TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA NÔNG LÂM
--------

PHAN NHẬT BẢO TRÂM

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC ĐẾN KHẢ NĂNG
KHỬ TRÙNG MẪU VÀ NHÂN NHANH CHỒI HOA
CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) IN VITRO

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

Lâm Đồng, 2021


TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA NÔNG LÂM
--------

PHAN NHẬT BẢO TRÂM

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC ĐẾN KHẢ NĂNG
KHỬ TRÙNG MẪU VÀ NHÂN NHANH CHỒI HOA
CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) IN VITRO

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS. TRƯƠNG THỊ LAN ANH

KHÓA 2017-2021

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Những kết quả và các số liệu trong
chuyên đề chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào, tơi hồn tồn chịu trách
nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này.
Đà lạt, ngày tháng năm

Phan Nhật Bảo Trâm



LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập và thực hiện chuyên đề tốt nghiệp này, tôi đã nhận được
rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ từ phía thầy cô, gia đình, bạn bè,... Tơi xin chân thành
cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong
suốt q trình học tập tại trường và quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức,
kỹ năng thực hành là hành trang cho cơng tác của tơi sau này.
Xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô Trương Thị Lan Anh đã chỉ bảo động viên, tận
tình hướng dẫn, bỏ nhiều cơng sức để giúp tơi hồn thành chun đề này.
Xin gửi lời cảm ơn tới cha và mẹ, gia đình, bạn bè đã hết lòng yêu thương, lo lắng,
động viên và giúp đỡ tơi trong q trình học tập nghiên cứu để hoàn thành chuyên đề
này.
Đà Lạt,

ngày

tháng năm

Phan Nhật Bảo Trâm


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Các chất khử trùng được sử dụng trong việc khử trùng mẫu với nồng độ và
thời gian khác nhau .......................................................................................................
.........................13
Bảng 2: Các nồng độ nano bạc khác nhau được bổ sung vào môi trường nuôi cấy . .13
Bảng 3: Hiệu quả khử trùng mẫu chồi đỉnh sinh trưởng hoa cẩm chướng của nano bạc
ở các nồng độ khác nhau sau 25 ngày nuôi cấy........................................................ 15
Bảng 4: Ảnh hưởng của nano bạc đến khối lượng tươi và khối lượng khô cây hoa cẩm

chướng nuôi cấy trong môi trường có bổ sung nano bạc sau 30 ngày ni cấy ........22


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khử trùng khác nhau đến số chồi
trung bình đối với mẫu chồi đỉnh sinh trưởng hoa cẩm chướng sau 25 ngày nuôi cấy
...................................................................................................................................17
Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khử trùng khác nhau đến số chồi
trung bình đối với mẫu chồi đỉnh sinh trưởng hoa cẩm chướng sau 25 ngày nuôi cấy....
....................................................................................................................................18
Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của nano bạc đến chiều cao cây hoa cẩm chướng ni cấy trong
mơi trường có bổ sung nano bạc sau 30 ngày nuôi cấy ..............................................20
Biểu đồ 4: Ảnh hưởng của nano bạc đến số chồi cây hoa cẩm chướng ni cấy trong
mơi trường có bổ sung nano bạc sau 30 ngày nuôi cấy ..............................................21


DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1: Mẫu cây hoa cẩm chướng tại vườn ở phường 11, Đà Lạt............................. 3
Hình 2: Chồi đỉnh sau khi cắt ..................................................................................12
Hình 3: Hình ảnh mẫu chồi cẩm chướng .................................................................16
Hình 4: Sự sinh trưởng của chồi hoa cẩm chướng in vitro khi được xử lý ở các nồng
độ nano bạc khác nhau sau 25 ngày nuôi cấy.......................................................... 17
Hình 5: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi hoa cẩm chướng nuôi cấy trong môi
trường bổ sung nano bạc ở các nồng độ khác nhau sau 30 ngày ni cấy.................21
Hình 6: Sự phát triển bất thường cây hoa cẩm chướng ở nồng độ nano bạc 8 ppm. .22


CÁC TỪ VIẾT TẮT
BA


6 – benzylaminopurine

IBA

Indol – 3 – butyric acid

MS

Murashinge and Skoog, 1962

NAA

α – naphthalene acetic acid

Kinetin

6 – furfuyl amino purine

PLB

Protocorm like body.

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid



MỤC LỤC

MỞ ĐẦU....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................3
1.1. Giới thiệu về hoa cẩm chướng..............................................................................3
1.1.1. Phân loại.................................................................................................................. 3
1.1.2. Nguồn gốc...............................................................................................................3
1.1.3. Đặc điểm hình thái..................................................................................................4
1.1.4. Điều kiện ngoại cảnh...............................................................................................4
1.2. Các phương pháp nhân giống................................................................................6
1.2.1. Phương pháp nhân giống hữu tính...........................................................................6
1.2.2. Phương pháp nhân giống vô tính.............................................................................6
1.3. Nano bạc...............................................................................................................7
1.3.1. Giới thiệu về nano bạc.............................................................................................7
1.3.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu áp dụng nano bạc vào nuôi cấy in vitro...........8
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................11
2.1. Địa điểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu.............................................................11
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu..............................................................................................11
2.1.2. Thời gian nghiên cứu.............................................................................................11
2.1.3. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu.............................................................................11
2.2. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................11
2.3. Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu............................................................11
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................11
2.3.2. Chỉ tiêu theo dõi....................................................................................................13
2.3.3. Điều kiện nuôi cấy.................................................................................................14
2.3.4. Xử lý số liệu..........................................................................................................14
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................15
3.1 Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng.........15
3.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khác nhau sự nhân nhanh chồi đỉnh hoa

cẩm chướng:..............................................................................................................20
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................25
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................26
PHỤ LỤC.................................................................................................................. 30


MỞ ĐẦU
Cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) là một loại hoa đẹp được trồng phổ biến ở nhiều
nước có nguồn gốc xuất phát từ Địa Trung Hải và du nhập vào Việt Nam đầu thế kỷ 19.
Hoa cẩm chướng luôn được thị trường ưa chuộng bởi nó có sự đa dạng về màu sắc, tươi
lâu và thuận lợi cho việc bảo quản, vận chuyển xa. Đặc biệt Đà Lạt là một trong những
thành phố có diện tích trồng hoa cẩm chướng lớn, cho năng suất và chất lượng kinh tế
cao, không chỉ sử dụng làm hoa cắt cành mà còn trồng làm hoa chậu chưng bày. Để đáp
ứng nhu cầu thị trường nhiều kỹ thuật nhân giống hoa cẩm chướng đã được áp dụng.
Hình thức nhân giống truyền thống là phương pháp nhân giống hữu tính bằng cách gieo
hạt. Tuy khả năng nhân giống nhanh cho số lượng nhiều nhưng do hạt hoa cẩm chướng
nhỏ, khơng hồn chỉnh nên tỷ lệ nảy mầm thấp dẫn đến cây con không đồng đều, năng
suất thấp. Cây con mọc từ hạt thường không duy trì được đặc tính tốt của cây mẹ, tỉ lệ
biến dị cao (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005). Vì vậy trong sản xuất, phương
pháp nhân giống phổ biến được sử dụng là phương pháp nhân giống vô tính. Có 2 cách
nhân giống vơ tính là giâm cành và nuôi cấy mô. Đối với giâm cành hoa cẩm chướng tuy
có thời gian ngắn, thiết bị đơn giản nhưng liên tục giâm cành sẽ dẫn đến thối hóa giống
cây sinh trưởng kém, tính chống chịu sâu bệnh giảm, sản lượng hoa thấp. Để cho chất
lượng cây giống tốt nhất thì biện pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là nuôi cấy mô
hoa cẩm chướng. Tuy nhiên việc nuôi cấy mơ hoa cẩm chướng cần có kỹ thuật cao, thời
gian dài và chi phí đầu tư ban đầu cao nhưng hệ số nhân giống cao, sạch bệnh, cây sinh
trưởng mạnh, tính chống chịu tốt, cây con nuôi cấy mô giống với cây mẹ và mang những
đặc tính tốt của cây mẹ.
Vì thế đối với nghiên cứu này sẽ sử dụng kỹ thuật vi nhân giống hoa cẩm chướng để tạo
ra nguồn cây con sạch bệnh và đồng nhất. Bước đầu tiên, một trong những bước quan

trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là tiến hành thu thập mẫu cây nuôi cấy từ cây mẹ
và khử trùng mẫu. Việc khử trùng mẫu phải giữ được bản chất sinh học của nó vì thế
khơng thể khử bằng nhiệt mà phải khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung
dịch khử trùng thường dùng là hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, chlorua thủy
ngân,… Với việc sử dụng các chất khử trùng này với nồng độ cao tùy vào từng loại mẫu
1


cấy sẽ đem lại hiệu quả khử trùng mẫu rất tốt nhưng khả năng gây tổn thương mẫu cũng
tăng theo kèm theo đó là sự gây hại đối với người sử dụng đặc biệt là Chlorua thủy ngân,
không những vậy các chất khử trùng cịn gây ơ nhiễm khi thải ra mơi trường nước, đất.
Để khắc phục tình trạng đó, hiện nay trên nhiều nghiên cứu đối với môi trường nói chung
và cây trồng nói riêng rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng nano bạc dùng làm chất khử trùng
và đã đem lại hiệu quả đáng mong đợi. Theo Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2018) việc sử
dụng nano bạc nồng độ 0,2 g/L trong 20 phút có thể thay thế các chất khử trùng thông
dụng (HgCl2, Ca(ClO)2) trong vi nhân giống cây dâu tây. Trong nghiên cứu của Bùi Thị
Thanh Phương và cộng sự (2020), việc sử dụng dung dịch nano bạc với nồng độ 150 ppm
trong thời gian 40 phút để khử mẫu có thể thay thế hiệu quả các chất khử trùng khác trong
nhân giống in vitro cây Trầu tiên. Ngồi ra, nano bạc cịn ảnh hưởng đến quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây in vitro. Bổ sung nano bạc kết hợp với BA hoặc IBA cho hiệu
quả tốt hơn việc sử dụng BA (2 mg/l) riêng lẻ trong nhân chồi và IBA (0,5 mg/l) riêng lẻ
trong tạo rễ, sinh trưởng và phát triển cây con hoa hồng in vitro (Dương Tấn Nhựt và cs.,
2015).
Vì vậy, nghiên cứu này đã được thực hiện, nhằm khảo sát và đánh giá khả năng thay thế
các chất khử trùng thông dụng Ca(ClO) 2 hay HgCl2 bằng nano bạc trong giai đoạn khử
trùng mẫu cấy và nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc khác nhau lên sự sinh
trưởng và phát triển của chồi cây hoa cẩm chướng trong điều kiện nuôi cấy in vitro.

2



CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu về hoa cẩm chướng

1.1.1. Phân loại
Giới:

Plantea

Nhánh:

Tracheophyta

Nhánh:

Angiospermae

Bộ:

Caryophyllales

Họ:

Caryophyllaceae

Chi:

Dianthus


Lồi:

Dianthus caryophyllus

Hình 1: Mẫu cây hoa cẩm chướng tại vườn ở phường 11, Đà Lạt
1.1.2. Nguồn gốc
Cây cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) hay còn gọi là hoa Phăng, có nguồn ở Địa
Trung Hải, được bắt đầu ni trồng từ thế kỷ 16. Năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã
tạo ra giống cẩm chướng Remontant cây cao ra hoa nhiều lần trong năm. Đến 1846 họ đã
3


nuôi trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra hoa
quanh năm. Năm 1852, cẩm chướng từ Châu Âu được nhập vào nước Mỹ. Tại đây, nhà
nước và rất nhiều công ty đã tạo ra hàng trăm giống hoa cẩm chướng với các hình dạng và
màu sắc khác nhau. Hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam từ đầu
thế kỷ 19, chủ yếu trồng ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, SaPa và những năm
gần đây đã được trồng ở khắp các địa phương trong cả nước (Đặng Văn Đông và Đinh
Thế Lộc, 2005).
1.1.3. Đặc điểm hình thái
Cẩm chướng là loại cây thân thảo, thân đứng thẳng phân nhánh nhiều, cây cao 70 – 100
cm và nửa hóa gỗ, lá hình lơng chim, dầy, cuống hoa có từ 16 – 18 đốt đối với hoa to và
20 – 22 đốt đối với hoa nhỏ (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005).
Rễ cẩm chướng phân bố tập trung ở tầng đất mặt 20cm, một số ít ăn sâu tới 10-50cm. Ở
trạng thái bình thường, rễ và tán cây phát triển theo tỷ lệ tương đương. Nếu đất nhiều
phân, nhiều nước, rễ sinh trưởng không tốt. Nhiệt độ đất cao cũng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng, phát triển của rễ.
Sau khi ra được 10-20 đôi lá, trên đỉnh ngọn sẽ xuất hiện nụ hoa. Mỗi nách trên thân
chính thường có một mầm to, dài và một mầm nhỏ, ngăn (riêng Cầm Chưởng nhiều đầu

hoa thì cả 2 nằm nách đều dài như nhau). Những mầm nách phía trên thường có nụ sớm
và phát triển thành cành hoa, những mầm nách phía dưới ra nụ sau và trở thành những
mầm dinh dưỡng. Tốc độ sinh trưởng của lá phụ thuộc vào thời tiết: mùa xuân, mùa hè
thường từ 1-5 ngày, mùa thu, mùa đông từ 7-10 ngày ra một đơi lá. Trong đó 8 đơi lá đầu
(sát gốc) có mầm nách ở trạng thái dinh dưỡng từ lá 15 đến lá 18 mầm nách có thể phát
triển thành nụ hoa.
1.1.4. Điều kiện ngoại cảnh
Cẩm Chưởng là loại cây ưa sáng và thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài. Thời gian
chiếu sáng trong ngày càng dài, cây càng nhanh phân hóa hoa. Hoa nở đều, chất lượng
hoa tốt. Lượng chất khô và tốc độ sinh trưởng của cây tương quan thuận với cường độ ánh
sáng. Tuy nhiên, ở thời kỳ ra hoa rộ vào mùa nóng, lúc giữa trưa, cường độ áng sáng
4


mạnh, cần che bớt ánh sáng cho cây vì ánh sáng quá mạnh sẽ làm cho cánh hoa dễ bị nhạt
màu và cháy, ảnh hưởng đến chất lượng hoa. Các thí nghiệm nghiên cứu cho thấy chiếu
sáng bổ sung không những kích thích đốt dài ra, ức chế cảnh nách mà còn làm tăng đường
kính hoa, làm cho màu hoa tươi hơn. Trồng trong nhà lưới thì cần chọn nilon có độ thấu
quang cao và thường xuyên rửa bụi bẩn để tăng cường độ chiếu sáng cho cây. Ngoài ra,
mật độ trồng, số cành nhiều, ít, lá to, nhỏ, dài, ngắn khác nhau cũng ảnh hưởng đến sự
hấp thu ánh sáng của các tầng lá. Vì vậy, để nâng cao chất lượng hoa ta phải bố trí mật độ
vừa phải và thường xuyên tỉa bớt cành lá cho cây.
Cẩm Chưởng là cây ưa khí hậu mát mẻ. Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 15-20 0C, nhưng
trong phạm vi từ 10-150C cây vẫn sinh trưởng bình thường và cho chất lượng hoa tương
đối tốt. Nếu vượt quá 300C thì cây sinh trưởng kém, thân lá nhỏ, hoa nhỏ, sản lượng và
chất lượng hoa giảm, tuổi thọ hoa ngắn; dưới 100C cây sinh trưởng yếu, sản lượng giảm
rõ rệt. Thông thường chênh lệch nhiệt độ ngày đêm lớn cây sinh trưởng tốt nhưng không
phải chênh lệch nhiệt độ ngày đêm càng lớn thì càng tốt. Nhìn chung nhiệt độ chênh lệch
ngày đêm khoảng 100C là tốt nhất, nếu không chất lượng hoa kém, số hoa mù cao. Nhiệt
độ không khí và nhiệt độ lá thường không giống nhau. Chiếu sáng mạnh, nhiệt độ lá cao

hơn nhiệt độ không khí: khi không khí khơ ở nơi thống khí, nhiệt độ lá thấp hơn nhiệt độ
không khí. Về mùa hè ánh sáng mạnh, sự thoát hơi nước của lá sẽ làm giảm nhiệt độ lá.
Vì vậy, khi tăng lưu thơng khơng khí cần phải đảm bảo độ ẩm đất để cung cấp đủ nước
cho cây, có lợi cho sự thốt hơi nước của cây. Khi nước trong đất khơng đủ, thốt hơi
nước giảm thì nhiệt độ sẽ tăng. Vào ngày trời nắng, che bớt ánh sáng để hạ nhiệt độ sẽ có
lợi cho sự sinh trưởng của Cẩm Chưởng, tăng chất lượng hoa, giảm số cành hoa có chất
lượng kém xuống mức thấp nhất.
Hàm lượng nước trong lá Cẩm Chướng chiếm khoảng 70 – 80 %, trong cành là 68 – 70%,
trong rễ 80%. Vì vậy khi cây thiếu nước thì quang hợp giảm, nước điều hòa nhiệt lượng
cho cây khi trời nắng nóng. Sự thốt hơi nước của Cẩm Chưởng phụ thuộc vào cường độ
ánh sáng. Thơng thường lượng hơi nước thốt qua lá chủ yếu từ 11 giờ đến 16 giờ bằng
57,8% trong đó từ 12 13 giờ chiếm 12,6%, từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau chỉ chiếm
3,3% tổng lượng nước thốt hơi trong ngày. Vì vậy, tưới vào lúc chiều tối là tất nhất.
5


Độ pH thích hợp trong đất cho cẩm chướng là 6 – 6,5. Đối với đất liên tục trồng cẩm
chướng thì phải khử trùng tiêu độc hoặc luân canh.
1.2.

Các phương pháp nhân giống

1.2.1. Phương pháp nhân giống hữu tính
Hình thức nhân giống truyền thống là phương pháp nhân giống hữu tính bằng cách gieo
hạt. Tuy khả năng nhân giống nhanh cho số lượng nhiều nhưng do hạt hoa cẩm chướng
nhỏ, khơng hồn chỉnh nên tỷ lệ nảy mầm thấp dẫn đến cây con không đồng đều, năng
suất thấp. Do tỉ lệ kết hạt của hoa cẩm chướng rất thấp, cây con mọc từ hạt thường khơng
duy trì được đặc tính tốt của cây mẹ hạt giống đời sau biến bị lớn, cây con sinh trưởng rất
chậm. Vì vậy trong sản xuất rất ít nhân giống bằng hạt (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc,
2005).

1.2.2. Phương pháp nhân giống vơ tính
1.2.2.1.Phương pháp giâm cành
Đối với cây cẩm chướng cần có vườn ươm cây mẹ lấy cành riêng, vì chất lượng cây mẹ
khác nhau sẽ ảnh hưởng đến tỷ lệ và chất lượng cây giâm cũng khác nhau. Khi cây mẹ có
khoảng 4 – 5 đốt thì tiến hành bấm ngọn để lấy cành giâm. Chỉ lấy mầm nách từ đốt thứ 6
trở xuống, tốt nhất là lấy mầm nách ở đốt thứ 2. Ở các đốt càng sát ngọn chính thì khả
năng ra rễ kém và sau này cây sinh trưởng yếu, hơn nữa từ đốt thứ 7 thường ở giai đoạn
sinh thực sẽ cho hoa sau này. Trước khi cắt cành 1 – 2 ngày phải phun thuốc phòng trừ
sâu bệnh cho cây mẹ. Nên cắt cành vào chiều mát (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc,
2005).
1.2.2.2.Phương pháp nuôi cấy mô
Đây là phương pháp khoa học hiện đại, phục vụ cho sản xuất với quy mô công nghiệp
lớn. Ưu điểm của phương pháp này là hệ số nhân giống cao, các cây đều sạch bệnh, chất
lượng tương đối đồng đều, đồng nhất về mặt di truyền và hiệu quả trồng tăng 150-200%
so với phương pháp trồng thông thường.

6


Để cho chất lượng cây giống tốt nhất thì biện pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là
nuôi cấy mơ hoa cẩm chướng và đã có nhiều nghiên cứu đưa ra quy trình cụ thể. Như theo
Aamir Ali và cộng sự (2008) đã tiến hành nuôi cấy mô hoa cẩm chướng với mẫu ban đầu
là chồi đỉnh và chồi nách của cây, sử dụng dung dịch khử trùng là natri hypoclorit 7,5 %
trong 15 phút và tiến hành rửa sạch lại với nước cất 3 lần. Sau đó tiến hành các thí nghiệm
tìm ra nồng độ BAP thích hợp nhất để cây bật chồi và nhân nhanh. Kết quả thu được,
phản ứng hình thành chồi tốt nhất thu được sau 6 ngày nuôi cấy từ mô phân sinh đỉnh là
mơi trường MS có bổ sung 4 mg/L BAP và cho hiệu quả nhân nhanh tốt nhất ở môi
trường MS có bổ sung 1mg/L BAP. Nghiên cứu của Khatun và cộng sự (2013) đã đưa ra
một trình ni cấy mơ hoa cẩm chướng, với việc khử trùng mẫu là chồi đỉnh và chồi nách
của hoa cẩm chướng bằng dung dịch HgCl 2 0,1%, bổ sung thêm 2 giọt Tween 20 trong 60

phút sau đó tráng lại bằng nước cất vơ trùng 5 lần. Tiếp tục làm các thí nghiệm tìm ra
nồng độ BAP thích hợp cho cây phát triển, ở bài nghiên cứu này cũng đã đưa ra nồng độ
BAP tốt nhất cho cây bật chồi và nhân nhanh tốt nhất ở mơi trường MS có bổ sung 1mg/L
BAP. Đối với một nghiên cứu trong nước cũng đã đưa ra được quy trình ni cấy mơ hoa
cẩm chướng, kết quả thí nghiệm tốt nhất khi khử trùng mẫu chồi đỉnh và chồi nách hoa
cẩm chướng là khử trùng 2 lần với dung dịch HgCl 2 0,1% mỗi lần 5 phút và môi trường
nuôi cấy khởi đầu là MS bổ sung 0,3mg/1 Kinetin, 0,1mg/l NAA, 20g/1 đường, môi
trường thích hợp cho nhân nhanh và kích thích tăng trường chối MS bổ sung 0,05mg/1
BAP, 0,1mg/l Kinetin, 0,1mg/l NAA, 30g/1 đường ( Nguyễn Thị Thu Hằng, 2013).
1.3.

Nano bạc

1.3.1. Giới thiệu về nano bạc
Nhờ vào hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao, hạt nano bạc đã và đang thu hút được
nhiều sự chú ý, đầu tư trong nghiên cứu và ứng dụng loại vật liệu này. Các chế phẩm nano
bạc-chitosan chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ có hiệu lực ức chế nấm Phytophthora
capsici lên đến 100% tại nồng độ 40 ppm với kích thước hạt 5 nm (Lê Quang Luân và cs.,
2014). Nano bạc dạng keo kích thước trung bình 52 nm ở nồng độ 180 ppm đã ức chế trên
90% sự phát triển của nấm Phomopsis sp. Trên hạt đậu tương (Mendes và cs., 2014). Vật
7


liệu nano Ag/CTS/bentonite ở nồng độ bạc 400 ppm có hiệu quả ức chế nấm Rhizoctonia
solani đạt 92,82% và nấm F. Oxysporum đạt 66,70% (Nguyễn Hoài Châu và cs., 2017).
Các nhà khoa học cho rằng, khả năng ức chế của dung dịch nano bạc đối với sự phát triển
của nấm bệnh là nhờ sự chuyển hóa từ Ag0 thành ion Ag+ tấn công đồng thời nhiều vị trí
trong tế bào vi sinh vật, vơ hiệu hóa các tổ chức chức năng quan trọng trong tế bào, làm
ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp thành tế bào, quá trình vận chuyển các chất qua màng,
tổng hợp và dịch mã axit nucleic (RNA, DNA), tổng hợp protein cũng như vận chuyển

điện tử qua màng. Ion bạc có ái lực mạnh đối với các nhóm chức mang điện tích âm trên
phân tử sinh học, đó là các nhóm -SH, -COOH, PO 43 và các nhóm chức tích điện âm khác
phân bố khắp trong tế bào vi sinh vật (Công Hồng Hạnh và cs., 2020). Chính phản ứng
liên kết đó đã làm thay đổi cấu trúc của các đại phân tử, làm chúng trở nên mất tác dụng
trong tế bào.
Trong những năm gần đây, dung dịch nano bạc với các hạt nano có diện tích bề mặt lớn
làm tăng khả năng tiếp xúc và sự bám dính trên bề mặt tế bào dẫn đến hiệu quả tác động
cao và đã được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô (Mahna và cs., 2013; Dương Tấn Nhựt
và cs., 2017; Đồng Huy Giới, Bùi Thị Thu Hương, 2019). Nhờ đặc tính kháng nấm, kháng
khuẩn mà không gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và môi trường vì vậy nano
bạc đang là một hướng nghiên cứu mới đang được mọi người hướng đến và áp dụng trong
tương lai.
1.3.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu áp dụng nano bạc vào nuôi cấy in vitro
Nhờ vào khả năng kháng nấm, khuẩn vượt trội của mình, nano bạc đã được lựa chọn làm
đối tượng nghiên cứu cho nhiều nghiên cứu về khả năng khử trùng môi trường và mẫu
trong nuôi cấy mô. Theo Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2017), nghiên cứu nano bạc có
hiệu quả trong việc khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro không hấp khử trùng, đặc biệt
đối với môi trường nuôi cấy cây cúc khi bổ sung 4 ppm nano bạc, không bổ sung than
hoạt tính và nồng độ đường từ 0 - 20 g/l vào môi trường nuôi cấy không cấy mẫu cho hiệu
quả khử trùng 100% sau 4 tuần. Theo Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2018) Việc sử dụng
nano bạc nồng độ 0,2 g/L trong 20 phút có thể thay thế các chất khử trùng thông dụng
8


(HgCl2, Ca(ClO)2) trong vi nhân giống cây dâu tây. Sử dụng dung dịch nano bạc với nồng
độ 150 ppm trong thời gian 40 phút để khử mẫu có thể thay thế hiệu quả các chất khử
trùng khác trong nhân giống in vitro cây Trầu tiên (Bùi Thị Thanh Phương và cs., 2020).
Ngồi khả năng khử trùng tốt, Nano bạc cịn có tác động tích cực lên q trình sinh
trưởng và phát triển của một số lồi thực vật ni cấy in vitro. Theo nghiên cứu của Hà
Thị Mỹ Ngân và cộng sự (2019), sử dụng nano bạc trong vi nhân giống hoa hồng đã giúp

cải thiện hệ số nhân chồi, gia tăng sự sinh trưởng và phát triển của chồi ni cấy; bên
cạnh đó, nano bạc cịn hạn chế hiện tượng vàng lá, rụng lá chồi nuôi cấy thông qua ức chế
hoạt động của khí ethylene và hoạt độ enzyme thủy phân cellulase và pectinase, đây là hai
enzyme quan trọng trong tiến trình cảm ứng sự rụng và già hóa của mơ. Cây con có nguồn
gốc từ ni cấy in vitro trên mơi trường có bổ sung nano bạc cho tỷ lệ sống, khả năng
thích nghi cao ở giai đoạn vườn ươm.
Các ion bạc ở dạng muối bạc nitrate, bạc thiosulphate được ứng dụng nhiều trong nuôi
cấy mô tế bào thực vật nhờ đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn mà không gây ảnh hưởng
đến sức khoẻ của con người (Abdi, 2012). Mặt khác, các ion bạc cịn đóng vai trị quan
trọng trong sự phát triển của mô sẹo, tái sinh chồi trong ni cấy in vitro (Bais và cs.,
2000), hình thành rễ và tạo cây hoàn chỉnh trong vi nhân giống (Reddy và cs., 2001). Tuy
nhiên, các ion bạc luôn đi kèm với các cation tồn tại ở dạng muối (bạc nitrate, bạc
thiosulphate); điều này ảnh hưởng đến hiệu quả khử trùng và hấp thu, chuyển hoá của ion
bạc. Để khắc phục tình trạng trên, dung dịch nano bạc với các hạt kích thước từ 1 đến
20nm và với kích thước cực kỳ nhỏ này, các hạt nano có diện tích bề mặt lớn làm tăng
khả năng tiếp xúc và sự bám dính trên bề mặt tế bào dẫn đến hiệu quả tác động cao.
Rostami và Shahsavar (2009) đã bổ sung nano bạc ở nồng độ 4 mg/l vào môi trường nuôi
cấy cây ôliu cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
và phát triển của cây. Nano bạc có ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt Bacopa monnieri,
cảm ứng tổng hợp protein và carbohydrate, giảm lượng phenol tổng và hoạt động của các
enzyme peroxidase (Krishnaraj và cs., 2012). Hiệu quả của nano bạc trong việc tăng
cường khả năng sinh trưởng, phát triển và giải quyết một số bất lợi không mong muốn
trên một số loại thực vật in vitro cũng đã được báo cáo. Nano bạc cũng làm tăng cường
9


các chỉ tiêu sinh trưởng và các thuộc tính hóa học ở lồi cây Brassica juncea, đậu và ngơ
(Sharma và cs., 2012).
Với khả năng kháng nấm, kháng khuẩn không gây hại tới con người, kích thích sự sinh
trưởng và phát triển của cây in vitro. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo

sát và đánh giá khả năng thay thế chất khử trùng thông dụng Ca(ClO) 2 bằng nano bạc
trong giai đoạn khử trùng mẫu cấy và nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc khác nhau lên
sự sinh trưởng và phát triển của chồi cây hoa cẩm chướng trong điều kiện nuôi cấy in
vitro.

10


CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện tại phịng Cơng nghệ giống cây trồng, Khoa Nông Lâm,
Trường Đại Học Đà Lạt.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 1 năm 2021 đến tháng 5 năm 2021
2.1.3. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
Mẫu là chồi đỉnh được lấy từ vườn của nông hộ tại Đà Lạt (phường 11, đường Huỳnh Tấn
Phát, Đà Lạt) sau đó đem về phịng thí nghiệm.
Dung dịch nano bạc với các hạt nano bạc có kích thước trung bình ≤ 20 nm do
Viện Công nghệ Môi trường (Viện Hàn Lâm Khoa Học và Cơng Nghệ Việt Nam, 18
Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội) cung cấp với nồng độ 500 ppm được pha thành các
nồng độ khác nhau: 25ppm, 50ppm, 75ppm, 100ppm, 125ppm để khử trùng mẫu.
Môi trường nuôi cấy: mơi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung
1,0mg/L BA, 30g/L đường và 8,6g/L agar. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH
5,8 trước khi hấp khử trùng.
2.2. Nội dung nghiên cứu
-

Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng
Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khác nhau đến sự nhân nhanh chồi hoa cẩm


chướng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.1. Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng
Mẫu sau khi lấy tại vườn sẽ đem về tỉa gọn và cắt ngắn khoảng 2cm và tiến hành rửa mẫu
khử trùng. Nguồn mẫu (chồi đỉnh) được thu nhận từ những cây khỏe mạnh ngoài vườn và
11


rửa dưới vịi nước chảy 10 phút. Sau đó mẫu được ngâm trong xà phòng 5 phút và rửa lại
bằng nước máy 3 lần. Tiếp theo mẫu được khử trùng bằng Ca(ClO) 2 và nano bạc với nồng
độ và thời gian khác nhau tùy vào từng nghiệm thức (bảng 1). Tiếp đó, mẫu được đưa vào
tủ cấy vơ trùng và tiến hành rửa mẫu lại với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút.
Mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh có kích thước 1mm được sử dụng làm mẫu cấy. Mỗi nghiệm
thức lập lại 3 lần, mỗi lần 20 mẫu.

Hình 2: Chồi đỉnh sau khi cắt

12


Bảng 1: Các chất khử trùng được sử dụng trong việc khử trùng mẫu với nồng độ và thời
gian khác nhau
Chất khử trùng
Canxi hypoclorit (%)
nano bạc (ppm)

Nồng độ
8

25
50
75
100
125

Thời gian
10 phút
40 phút

2.3.1.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khác nhau đến sự nhân nhanh của
chồi hoa cẩm chướng:
Chồi hoa cẩm chướng thu nhận từ nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm trên. Tiến hành
cấy truyền 3 lần trong môi trường nuôi cấy đủ số lượng mẫu bắt đầu thực hiện thí nghiệm
2. Mẫu cắt ngắn khoảng 1 – 1,5 cm cấy vào các mơi trường ni cấy có bổ sung các nồng
độ nano bạc khác nhau (Bảng 2). Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần mỗi lần 20 mẫu.
Bảng 2: Các nồng độ nano bạc khác nhau được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
Nghiệm thức
1
2
3
4
5

Dung dịch nano bạc (ppm)
0
2
4
6
8


2.3.2. Chỉ tiêu theo dõi
2.3.2.1. Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng
Số chồi/mẫu: đếm số chồi có trên mẫu.
Chiều cao cây (cm): được xác định bằng cách đo chiều dài từ gốc đến lá cao nhất.
Tỷ lệ nhiễm = × 100 (%)
Tỷ lệ tái sinh chồi = × 100 (%)
13


2.3.2.2. Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khác nhau đến sự nhân nhanh chồi
đỉnh hoa cẩm chướng
Số chồi/mẫu: đếm số chồi có trên mẫu
Chiều cao cây (cm): được xác định bằng cách đo chiều dài từ gốc đến lá cao nhất.
Khối lượng tươi: rửa sạch agar, thấm sạch nước dính trên mẫu, đem cân bằng cân phân
tích có độ chính xác đến miligam và ghi lại khối lượng.
Khối lượng khô: mẫu sau khi xác định được khối lượng tươi, đem sấy đến khi khối lượng
không đổi ở nhiệt độ 60 – 70 0C và đem cân bằng cân phân tích có độ chính xác đến
miligam ghi lại khối lượng.
2.3.3.

Điều kiện ni cấy

Điều kiện phịng thí nghiệm với nhiệt độ 25 ± 2°C, quang chu kỳ 16 h/ngày, cường độ
chiếu sáng 40 - 45 µmol.m-2.s-1 của ánh sáng huỳnh quang và độ ẩm trung bình 55 - 60%.
2.3.4.

Xử lý số liệu

Các số liệu thu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel ® 2010 và phần mềm Mstatc

1.2.

14


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng
Nano bạc là một trong những loại nano kim loại được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực
nuôi cấy mô thực vật và được biết đến như là một chất có khả năng diệt khuẩn có hiệu
quả bởi tính ưu việt của chúng như: tăng hiệu quả tiếp xúc bề mặt nên ion dễ dàng bám
dính xâm nhập vào tế bào vi sinh vật hay thực vật hơn, dễ dàng di chuyển trong thực vật
giúp chúng nhanh chóng được hấp thu và cho hiệu quả cao hơn. Vì vậy, nano bạc trong
những năm gần đây đã được ứng dụng nhiều để nghiên cứu khả năng khử khuẩn trên
nhiều đối tượng khác nhau. Ở thí nghiệm này sử dụng Ca(ClO)2 làm chất khử trùng đối
chứng với chất khử trùng là nano bạc ở các nồng độ khác nhau sau 25 ngày nuôi cấy
(Bảng 3).
Bảng 3: Hiệu quả khử trùng mẫu chồi đỉnh sinh trưởng hoa cẩm chướng của nano bạc ở
các nồng độ khác nhau sau 25 ngày nuôi cấy
Chất khử trùng
Canxi hypoclorit (%)

Nồng độ
Tỉ lệ nhiễm (%)
Tỉ lệ tái sinh(%)
ns
8
0
26,67b
25
1,67

31,67ab
50
0
26,67b
nano bạc (ppm)
75
1,67
31,67ab
100
0
38,33a
125
0
21,67b
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của
trung bình mẫu với α = 0,05.
Sau 25 ngày nuôi cấy, kết quả ghi nhận ở bảng 3 cho tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy được xử lý
nano bạc ở các nồng độ khác nhau với chất khử trùng đối chứng Ca(ClO) 2 khơng có sự
khác biệt mang ý nghĩa thống kê. Dung dịch nano bạc ở các nồng độ 50 ppm, 100 ppm,
125 ppm và đối chứng đều đạt tỉ lệ nhiễm là 0% và ở nồng độ nano bạc 25 ppm và 75
ppm đạt tỉ lệ nhiễm 1,67%.
Từ kết quả bảng 3 cũng cho thấy tỷ lệ tái sinh mẫu chồi đỉnh sinh trưởng hoa cẩm chướng
là khác nhau mang ý nghĩa thống kê khác biệt giữa các nồng độ. Ở nồng độ 100ppm nano
15