ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ TRÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG ARTEMISININ
TRÊN GEN K13 CỦA Plasmodium falciparum TẠI VÙNG SỐT RÉT
LƢU HÀNH NẶNG TỈNH BÌNH PHƢỚC, NĂM 2014 – 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1

download by :


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ TRÀ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG ARTEMISININ
TRÊN GEN K13 CỦA Plasmodium falciparum TẠI VÙNG SỐT RÉT
LƢU HÀNH NẶNG TỈNH BÌNH PHƢỚC, NĂM 2014 – 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Độc vật học

Mã số: 60 42 01 03
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trƣơng Văn Hạnh

HÀ NỘI – 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2

download by :


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

3

download by :


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các số
liệu, kết quả trong luận văn này là trung thực và chƣa từng đƣợc cơng bố
trong bất kỳ cơng trình hoặc tài liệu nào.

Tác giả

Nguyễn Thị Trà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


i

download by :


LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Trƣơng Văn Hạnh, Thầy đã
tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Sốt rét-KST-CTTƢ đã tạo
điều kiện thuận lợi, ủng hộ tôi về thời gian, vật chất và tinh thần trong q
trình thực hiện Luận văn.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cơ, cán bộ Phịng Đào tạo Sau đại
học, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Trƣờng Đại học
Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập tại Trƣờng.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu Khoa Sinh học
phân tử và cán bộ các Khoa/Phòng của Viện Sốt rét-KST-CTTƢ, đã giúp đỡ,
ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Với lịng biết ơn sâu nặng, cảm ơn gia đình và bạn bè đã ln bên tơi.

Nguyễn Thị Trà

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

ii

download by :


MỤC LỤC

Trang
MỞ ĐẦU

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1.

Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam

1.2.

Tình hình ký sinh trùng số t rét

P. falciparum kháng thuốc trên thế

giới và Việt Nam

3
5

1.2.1. Tình hình kháng các thuốc sốt rét của P. falciparum trên thế giới

5

1.2.2. Tình hình kháng các thuốc sốt rét của P. falciparum tại Việt Nam


9

1.3.

Đặc điểm gen K13 của P. falciparum liên quan đến kháng
artemisinin

10

1.3.1. Cơ sở khoa học chọn gen K13 là chỉ thị phân tử kháng artemisinin

10

1.3.2. Cấu trúc gen K13 của P. falciparum

12

1.4.

Các nghiên cứu về đa hình đột biến gen K13 trên thế giới và Việt
Nam

1.5.

Các phƣơng pháp nghiên cứu ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc

14
20

1.5.1. Phƣơng pháp in vivo


20

1.5.2. Phƣơng pháp in vitro

22

1.5.3. Phƣơng pháp phân tử

22

1.6.

Kỹ thuật giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tƣợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu

23
25
25

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

25

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu


25

2.1.3. Thời gian nghiên cứu

25

2.2.

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

iii

download by :


2.2.1. Thiết bị

25

2.2.2. Dụng cụ

25

2.2.3. Hóa chất

26


2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu

27

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

27

2.3.2. Phƣơng pháp chọn mẫu và cỡ mẫu

27

2.4.

Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.4.1. Thu thập mẫu

27
27

2.4.2. Tách chiết ADN bằng bộ sinh phẩm DNA micro test của hãng
Qiagen

27

2.4.3. Kỹ thuật PCR xác định 4 loài ký sinh trùng sốt rét trên ngƣời


28

2.4.4. Kỹ thuật PCR xác định kiểu gen của P. falciparum

30

2.4.5. Kỹ thuật giải trình tự ADN phát hiện đột biến gen K13

31

2.5.

Xử lý số liệu nghiên cứu

34

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.

Kết quả xác định các đột biến gen K13 của P. falciparum phân lập từ
bệnh nhân sốt rét tại Bình Phƣớc

3.1.1. Kết quả xác định loài ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật PCR lồng

35
35
35

3.1.2. Kết quả xác định kiểu gen của P. falciparum bằng kỹ thuật PCR lồng 35

3.1.3. Kết quả phân tích đột biến gen K13 bằng kỹ thuật giải trình tự 37
ADN
3.2.

Đánh giá mối tƣơng quan giữa đột biến gen K13 với kết quả theo dõi 47
ký sinh trùng sốt rét trên bệnh nhân ngày D3

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN

50

KẾT LUẬN

54

KIẾN NGHỊ

54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

55

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

iv

download by :



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết
tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACTs

Artemisinine-base Combination
Therapy

ADN

Acid deoxyribonucleic

Bp

Base pair

DHA-PPQ

Dihydroartemisinine-piperaquine

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphate


EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Thuốc sốt rét phối hợp với
Artemisinin

Cặp bazơ ni tơ

KST

Ký sinh trùng

KSTSR

Ký sinh trùng sốt rét

L

Ladder

Thang đo kích thƣớc phân
tử

Msp2

Mezoroite Surface Protein 2

Protein bề mặt 2


NCBI

National Center for
Biotechnology Information
Sốt rét

SR
WHO

World Heath Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

v

download by :


DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 1.1. Mƣời tỉnh có tỷ lệ ký sinh trùng sốt rét lƣu hành cao năm 2014 ....... 4
Bảng 1.2. Thời gian KSTSR P. falciparum kháng với các loại thuốc sốt rét ..... 7
Bảng 1.3. Danh sách các vị trí đột biến gen K13 xác định kháng hoặc liên
quan kháng artemisinin theo WHO 2015 ............................................................ 20
Bảng 3.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm đơn và nhiễm phối hợp kiểu gen ở các
mẫu nhiễm P. falciparum ngày D0 và D3 theo locus gen msp2 ......................... 36
Bảng 3.2. So sánh tỷ lệ đột biến gen K13 giữa 2 nhóm mẫu bệnh nhân ngày

D0 và ngày D3..................................................................................................... 44
Bảng 3.3. Tần suất của các vị trí đột biến gen K13 ở nhóm mẫu có đột biến .... 46
Bảng 3.4. Kết quả xác định đột biến gen K13 ở nhóm ký sinh trùng sốt rét
ngày D3 và D0..................................................................................................... 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

vi

download by :


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Bản đồ các quốc gia và vùng lãnh thổ có lan truyền sốt rét .............. 3
Hình 1.2. Cấu trúc protein K13 của P. falciparum ............................................. 12
Hình 1.3. Mơ hình cấu trúc 3D protein K13 của P. falciparum ......................... 13
Hình 1.4. Đọc trình tự nucleotit theo phƣơng pháp Sanger ................................ 24
Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các mẫu nhiễm đơn P. falciparum ... 35
Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu nhiễm kiểu gen FC ....... 36
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu nhiễm kiểu gen IC ........ 37
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phảm PCR nhân bội gen K13 ................................... 38
Hình 3.5. Giản đồ giải trình tự nucleotit đoạn gen K13 của P. falciparum
nhiễm trên mẫu bệnh nhân ngày D3 ................................................................... 39
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotit gen K13 của mẫu 3D7 phịng thí
nghiệm với trình tự của đơn dịng 3D7 cơng bố trên ngân hàng gen.................. 40
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotit đoạn gen K13 của các mẫu P. falciparum
ngày D0 phát hiệnđiểm đột biến ......................................................................... 42
Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotit đoạn gen K13của các mẫu P. falciparum
ngày D3 phát hiện đột biến điểm ........................................................................ 43

Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự axit amin để xác định đột biến gen K13 của
P. falciparum ở các mẫu ngày D0 ....................................................................... 45
Hình 3.10. Kết quả so sánh trình tự axit amin để xác định đột biến gen K13
của P. falciparum ở các mẫu ngày D3 ................................................................ 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

vii

download by :


Hình 3.11. Kết quả phân tích hồi quy logistic bằng phần mềm R v3.2.3 ........... 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

viii

download by :


MỞ ĐẦU
Sốt rét (SR) vẫn là căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm đối với con
ngƣời, bệnh phổ biến tại nhiều quốc gia, đặc biệt ở các nƣớc nghèo, các nƣớc
đang phát triển.Theo báo cáo năm 2014 của Tổ chức Y tế thế giới(WHO),
hiện có 97 quốc gia và vùng lãnh thổ có sốt rét lƣu hành với khoảng 3,3 tỉ
ngƣời sống trong vùng có nguy cơ mắc sốt rét, trong đó khoảng 1,2 tỉ ngƣời
có nguy cơ mắcsốt rét cao [52]. Tại Việt Nam, năm 2014 có 27.868 trƣờng
hơ ̣p mắc sốt rét, 06 ca tử vong do sốt rét. Sốt rét lƣu hành chủ yếu tại các
vùng biên giới thuộc khu vực Miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ
nơiđồng bào dân tộc ít ngƣời sinh sống với điều kiện kinh tế, xã hội cịn nhiều

khó khăn[1].
Trên thế giới hiện có 5 lồi KSTSR gây bệnh cho ngƣời là P.
falciparum, P. vivax,P. malariae, P. ovalevà P.knowlesi trong đó P.
falciparumlà loài phổ biến và gây tử vong cao nhất. Hơn nữa, khó khăn rất
lớn trong phịng chống và loại trừ sốt rét là do ký sinh trùng sốt rét (KSTSR)
kháng thuốc. Đến nay,đãghi nhậnkháng thuốc sốt rétở 3 loài làP. falciparum,
P. vivaxvà P. malariae, đặc biệt loài P. falciparumđã kháng với nhiều loại
thuốc sốt rét [52].
Artemisinin và dẫn xuất là thuốc có hiệu quả cao trong điều trị cho
bệnh nhân sốt rét nhiễm P. falciparum chƣa biến chứng, đƣợc sử dụng rộng
rãi ở nhiều quốc gia từ những năm 1990 nhƣng đã có những bằng chứng cho
thấy P. falciparum phát triển kháng thuốc sau hơn 10 năm đƣợc sử dụng rộng
rãi.Do vậy,từ năm 2001 WHO đã khuyến cáo các quốc gia sử dụng các thuốc
sốt rét phối phợp nhiều thành phần (ACTs – Artemisinine base Combination
Therapy) trong đó artemisinin đóng vai trò là thành phần quan trọng nhất
nhằm làm chậm lại tốc độ phát triển của KSTSR kháng thuốc[48].
Những nghiên cứu gần đây đã ghi nhận P. falciparum kháng với
artemisinin tại Cam-pu-chia, Mi-an-ma, Thái Lan và Việt Nam [31, 50]. Đây
là một vấn đề đáng báo động, đặc biệt nguy hiểm vì đến nay thế giới chƣa có
một loại thuốc SR mới nào có hiệu lực cao, an tồn hơn để thay thế.Chính vì
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1

download by :


vậy, WHO đã yêu cầu các quốc gia cần có các biện pháp để giám sát, can
thiệp nhằm ngăn chặn KSTSR kháng thuốc phát triển và lan rộnghơn.
Ba phƣơng pháp chủ yếu để phát hiện và giám sát sự lan rộng của

KSTSR kháng thuốc là theo dõi đánh giá hiệu quả điều trị của thuốc sốt rét
trên bệnh nhân (in vivo), đánh giá mức độ nhạy cảm của KSTSR trên in vitro
và phân tích các đột biến gen.Năm 2013, gen PF3D7_1343700 (gọi là gen
K13) của P. falciparum đƣợc xác định là gen đích có các đột biến điểm liên
quan đến xác định kháng artemisinin tại vùng sốt rét kháng thuốc ở Cam-puchia [19]. Đây là một phát hiện mới, có giá trị ứng dụng trong phát hiện và
theo dõi sự lan rộng của P. falciparum kháng artemisinin.
Bình Phƣớc là tỉnh có sốt rét lƣu hành nặng và đƣợc ghi nhận là nơi
đầu tiên tại Việt Namcó ký sinh trùng sốt rét P. falciparum kháng
artemisininvào năm 2009. Đến nay, đã ghi nhận thêm nhiều tỉnh có ký sinh
trùng P. falciparum nghi ngờ kháng artemisinin nhƣGia Lai, Đăk Nơng,
Quảng Nam, Khánh Hịa.
Sử dụng kỹ thuật giải trình tự ADN để nghiên cứu đột biến gen K13,
nhằm xác định vị trí và tần suất của các điểm đột biến K13 của P.
falciparumphân lập từ bệnh nhân sốt rét và đánh giá khả năng ứng dụng các
đột biến điểm này vào giám sát ký sinh trùng P. falciparum kháng
artemisininlà cần thiết, có giá trị khoa học và thực tiễn.Chúng tôi tiến hànhđề
tài: “Nghiên cứu xác định đột biến kháng artemisinin trên gen K13 của
Plasmodium falciparum tại vùng sốt rét lƣu hành nặng tỉnh Bình Phƣớc,
năm 2014 - 2015” với các mục tiêu sau:
1. Xác địnhvị trí, tần suất các đột biến điểm trên gen K13 của P.
falciparumphân lập từ bệnh nhân sốt rét tại tỉnh Bình Phƣớc, năm
2014-2015.
2. Đánh giá mối tƣơng quan giữađột biến gen K13 với tỷ lệ ký sinh trùng
sốt rét dƣơng tính kéo dài trên bệnh nhân ngày D3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2

download by :



Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới và Việt Nam
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), có 5 lồi Plasmodium spp. gây
bệnh cho ngƣời trong đó gây bệnh nghiêm trọng và dẫn đến tử vong nhiều
nhất là do lồiP. falciparum, số cịn lại do P. vivax, P. malariae, P. ovale và
P.knowlesi có thể gây bệnh nhẹ hơn và thƣờng ít dẫn đến tử vong. Bệnh đƣợc
lây truyền qua vết đốt của muỗi cái Anopheles nhiễm ký sinh trùng.
Số liệu thống kê của WHO năm 2014 cho thấy hiện có 97 quốc gia và
vùng lãnh thổ có sốt rét lƣu hành với khoảng 3,3 tỉ ngƣời có nguy cơ nhiễm
sốt rét, trong đó khoảng 1,2 tỉ ngƣời có nguy cơ nhiễm cao. Năm 2013, trên
toàn thế giới ghi nhận 198 triệu ca mắc sốt rét và 584 nghìn trƣờng hợp tử
vong do sốt rét, phần lớn số ca tử vong xảy ra tại Châu Phi với 528 nghìn
ngƣời, chiếm 90% trong đó trẻ em dƣới 5 tuổi chiếm 78%, tại khu vực Đông
Nam Á có khoảng 41 nghìn ngƣời chết chiếm khoảng 7%[52].

Hình 1.1. Bản đồ các quốc gia và vùng lãnh thổ có lan truyền sốt rét
(theo nguồn WHO, 2014)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

3

download by :


Việt Nam nằm trong khu vực Tây Thái Bình Dƣơng là nơi có lƣu hành
sốt rét với tỷ lệ mắc cao. Theo thống kê của WHO, hiện có khoảng 712 triệu
ngƣời trong khu vực Tây Thái Bình Dƣơng, chiếm khoảng 40% dân số sống
trong những vùng có nguy cơ sốt rét. Tại Việt Nam,mặc dù số ca xác nhận sốt

rét đã giảm hơn 75%, số ca tử vong do sốt rét giảm hơn 90% trong khoảng
thời gian từ 2000 đến 2013 tuy nhiên vẫn còn khoảng 11,7 triệu ngƣời đang
sống trong các khu vực có sốt rét lƣu hành.
Theo báo cáo tổng kết cơng tác phịng chống bệnh sốt rét năm 2014,
tồn quốc có 27.868 bệnh nhân sốt rét, giảm 21,29% so với năm 2013, có 6
trƣờng hợp tử vong do sốt rét. Tại khu vực Đông Nam Bộ,số bệnh nhân sốt
rét đã giảm so với năm 2013 là 18,15%. Tuy nhiên vẫn cịn duy trì ở mức cao,
ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc còn diễn biến rất phức tạp. Bình Phƣớc là
một trong 10 tỉnh có tỷ lệ KSTSR cao nhất cả nƣớc (Bảng 1.1) [1].
Bảng 1.1.Danh sách 10 tỉnh có tỷ lệ ký sinh trùng sốt rét lƣu hành cao năm 2014
TT

Tỉnh

1

Gia Lai

2

Dân số

Dân số

Ký sinh

chung

SRLH


trùng

Ký sinh
trùng/1000dân
số chung

1.406.542

971.274

4.367

3,01

Ninh Thuận

588.280

234.170

1.033

1,76

3

Bình Phƣớc

944.370


820.497

1.521

1,61

4

Đắk Nơng

563.936

551.787

615

1,09

5

Phú n

922.364

315.558

983

1,07


6

Đắk Lắk

1.847.979

1.484.415

1913

1,04

7

Khánh Hịa

1.222.450

190.980

1.174

0,96

8

Kon Tum

472.233


426.408

350

0,74

9

Quảng Bình

874.415

417.437

596

0,68

10

Quảng Trị

675.925

231.869

413

0,61


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

4

download by :


1.2. Tình hình ký sinh trùng sớ t rét P. falciparumkháng thuốc trên thế
giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình kháng các thuốc sốt rét của P. falciparumtrên thế giới
Trong vòng vài thập kỷ gần đây, vấn đề KSTSR kháng thuốc đã trở
thành một trong những cản trở chính đối với chiến lƣợc phịng chống và loại
trừsốt rét trên tồn thế giới. Tình trạng kháng thuốc đã đƣợc ghi nhận đối với
3 trong số 5 loài KSTSR gây bệnh cho ngƣời là P. falciparum, P. vivax và P.
malariae[49]. Hiện nay P. falciparum đã kháng với hầu hết các thuốc sốt rét,
kể cả artemisinin và các liệu pháp kết hợp artemisinin (ACTs) chống kháng.
Kháng thuốc là rất phức tạp vì thực tế cho thấy KSTSR đã kháng chéo
giữa các thuốc có cùng thành phần hóa học hoặc có cùng cơ chế tác động. Đa
kháng thuốc xảy ra với P. falciparum khi mà ký sinh trùng này kháng với
nhiều loại thuốc khác nhau về thành phần hóa chất hoặc cơ chế tác động. Tốc
độ phát triển kháng và mức độ lan rộng kháng thuốc diễn biến phức tạp và có
sự khác nhau giữa các thuốc sốt rét.
Báo cáo tổng kết của WHO giai đoạn 2000 -2010 cho thấy đã có sự gia
tăng có ý nghĩa về mức độ kháng thuốc của KSTSR [49]. Trong đó:
Kháng quinin:
P. falciparum kháng thuốc quinin phát hiện đầu tiên tại Bra-xin từ
những năm 1908 - 1910. Đến những năm 1960 cũng đã ghi nhận kháng tại
khu vực Đông Nam Á. Theo kết quả của 9 nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều
trị tại 6 quốc gia (giai đoạn 2002 đến 2007) cho thấy tỷ lệ thất bại điều trị cao
(>20%) tại 2 điểm nghiên cứu ở Bô-li-vi-a và Vê-nê-du-ê-la, tuy nhiên thuốc

vẫn còn hiệu lực điều trị 100% tại Pa-ki-xtan và Cam-pu-chia [48].
Kháng chloroquin:
Chloroquin đƣợc đƣa vào sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới những
năm 1950. Ca bệnh nghi ngờ kháng chloroquin đƣợc nghi nhận đầu tiên tại
Thái Lan năm 1957, đến năm 1960 một số trƣờng hợp kháng đƣợc xác định
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

5

download by :


đồng thời tại Cô-lôm-bi-a và Thái Lan. Tại Châu Phi, ca kháng đầu tiên đƣợc
xác định tại vùng Đông Phi vào năm 1978, sau đó phát hiện tại vùng Trung,
Nam và cuối cùng là vùng Tây Phi năm 1983. Đến nay, P. falciparum kháng
chloroquin đƣợc phát hiện tại hầu hết các vùng sốt rét lƣu hành trên thế giới
[33, 49].
Các nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều trị của chloroquin đối với P.
falciparum giai đoạn từ 2000 đến năm 2009 cho thấy tỷ lệ điều trị thất bại từ
9,2% đến 100% tại hầu hết các quốc gia ngoại trừ một số nƣớc nhƣ Hon-đurát, Ma-la-uy, Ni-ca-ra-goa (có tỷ lệ thất bại từ 0 -1,3%). Chloroquin vẫn còn
hiệu lực điều trị tại một số quốc gia Nam Mỹ, tỷ lệ điều trị khỏi đạt 100%
quan sát đƣợc tại một số điểm nghiên cứu ở Hon-đu-rát và Ni-ca-ra-goa [49].
Kháng sulfadoxin –pyrimethamin:
Từ những năm 1960, sulfadoxin và pyrimethamin đƣợc sử dụng riêng
lẻ để điều trị P. falciparum kháng chloroquin. Sau đó, thuốc này đƣợc sử
dụng phối hợp với tên gọi là Fansidar. Đến năm 1968, P. falciparum đã kháng
với thuốc này tại vùng biên giới Thái Lan và Cam-pu-chia. Tiếp đó các
trƣờng hợp kháng đƣợc thông báo ở hầu hết các quốc gia Đông Nam Á, Vân
Nam của Trung Quốc và vùng A-ma-dôn. Mức độ kháng thấp hơn đƣợc ghi
nhận tại vùng Nam và Trung Mỹ, Địa Trung Hải, Châu Đại Dƣơng. Tại Châu

Phi, kháng Fansidar xuất hiện muộn hơn vào cuối những năm 1980. Mức độ
kháng tại các vùng thuộc khu vực phía Đơng Phi cao hơn phía Tây Phi [24].
Trong 162 nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều trị của thuốc Fansidar
trong giai đoạn từ 2000 đến 2007 cho thấy tỷ lệ điều trị thất bại thấp (từ 4,7
đến 5%) tại một số quốc gia Nam Mỹ, Trung Đông và Trung Á. Tỷ lệ điều trị
thất bại trung bình tại khu vực Đông Phi là 52,8%, Tây Phi là 18,7%, vùng
Trung Phi là 23%, Nam Phi là 23,2%. Tại Lào và Việt Nam tỷ lệ thất bại <
40% [49].
Kháng mefloquin:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

6

download by :


Mefloquin đƣợc đƣa vào sử dụng tại một số quốc gia từ năm 1972, đến
năm 1982 đã ghi nhận P. falciparum kháng thuốc này tại vùng biên giới Thái
Lan và Cam-pu-chia. Tiếp theo, ký sinh trùng kháng mefloquin cũng xuất
hiện tại nhiều quốc gia Đông Nam Á, Nam Mỹ và lác đác tại Châu Phi [24].
Kháng artemisinin và dẫn xuất:
Nhóm thuốc này đƣợc sử dụng vào đầu những năm 1990, và đƣợc coi
là thuốc điều trị tuyến đầu và góp phần làm giảm nhanh bệnh sốt rét tại nhiều
quốc gia. Năm 2006-2007, có 02 trƣờng hợp kháng artemisinin đƣợc phát
hiện tại Tasanh, Cam-pu-chia. Từ 2009-2010, các nghiên cứu đánh giá hiệu
lực điều trị thuốc cũng đã nghi nhận các trƣờng hợp nghi ngờ kháng
artemisinin tại Tây Thái Lan, Đông Nam Mi-an-ma và tỉnh Bình Phƣớc, Việt
Nam [31, 50].
Bảng 1.2.Thời gian KSTSRP. Falciparumkháng với các loại thuốc sốt rét
Loại thuốc


Bắt đầu dùng

Bắt đầu thấy có kháng

năm

Năm

Nƣớc

Khoảng 1630

1910

Bra-xin

Chloroquin

1945

1960

Cơ-lơm-bi-a

Amodiaquin

1947

1961


Bra-xin

Proguanil

1948

1949

Bra-xin

Sulfadoxin-pyrimethamin

1964

1968

Thái Lan

Mefloquin

1972

1982

Thái Lan

Artemisin và dẫn xuất

1990


2006-2007

Cam-pu-chia

Quinin

Artemisinin là loại thuốc có hiệu lực mạnh, có tác dụng nhanh nhất
trong tất cả các loại thuốc hiện nay đối với P. falciparum. Liệu pháp kết hợp
artemisinin (artemisinin combination therapies-ACT) hiện đang là phác đồ
điều trị đƣợc sử dụng trên toàn thế giới đối với P. falciparum. Artemisinin
đƣợc chứng minh có hiệu quả trong điều trị sốt rét từ năm 1971. Đến những
năm 1990, thuốc artemisinin đƣợc sử dụng rộng rãi tại nhiều quốc gia vùng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

7

download by :


Đơng Nam Á trong đó có Việt Nam [46]. Nhằm làm chậm lại quá trình ký
sinh trùng phát triển kháng thuốc, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo
sử dụng các loại thuốc sốt rét phối hợp (ACTs) trong đó artemisinin hoặc các
dẫn xuất là thành phần quan trọng của thuốc [48]. Tuy nhiên, đến năm 2005,
WHO đã có báo cáo về sự giảm nhạy của P. falciparum đối với các thuốc
ACTs và cảnh báo nguy cơ kháng artemisinin. Năm 2008, đã phát hiện P.
falciparum kháng thuốc artemisinin và dẫn xuất tại tỉnh Paulin của Cam-puchia giáp biên giới với Thái Lan [31]. Đến nay đã xác định P. falciparum
kháng thuốc artemisinin tại 4 quốc gia thuộc khu vực Tiểu vùng sông Mêkông
gồm Cam-pu-chia, Thái Lan, Mi-an-ma, Việt Nam. Theo báo cáo cập nhật
thực trạng kháng artemisinin của WHO 2015 cho thấy [51]:

Tại Cam-pu-chia, các phân tích hồi cứu dựa trên các chỉ thị phân tử chỉ ra
rằng dƣờng nhƣ kháng artemisinin bắt đầu từnăm 2001 trƣớc khi ACTs đƣợc
sử dụng rộng rãi, ca kháng lâm sàng đầu tiên đƣợc xác định vào năm 2006. Tỷ
lệ thất bại điều trị cao của thuốc phối hợp artemisinin –mefloquine bắt đầu ở
tỉnh Paulin năm 2008 và lan rộng ra toàn quốc năm 2010. Sau khi Cam-puchia tiến hành Dự án ngăn chặn kháng thuốc từ 2009, số bệnh nhân nhiễm P.
falciparum giảm, tuy vậy tỷ lệ bệnh nhân đƣợc điều trị với
dihydroartemisinin-piperaquine còn ký sinh trùng ngày D3 vẫn tăng từ 26%
(2008) đến 45% (2010).
Tại Lào, nghiên cứu tại tỉnh Champasack cho thấy 22,2% bệnh nhân còn
KST ngày D3 với thuốc artemether-lumefantrine, đã xác định có đột biến K13
trong các quần thể ký sinh trùng.
Tại Mi-an-ma, kháng artemisinin đƣợc ghi nhận vào năm 2008. Các số
liệu nghiên cứu năm 2009 cho thấy kháng artemisinin đã xảy ra ở 5 vùng và
tiểu bang thuộc Đông Nam Mi-an-ma với cả 3 loại thuốc phối hợp đƣợc sử
dụng

là

artemether-lumefantrine,

artesunate-mefloquine

dihydroartemisinin-piperaquine.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

8

download by :

và



Tại Thái Lan, từ năm 2008 đã ghi nhận tỷ lệ thất bại điều trị với thuốc
artesunate-mefloquine ≥ 10%. Tỷ lệ thất bại điều trị cao đƣợc chứng minh do
có tỷ lệ kháng cao với thành phần mefloquine. Tuy vậy, đến 2012 với
artemether-lumefantrine đƣợc sử dụng thay thế đã xác định có 2 tỉnh có tỷ lệ
thất bại điều trị đạt khoảng 10%.
Tại Nam Mỹ, đã ghi nhận sự gia tăng tỷ lệ ký sinh trùng ngày D3 tại
Surimane (28% năm 2011 so với 2% năm 2005-2006) với thuốc phối hợp
artemether-lumefantrine; năm 2013 tại Guyana đã xác định có 70,8% bệnh
nhân còn ký sinh trùng ngày D3; kết quả nghiên cứu tại viện Cayenne, đảo
Guyana Pháp cho thấy có 7,5% bệnh nhân còn ký sinh trùng ngày D3 sau điều
trị artemether-lumefantrine.
1.2.2. Tình hình kháng các thuốc sốt rét của P. falciparumtại Việt Nam
Hiện tƣợngP. falciparum kháng chloroquin đƣợc thông báo tại Nha
Trang từ năm 1961 [36]. Từ 1975 đến 1995 đã xác định P. falciparum kháng
chloroquin tại hầu hết các vùng sốt rét ở tỉnh miền Nam và sau đó lan rộng ra
miền Bắc [6, 7]. Ở các tỉnh miền Trung - Tây Nguyên,P. falciparum kháng
chloroquin cao và tăng nhanh từ 30-55% (giai đoạn 1976 - 1984) lên đến
khoảng 55 – 90% (giai đoạn 1985 -1995) [4].
Những năm 1990, kết quả nghiên cứu ở 14 điểm tại các khu vực dịch tễ
khác nhau trong cả nƣớc cho thấy mức kháng in vivo chung đối với
chloroquin (RII + RIII) là 52% và thuốc Fansidar là 37,3%. Trong đó Tây
Ngun và Đơng Nam Bộ có mức kháng cao nhất là 65% và 47%. Các khu
vực khác tỷ lệ kháng thấp hơn [3].
Fansidar đƣợc đƣa vào sử dụng nhƣ là thuốc chống kháng với
chloroquin và cũng bị kháng nhanh chóng ở vùng biên giới Tây Nguyên với
mức kháng khoảng 82% năm 1980 và tăng lên đến 93,0% năm 1982. Tỷ lệ
KST kháng ở Nam Trung Bộ cũng rất cao, đạt 79% ở Phú n (1989), 68% ở
Khánh Hồ (1986), có nơi 100% [6]. Nghiên cứu thử nghiệm trên in vitro cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

9

download by :


thấy tỷ lệ kháng Fansidar là 71,0% trƣớc năm 1990 đã tăng lên 80% ở giai
đoạn 1991-1997 [12].
Artemisinin và dẫn xuất ra đời góp phần hạ thấp tỷ lệ tử vong do sốt
rét. Tuy nhiên tỉ lệ tái phát cao và tăng nhanh khi điều trị thuốc đơn thuần.
Nghiên cứu sử dụng phác đồ điều trị artemisinin đơn thuần trên 1000 bệnh
nhân sốt rét do P. falciparum cho thấy tỉ lệ tái phát 12,2% với phác đồ điều trị
7 ngày, và 47% với phác đồ điều trị 3 ngày [9].
Tại tỉnh Bình Phƣớc, phác đồ đơn trị liệu với artesunate trong 5 hoặc 7
ngày đƣợc sử dụng tại Việt Nam đến năm 2009 đã cho thấy 87,5% và 88,9%
đáp ứng đầy đủ cả về lâm sàng và ký sinh trùng học (ACPR) tƣơng ứng năm
2008 và 2010. Tuy nhiên tỷ lệ dƣơng tính ký sinh trùng ở ngày thứ 3 (D3) có
xu hƣớng tăng từ 10% năm 2008 lên 18,2% năm 2010. Tỷ lệ này cũng quan
sát đƣợc ở tỉnh Đắk Nông là 16,3% năm 2010 [10, 11].
Năm 2009, phác đồ điều trịcho các trƣờng hợp sốt rét doP.
falciparumchƣa biến chứnglà thuốc sốt rét phối hợp dihydroarteminisinpiperaquine (DHA-PIP) trong 3 ngày đƣợc sử dụng [2]. Kết quả của nhiều
nghiên cứu theo dõi hiệu lực điều trị củaphác đồ này cho thấy kết quả điều trị
khỏi > 95%, tuy nhiên tỷ lệ dƣơng tính ký sinh trùng D3 vẫn cịn >10% tại
một số tỉnh và có xu hƣớng ngày càng gia tăng; tại Bình Phƣớc năm 2009 là
15,3%, năm 2012 là 30,6%, và 36% năm 2014; tại Đắk Nông và Gia Lai lần
lƣợt là 29,2% và 22,8% năm 2012 [8]. Dƣơng tính ký sinh trùng D3 đƣợc coi
là dấu ấn nguy cơ của thất bại điều trị muộn.Nếu tỷ lệthất bại điều trị vƣợt quá
10% thì cần phải thay đổi trong chính sách sử dụng thuốc của chƣơng trình
phịng chống và loại trừ sốt rét quốc gia [47].

1.3.Đặc điểm gen K13 của P. falciparumliên quan đến kháng artemisinin
1.3.1. Cơ sở khoa học chọn K13 là chỉ thị phân tử kháng artemisinin
Năm 2013, Areiy và cộng sự đã thành công trong việc xác định gen
K13 là chỉ thị phân tử liên quan đến kháng artemisinin tại khu vực Đơng Nam
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

10

download by :


Á. Để đƣa ra đƣợc kết quả này Ariey F. và CS đã chọn lọc dòng P.
falciparum F32-ART5 kháng artemisinin bằng phƣơng pháp ni cấy liên tục
từ dịng KSTSR nhạy cảm với artermisinin F32-Tanzania dƣới áp lực thuốc
artemisinin với liều tăng dần qua 125 chu kỳ trong thời gian 5 năm. Bằng
phƣơng pháp giải trình trình tự tồn bộ gen F32-TEM (dịng KST ni cấy
khơng có áp lực artermisinin), dịng F32-Tanzania hoặc 3D7 (dịng KST nhạy
với artermisinin), nhóm nghiên cứu đã phát hiện dịng KST kháng F32-ART5
có 07 gen, mà mỗi gen chứa đựng một vị trí đột biến so với các dòng KSTSR
còn lại, trong khi dòng KSTSR nhạy khơng tìm thấy các đột biến này.Trong
số những gen này, chỉ có gen PF3D7_1343700 cho thấy mối liên quan chặt
với tỷ lệ sống sót của KSTSR trong thử nghiệmin vitroRSA0-3h.
Gen PF3D7_1343700 (K13) nằm ở vị trí 5,9 kilobases ở phần đầu
locus có trọng lƣợng phân tử 35kb và nằm trong vùng dấu hiệu ƣu tiên để
chọn lọc. Ngoài ra, các gen giả định liên quan đến kháng artemisinin đã đƣợc
công bố trong các nghiên cứu khác (Pfcrt [20], Pftctp[28], Pfmdr1[21],
32], Pfmrp1[25] và vận chuyển ABC) hoặc mã hóa các mục tiêu giả định của
ART

(PfATPase6 và Pfubcth-the


orthologue Plasmodium

chabaudi ubp1[22]) đã không bị biến đổi trong quá trình lựa chọn 5 năm của
F32-ART5 và khơng quan sát thấy gen Pfmdr1 khuếch đại.
Ngồi ra trong nghiên cứu này đã có sự kết hợp các đột biến trên vùng
mã hoá protein PF3D7 Kelch propeller (K13 propeller) với kháng thuốc
artemisinin trên nghiên cứu thử nghiệm in vivo và in vitro. Do vậy, đa
hình đột biến gen K13 đã đƣợc ứng dụng là chỉ thị phân tử để xác định kháng
artemisinin vì một số lý do:
-

Có sự mất liên tiếp những chủng KSTSR kiểu hoang dại ở phía
TâyCam-pu-chia suốt giai đoạn bắt đầu có sự kháng artemisinin;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

11

download by :


-

Kiểu KSTSR đột biến tăng lên về tần số tại các vùng kháng thuốc của
Cam-pu-chia và xuất hiện rất ít ở những nơi kháng artemisinin là không
phổ biến;

-


Gen PF3D7_1343700 nằm trong vùng dấu hiệu ƣu tiên để chọn lọc;

-

Những đột biến đa dạng trên K13-propeller phản ánh chọn lọc dƣơng;

-

Những đột biến xảy ra trên vùng gen có tính bảo tồn cao của P.
falciparum, chỉ có một đột biến đa hình đơn nucleotide dạng SNPs
(single nucleotide polymorphism)đƣợc ghi nhận từ một phân lập ở châu
Phi;

-

Tất cả các kiểu đa hình đƣợc quan sát là khác thƣờng (trừ kiểu V568G);

-

Ba vị trí đột biến có tần số cao nhất trong gen K13 có mối liên quan
chặt chẽ với tỷ lệ RSA0-3h trong nghiên cứu in vitro trên các mẫu phân
lập và thời gian làm sạch 50% số lƣợng KSTSR trên bệnh nhân;

-

Tần xuất xuất hiện của những allen đột biến tƣơng quanmạnh với tỷ lệ
KSTSR dƣơng tính ngày D3 sau khi điều trị bằng thuốc ACTs [19].

1.3.2. Cấu trúc gen K13 của P. falciparum
Gen K13 là một đoạn exon mã hóa protein Kelch nằm trên nhiễm sắc

thể số 13 hay còn gọi là protein Kelch 13 propeller domain, gồm có 3 vùng
với độ dài khoảng 760 axit amin (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc protein K13 của P. falciparum
Trong đó:
+ Một

vùng

đầu

N

có

tính

chất

bảo

tồn

đặc trƣng

lồi Plasmodium spp.,
+ ·Một vùng BTB/POZ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

12


download by :

cho


+ Vùng phía đầu C với 6 vùng nhỏ hình cánh quạt điển hình cho motif
Kelch. Motif Kelch chứa protein đƣợc bảo tồn qua tiến hóa giữa các
lồi khác nhau và nhóm lại thành loại protein KLHL.
Các dữ liệu phân tích protein cho thấy protein Kelch đƣợc sản sinh ở tất
cả giai đoạn phát triển của P. falciparum thể vô tính (thể nhẫn, tƣ dƣỡng, giao
bào và các merozoit) và thể hữu tính trong máu (thể giao bào). Đa hình các
điểm đột biến gen K13 ở vùng cánh quạt của protein K13 đƣợc chứng minh là
có liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ sống sót của P.falciparum trong thử nghiệm in
vitro và tỷ lệ sạch ký sinh trùng trên in vivo ở bệnh nhân điều trị sốt rét do
P.falciparum với ACTs [19].

Hình 1.3.Mơ hình cấu trúc 3D protein K13 của P. falciparum
(Theo Ariey F. và cộng sự, 2013 [19])
TheoAriey F. và cộng sự (2013), đa hình đột biến trên protein cánh quạt
K13 tập trung tại các tỉnh Cam-pu-chia, nơi mà tình trạng kháng artermisinin
diễn ra phổ biến và tần số các alen đột biến trên protein K13 ngày càng tăng
có liên quan đến sự lây lan của kháng artemisinin ở khu vực phía tây Cam-puSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

13

download by :


chia. Nghiên cứu cũng cho thấy mối tƣơng quan chặt chẽ giữa sự hiện diện

của alen đột biến, tỷ lệ KSTSR sống sót trong thử nghiệm in vitro, giống
nghiên cứu thử nghiệm ex vivo (Witkowski. B và cs., 2013)và tỷ lệ làm sạch
KSTSR trong thử nghiệm in vivo.
Mối tƣơng quan này đã chỉ ra rằng đột biến K13-cánh quạt là yếu tố quyết
định quan trọng của cơ chế kháng artermisinin.
1.4. Các nghiên cứu về đa hình đột biến gen K13 trên thế giới và Việt Nam
Tính đa hình đột biến gen K13 đƣợc xác định có mặt ở nhiều nơi trên
thếgiới, đặc biệt khu vực Tiểu vùng sông Mê Kông gồm Cam-pu-chia, Thái
Lan, Mi-an-ma, Việt Nam, Lào và một số nƣớc Nam Á nhƣ Ấn Độ,
Bangladesh, Đông Á nhƣ Trung Quốc…
Ariey và cộng sự (2013) [19] cũng đã xác định đa hình các đột biến trên
protein K13 nhƣ một marker phân tử kháng arermisinin của P. falciparum.
Đồng thời nghiên cứu của Ariey F. và cộng sự cũng đã xác định đƣợc 17 alen
đột biến trên protein K13 ở Cam-pu-chia.
Mặc dù đã xác định đƣợc một số lƣợng lớn các đột biến, chỉ có một số
alen đột biến có tần số cao (> 5%), có chứa đột biến SNPs, cụ thể là Y493H,
R539T và C580Y nằm tƣơng ứng ở vị trí cánh quạt 2, 3 và 4. Nghiên cứu này
đã lập bản đồ các điểm đột biến xác định tỷ lệ KSTSR có chứa các đột biến có
nghĩa và sự phân bố địa lý của chúng.
Quan trọng hơn, sự phân bố tần suất của alen đột biến tại các tỉnh khác
nhau cũng phù hợp với tỷ lệ tồn tại KSTSR ở ngày D3 ở bệnh nhân sau khi
đƣợc điều trị bệnh SR do P. falciparum với thuốc phối hợp ACTs. Hiện tƣợng
này đƣợc xem là chỉ điểm gợi ý cho kháng artemisinin trong điều trị lâm sàng.
Một nghiên cứu khác tại Cam-pu-chia của Pharath Lim và cộng sự
(2013) [34] cho biết trong khi P. falciparum đa kháng thuốc có mặt phổ biến
ở khu vực phía Tây và phía Bắc Cam-pu-chia, hiện khơng có bằng chứng nào
cho thấy có hiện tƣợng kháng piperaquin, điều này cũng xảy ra tƣơng tự ở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

14


download by :