4. Phương pháp tách chiết DNA, khuếch đại PCR
Trong nghiên cứu chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ các mẫu vi tảo
được phân lập dựa theo phương pháp Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)
(Phillips và cs, 2001) với một số thay đổi:

 Mẫu được ủ cùng đệm CTAB ở 65oC trong 60 phút và 10 phút đem vortex một
lần để phá vỡ tế bào hiệu quả hơn.

 Phần dịch nổi phía trên được bổ sung thêm Isopropanol và được để yên trong tủ
lạnh ở nhiệt độ 5oC trong 30 phút để thu được lượng kết tủa tối đa.
Các đoạn mồi tufA – 1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 từ các nghiên cứu trước
(Fama và cs, 2002; Henrion và cs, 1992; Zou, Fei, Wang, và cs, 2016) được sử dụng cho
khuếch đại DNA bằng phản ứng trùng hợp Polymerase Chain Reaction (PCR) được miêu
tả ở (Bảng 2.2) . Tổng 20μL cho thực hiện phản ứng PCR (Aeris Thermal Cycler ESCO,
Singapore) bao gồm 10μL Mastermix; 2μL mồi xuôi và 2μL mồi ngược với nồng độ cuối
7



1μM; 2μL DNA nồng độ 50ng; 4μL nước (nước không có DNAse). Chu trình nhiệt cho
phản ứng PCR được miêu tả: giai đoạn khởi đầu ở 94oC trong 3 phút; nhân trong 35 chu
kỳ gồm giai đoạn biến tính tại 94oC trong 30s, giai đoạn gắn mồi tại 47 – 55 oC trong 45s,
giai đoạn kéo dài chuỗi tại 72 oC trong 45s; giai đoạn kết thúc kéo dài chuỗi ở 72 oC trong
5 phút; giai đoạn bảo quản sản phẩm tại 4oC.
Bảng 2.2. Thông tin các đoạn mồi được sử dụng cho nghiên cứu
Kí hiệu

Tên mồi

tufA – 1 tufA – R
tufA G – F4
tufA – 2 tufA – F
tufA – R

Trình tự mồi theo chiều 5’ – 3’
CCTTCNCGAATMGCRAAWCGC

TGAAACAGAAMAWCGTCATTATGC

rbcL – ZF

CAACCAGGTGTTCCASCTGAAG

ITS – 1

TCCGTAGGTGGACCTGCGG


ITS – 4

TCCTCCGCTTATTGATATG

rbcL – R

47°C

CCTTCNCGAATMGCRAAWCGC
CTAAAGCTGGCATGTGCCATAC

rbcL – 2 rbcL – F

53°C

GGNGCNGCNCAAATGGAYGG

rbcL – 1 rbcL – ZR

ITS

Nhiệt độ gắn mồi

CGTGACAAACTAAACAAATATGG

53°C

55°C

50°C


AAGATTTCAACTAAAGCTGGCA

2.3.5. Phương pháp hiệu chỉnh trình tự
Tất cả các sản phẩm của phản ứng PCR được gửi tới công ty Apical Scientific Sdn
Bhd ở địa chỉ Số 7 – 1, Jalan SP 2/7, Taman Serdang Perdana, Seksyen 2, 43300 Seri
Kembangan, Selangor, Malaysia tiến hành phân tích và gửi trả kết quả giải trình tự DNA
theo phương pháp Sanger. Phương pháp kiểm sốt chất lượng các chuỗi trình tự được
giải sẽ được hiệu chỉnh trên phần mềm MEGA – X (B. G. Hall, 2013). Các chuỗi được
căn chỉnh nhờ thuật toán Clustal W.
2.3.6. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Các cây phát sinh chủng được thiết lập và phân tích để biết mối quan hệ giữa các
loài và giả định tổ tiên chung của chúng được ước tính nhờ phương pháp Bootstrap. Với
số lần sao chép bootstrap 2000 lần được kiểm tra để tăng mức độ tin cậy của cây phả hệ.
Khi phân tích hồn tất, cây sẽ xuất hiện các số trên mỗi nút. Những con số đó là tỷ lệ
phần trăm bootstrap, cho thấy độ tin cậy của cụm (100%), các nút có mức độ tin cậy lớn
hơn 70% được đánh giá tốt. Thử nghiệm bootstrap không ước tính độ tin cậy tổng thể của
8


cây, thay vào đó nó ước tính độ tin cậy của từng nút. Điều đó thực sự có lợi vì nó cho biết
phần nào của cây nên tin tưởng và phần nào nên xem xét lại. Cây phát sinh gen bao gồm
các nút ngoài cùng đại diện cho chuỗi tồn tại hiện nay, các nút bên trong cùng ở gốc là tổ
tiên

chung

mà

từ


đó

tất

cả

các

chi

được

hạ

xuống

(Hall,

2013).

Chương trình ClustalX: Bootstrap Neighbors – joining tree được xử dụng, loại
Nucleotit thay thế, phương thức p – distance.

9


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae
Kết quả phân lập thu được tại các địa điểm ở thành phố Đà Nẵng, nghiên cứu ghi

nhận 6 loài khác nhau thuộc họ Scenedesmaceae. Các chủng vi tảo được kí hiệu là S1,
S2, S3, S4, S5, S6.
Đặc điểm hình thái của 6 lồi khác biệt nhau. Tế bào của đa số chủng trong bộ
giống có hình bầu dục, hình thoi hoặc hình lưỡi liềm. Ngồi ra, tính đa dạng về hình thái
tế bào ở sự kết hợp hay không kết hợp và kiểu kết hợp giữa các tế bào. Là tảo tập đoàn,
kết hợp với nhau thành cặp, thành 4 hay 8 tế bào gắn liền nhau. Tế bào cũng dính với
nhau trong một hàng hoặc xếp so le. Tế bào của một số chủng có gai ở ngoài hay roi để di
chuyển. Khuẩn lạc của các chủng có màu xanh nhưng mức độ đậm nhạt có khác nhau
giữa các chủng và kích thước khuẩn lạc có sự thay đổi lớn nhỏ tùy lồi.
Bảng 3.1. Bảng tóm tắt danh mục các lồi được phân lập
Kí hiệu

Đặc điểm hình thái

lồi
S1

Tập đồn khơng bắt buộc bao gồm 2, 4 TB xếp tuyến
tính. TB có hình dạng trứng hoặc elip. TB nằm ngồi
có gai dài ở hai đầu và gai ngắn ở mặt ngoài. Chiều
dài tế bào 4 ± 0,5μm, chiều rộng TB 2 ± 0,2μm.

S2

Các TB xếp theo dạng khơng gian gồm 2, 4, 6 TB có
hình vịng cung, khơng có răng và gai với chiều dài
TB khoảng 15 – 17μm, và bề ngang TB 3 – 5μm

10


Hình ảnh


S3

Tập đồn gồm 8 TB,các TB dính với nhau ở
sườn,theo hình zíc zắc, đầu TB hơi thắt nhọn, kích
thước chiều dài 23,7 ± 0,8μm, bề ngang 5,2 ± 0,7 μm.

S4

Tập đồn gồm 2, 4, 6, 8 TB, dính với nhau ở sườn,
với chiều dài 13 ± 0,5μm, và bề ngang 6 ± 1 μm.

S5

Tập đoàn gồm 4 TB, các TB dính với nhau ở sườn,
TB hình elip hẹp, đầu TB hơi thắt nhọn, tập đoàn hẹp.
TB bên trong thẳng, TB bên ngồi hình vịng cung,
thành TB nhẵn , khơng có răng và gai, TB với kích
thước chiều dài 13 ± 1,02μm và chiều ngang 5,1 ±
0,6μm.

S6

Cộng đơn bào gồm 2 – 4 – 8 TB. Các TB gắn với
nhau ở phần giữa TB, sắp xếp trên 1 hàng. TB hình
thoi, đầu thắt nhọn, đôi khi TB hơi uốn cong vào phía
trong. Thành TB nhẵn, thể màu nằm ở ngoại vi, có 1
hạt tạo bột, kích thước TB với chiều dài 14 ± 0,5 và

chiều rộng 4 ± 1,05µm.

11


3.2. Đánh giá hiệu quả của các đoạn mồi ITS, rbcL, tufA
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi tảo họ Scenedesmaceae
Chúng tôi đã tiến hành thực hiện tách chiết DNA tổng số từ 6 mẫu vi tảo họ
Scenedesmaceae khác nhau, được đánh dấu S1, S2, S3, S4, S5, S6. Kết quả ở Hình 3.1
cho thấy sản phẩm DNA tổng số sau khi tách chiết bởi phương pháp CTAB thể hiện được
các vạch DNA ở 6 mẫu vi tảo họ Scenedesmaceae, đảm bảo được chất lượng cho các
bước nghiên cứu tiếp theo. Bên cạnh đó, có những giếng với những vạch màu sáng kéo
dài, đã thu được lượng DNA nhưng vẫn lẫn nhiều tạp chất khiến vạch bị nhịe. Ngồi ra
có một số mẫu màu khá tối, bởi lượng DNA thu được ít, khiến cho vạch khơng sáng rõ,
cịn mờ, lẫn nhiều tạp chất như protein hay RNA.

Hình 3.1. Điện di DNA tổng số từ 6 mẫu vi tảo họ Scenedesmaceae khác nhau.
Lane 1: S1; lane 2: S2, lane 3: S3; lane 4: S4; lane 5: S5; lane 6: S6.

3.2.2. Khả năng khuếch đại các vùng trình tự gen ITS, rbcL, tufA
Để phân tích định danh 6 mẫu vi tảo họ Scenedesmaceae, chúng tôi đã sử dụng các
cặp mồi ở các vùng trình tự tufA – 1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 (Bảng 2.2.). Kết
quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, cả 5 đoạn mồi được sử dụng đều xuất hiện phân
đoạn DNA được nhân bản với chiều dài lần lượt là khoảng 800bp, 1000bp, 900 bp, 600
bp, 700 bp. Kết quả ở Hình 3.2 cho thấy sản phẩm khuếch đại của các vùng gen tufA –1,
tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 tương ứng với các kí hiệu A, B, C, D, E.

12



B

A

E

Hình 3.2. Sản phẩm khuếch đại PCR sử dụng 5 cặp mồi khác nhau.
Lane M: Ladder, 2kb; Lane 1, S1; lane 2, S2; lane 3, S3; lane 4, S4; lane 5, S5; lane 6, S6.

13


a. Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S1 (Bảng 3.2).
Sau khi có kết quả trình tự gen tufA – 1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 đối với
mẫu S1, chúng tôi đã tiến hành truy cập GenBank trên NCBI để so sánh trình tự tương
đồng của họ Scenedesmaceae với các chủng tham khảo. Kết quả BLAST cho thấy sự
hiện diện thành công đến việc định danh cấp họ Scenedesmaceae sp. của vùng khuếch đại
tufA – 1 và tufA – 2 nhưng chưa xác định được chính xác tên cấp độ chi, lồi.
Bên cạnh đó, vùng gen ITS có mức độ tương đồng 99,03% hệ gen thuộc chi
Pectinodesmus sp.. Tuy nhiên, về mặt hình thái nhận định ban đầu hồn tồn khơng
tương ứng. Bởi vì, vùng gen ITS khá giống nhau về khả năng bắt cặp, dẫn đến khuếch đại
với sự tương đồng cao ở chi Pectinodesmus sp. Do vậy, sử dụng ITS trong việc định danh
vi tảo S1 hồn tồn khơng phù hợp. Tuy nhiên theo An và cs (1999) cho rằng việc sử
dụng đoạn mồi ITS – 2 rất phù hợp để giải quyết mối quan hệ của hai chi Scenedesmus
và Desmodesmus khi so sánh về sự khác biệt đáng kể ở chiều dài của vùng ITS – 2.
Tuy nhiên, vùng gen rbcL – 2 có mức độ tương đồng đạt 93,52% ở hệ gen loài D.
subspicatus trùng với miêu tả về hình thái như miêu tả trên cơ sở dữ liệu và tài liệu tham
khảo trên Algaebase.org. Cho thấy rằng, vùng gen rbcL – 2 là vùng gen có thể phân biệt
được loài D. Subspicatus.


14


Bảng 3.2. Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của vùng gen mẫu S1
Vùng gen

Kết quả định danh

So sánh mức độ tương đồng trên
NCBI
Tỷ lệ (%)

tufA – 1

Scenedesmaceae sp.

tufA – 2
rbcL – 1

78,85

Nguồn tham khảo

Mã số
HG514388.1

77,99
Desmodesmus sp.

93,02


KF975599.1
D. abundans (Kirchner) E. H.
Hegewald 2000
/>ecies/detail/?species_id=42384&sk=0&from=results

ITS

Pectinodesmus sp.

99,03

AB917103.1

rbcL – 2

D. subspicatus

93,52

KU847995.1

P. pecinatus (Hegewald và cs,
2010)

D. subspicatus (Chodat)
E.Hegewald & A.W.F.Schmidt in
E.Hegewald 2000: 17
/>cies_id=42443&sk=0&from=results


15