NGHIÊN CỨU ẢNH
HƯỞNG MỘT SỐ MƠI
TRƯỜNG
ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT
SINH HÌNH THÁI CỦA
PHÔI, CHỒI SÂM LANG
BIAN (Panax vietnamensis
var. langbianesis)
NUÔI CẤY IN VITRO

i


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮC

Ctv

: Cộng tác viên

MS

: Murashige và Skoog (1962)

B5

: Gamborg’B5 (1968)

SH

: Schenk-Hildebrandt (1972)

WPM

: Woody Plant Medium (1981)

BA

: Benzyl adenyl

NAA

: α – naphthaleneacetic

ES hay EN

: Enshi-Shoho

HE

: Heller

1/2 MS

: Khống MS giảm 1/2

1/2 NH4

: Khống MS có thành phần NH4NO3 giảm 1/2

CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật


ii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Tác động của môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh phôi trên mẫu
phôi sâm Lang Bian ..................................................................................................20
Bảng 2. Tác động của môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh chồi trên mẫu
phôi sâm Lang Bian ..................................................................................................25
Bảng 3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng phát sinh hình thái trên
chồi sâm Lang Bian sau 120 ngày nuôi cấy ..............................................................29
Bảng 4. Tỉ lệ mẫu tạo rễ, số lượng rễ và chiều dài củ mẫu chồi sâm Lang Bian 120
ngày nuôi cấy ............................................................................................................32

iii


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1. Khối lượng tươi, khối lượng khô của mẫu phôi sau 90 ngày nuôi cấy trên
mơi trường khống SH, MS, 1/2 MS, WPM, B5 ......................................................28
Biểu đồ 2. Khối lượng tươi, khối lượng khô mẫu chồi sau 120 ngày nuôi cấy trong
một số loại môi trường nuôi cấy ...............................................................................37

iv


DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Panax vietnamensis var. langbianensis .........................................................7
Hình 2. Ảnh hưởng của mơi trường khống đến khả năng phát sinh hình thái phơi
sâm Lang Bian...........................................................................................................21

Hình 3. Các giai đoạn sinh trưởng mẫu phơi trên sâm Lang Bian. ...........................24
Hình 4. Hình thái mẫu chồi sâm Lang Bian sau 120 ngày nuôi cấy.. .......................29

v


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3
1.1. Sơ lược về chi nhân sâm ..................................................................................3
1.2. Thành phần hóa học ....................................................................................4
1.3. Giá trị dược liệu ...........................................................................................5
1.4. Sơ lược về sâm Langbian .................................................................................6
1.4.1. Phân loại thực vật học ..............................................................................6
1.4.2. Phân bố .....................................................................................................7
1.4.3. Đặc điểm thực vật học ..............................................................................7
1.5. Các vấn đề liên quan đến đề tài nghiên cứu .....................................................8
1.5.1. Sự phát sinh hình thái ở thực vật ..............................................................8
1.5.2. Mơi trường nuôi cấy .................................................................................9
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................16
2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện .....................................................................16
2.2. Vật liệu ni cấy ............................................................................................16
2.3. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................16
2.4. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................16
2.5. Phương pháp nghiên cứu................................................................................16
2.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số mơi trường khống (MS; 1/2 MS;
B5; SH; WPM) đến sự phát sinh hình thái trên mẫu phôi sâm Lang Bian in
vitro...................................................................................................................16
2.5.2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số mơi trường khống (MS; 1/2 MS;
B5; WPM; SH) đến sự phát sinh hình thái trên mẫu chồi sâm Lang Bian in

vitro...................................................................................................................17
2.6. Điều kiện nuôi cấy .........................................................................................17
2.7. Chỉ tiêu theo dõi .............................................................................................17
2.8. Xử lý số liệu ...................................................................................................18
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................19
3.1. Ảnh hưởng của một số mơi trường khống (MS; 1/2 MS; B5; SH; WPM) đến
sự phát sinh hình thái trên mẫu phơi sâm Lang Bian in vitro ...............................19

vi


3.2. Ảnh hưởng của một số mơi trường khống (MS; 1/2 MS; B5; WPM; SH) đến
sự sinh trưởng của chồi sâm Lang Bian in vitro ...................................................28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................39
PHỤ LỤC

vii


MỞ ĐẦU
Sâm được biết đến là loại thuốc quý, được xếp hàng đầu trong bốn loại thuốc
quý trên thế giới là: sâm, nhung, quế, phụ. Trong đó, hầu như các lồi trong họ
Nhân sâm (Araliaceae) hay Ngũ gia bì đều được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ
truyền ở nhiều nước. Nhiều loài trong chi Sâm (Panax) rất được ưa chuộng và có
giá trị cao, nhờ vào hoạt chất đặc biệt saponin trong sâm giúp tăng khả năng miễn
dịch cho cơ thể, chống lão hóa, điều hịa khí huyết, điều trị các bệnh nan y về gan,
thận, chống ung thư…; chi Panax cũng được xem là loài quý hiếm vì chỉ phân bố
trên các vùng núi đặc hữu, nằm rải rác với số lượng cá thể ít, khó tìm thấy và luôn
bị săn lùn, khai thác triệt để. Trước thực trạng này nhiều nhà nghiên cứu đã tiến

hành thử nghiệm trồng cây bằng hạt trong điều kiện tự nhiên nơi loài này sinh sống,
nhưng số lượng sâm trưởng thành qua các năm không nhiều so với lượng hạt trồng
ban đầu. Lý giải cho điều này là do thời gian nuôi trồng kéo dài trong nhiều năm
liền từ 4 đến 7 năm mới có thể thu hoạch củ, khó khăn trong việc thu nhận hạt, thời
gian hạt nảy mầm dài, trong lúc gieo trồng thường bị các loài động vật gặm nhấm,
côn trùng, sâu bệnh hại tấn công; nên số lượng cá thể sau trồng cịn lại khơng nhiều.
Để khắc phục, hạn chế tình trạng trên, phương pháp nhân giống theo hướng nuôi
cấy mô tế bào thực vật được áp dụng với nhiều ưu điểm như có khả năng nhân
nhanh số lượng cây trồng trong thời gian ngắn, không bị các lồi động vật gặm
nhấm, cơn trùng sâu bệnh hại tấn cơng giai đoạn đầu, duy trì số lượng cá thể trồng
trong thời gian dài, rút ngắn thời gian khai thác củ và bảo tồn nguồn gen quý.
Tại Việt Nam sâm Ngọc Linh hay sâm Việt Nam (Panax vietnamesis Ha et
Grushv.) phân bố ở độ cao 1800 m tại vùng rừng núi hiểm trở, lạnh, nhiều mây mù
của huyện Đắt Tơ, tỉnh Kon Tum được xem là lồi sâm đặc hữu của nước ta. Loài
này được biết đến với 52 hoạt chất saponin có tác dụng vượt trội so với các loài sâm
cùng chi Panax. Những năm gần đây, nhiều lồi sâm mới cũng được tìm thấy như
sâm Lai Châu, Bố chính sâm, sâm Vũ Điệp, Tam Thất Hoang… và mới đây là sâm
Lang Bian tại núi Lang Bian tỉnh Lâm Đồng.

1


Sâm Lang Bian là nguồn dược liệu tự nhiên được tìm thấy vào thế kỉ XX có
tên khoa học Panax vietnamsis var. langbianes. Theo nghiên cứu của Duy và ctv
(2016) cho thấy, sâm Lang Bian tại tỉnh Lâm Đồng là một nhánh cùng với Panax
vietnamensis var.vietnamensis và P. vietnamensis var. juscidiscus, có số lượng cá
thể thấp, phân bố thưa theo các quần thể nhỏ. Đây là loài sâm mới nên chưa có
nhiều nghiên cứu về đặc điểm di truyền thực vật của lồi. Vì vậy lồi này mang ý
nghĩa khơng nhỏ trong việc bảo tồn nguồn gen mới của chi Panax.
Việc nghiên cứu và tìm ra quy trình nhân giống trên sâm Lang Bian là điều

cần thiết. Trong đó, yếu tố môi trường quyết định đến khả năng sinh trưởng của cây
trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Bởi, sự thay đổi mơi trường khống dẫn đến sự
thay đổi chiều hướng sinh trưởng ở thực vật. Nhiều nghiên cứu về tác động của mơi
trường khống trên, sâm Ngọc Linh, sâm Bố chính, Tam thất hoang… của các tác
giả Ngơ Thị Ngọc Hương (2015), Nguyễn Lê Thụ Minh (2017), Nguyễn Thị Ngọc
Hương (2018) cùng ctv ghi nhận. Trên đối tượng sâm Lang Bian hiện chưa có cơng
bố nào về sự tác động của mơi trường khống lên khả năng sinh trưởng và phát sinh
hình thái của mẫu cấy. Vì vậy, nhằm mục đích khảo nghiệm, tìm ra mơi trường ni
cấy in vitro thích hợp cho phơi và chồi sâm Lang Bian, chúng tôi tiến hành “Nghiên
cứu ảnh hưởng một số môi trường đến khả năng phát sinh hình thái của phơi,
chồi sâm Lang Bian (Panax vietnamensis var. langbianesis) nuôi cấy in vitro”.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về chi nhân sâm
Sâm là loài cây được xếp vào hàng dược liệu có giá trị dược lý và giá trị kinh
tế cao. Là loài thuộc chi Panax, họ Araliaceae phân bố khắp thế giới từ Đông Á
(Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản) đến Bắc Mỹ (Mỹ, Canada). Hiện có khoảng 12
lồi thuộc chi Panax trong đó chỉ có 5 lồi là P. ginseng, P. quinquefolius, P.
notoginseng, P. japonicus và P. vietnamensis thường được sử dụng như một loại
thảo dược quý. Sâm P. ginseng phân bố ở vùng Đông Bắc Á như Hàn Quốc, Trung
Quốc, Nga nên thường được gọi là sâm phương Đơng (Oriental ginseng). P.
quinquefolius được tìm thấy chủ yếu ở Bắc Mỹ (sâm Mỹ). P. japonicus và P.
notoginseng là giống sâm của Nhật Bản và Trung Quốc. P. vietnamensis là giống
của Việt Nam hay còn gọi là sâm Ngọc Linh. Chúng có chứa hợp chất saponin có
tác dụng phịng ngừa nhiều loại bệnh khác nhau như kích hoạt hệ miễn dịch, chống
lão hóa, điều chỉnh lượng đường huyết, giảm stress và bảo vệ gan, thận (Trương Thị
Hồng Hải và ctv 2018).

Theo Lã Đình Mỡi và ctv tại Hội nghi Khoa học Toàn Quốc về sinh thái và
tài nguyên sinh vật lần thứ 5 cho rằng; trong hệ thực vật Việt Nam, lồi sâm thuộc
họ Araliaceae có thành phần lồi khá đa dạng, phân bố rộng nhưng tập trung nhiều
ở những vùng rừng núi cao, có khí hậu ơn hịa. Đến nay, các nghiên cứu về đa dạng
sinh học, thành phần lồi, cũng như thành phần hóa học ở các lồi này tại Việt Nam
cịn rất ít, rất khiêm tốn. Phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung vào một số ít lồi
như sâm Việt Nam (Panax vietnamensis), Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus
(L.) Voss.), Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms), sâm Bố chính (Hibiscus
sagittifolius Kurz)… Trong đó sâm Việt Nam hay sâm Ngọc Linh là loài được chú
ý quan tâm do có chứa hàm lượng saponin, việc khai thác cũng như nhân giống loài
sâm này được nhiều người chú ý. Trong nghiên cứu của Vũ Thị Hiền (2018), về quá
trình tái sinh và nhân giống in vitro cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv. var. vietnamensis) bằng phương phát nuôi cấy lớp mỏng tế bào cho biết, để
bảo vệ và phát triển cây thuốc quý này từ năm 1979 đã tiến hành nhân giống ngoài
tự nhiên tại tỉnh Quảng Nam, tính đến năm 1992 đã thu được 100.000 cây nhờ vào
áp dụng phương pháp bón phân và chăm sóc giúp tăng năng suất, tỉ lệ nảy mầm hạt

3


và tăng khả năng sống cho cây. Đến năm 1995 sử dụng hai phương pháp nhân
giống là nhân giống hữu tính và vơ tính giúp tăng số lượng hạt và cây cho vụ trồng.
Với phương pháp nhân giống hữu tính tỉ lệ nảy mầm của hạt là 75%, các hạt này
được lựa chọn kỹ từ cây 1 năm tuổi khỏe, phẩm chất hạt tốt. Đối với phương pháp
nhân giống vô tính, tiến hành ươm đoạn đầu của thân rễ trong túi polyethylen và
ươm trên mặt đất, cũng thấy rằng tỷ lệ sống và đâm chồi của đoạn đầu thân rễ của
cây sâm Ngọc Linh là 65%. Bằng hai phương pháp nhân giống này số lượng cá thể
sâm tăng lên, tuy nhiên thiên tai và các yếu tố môi trường tự nhiên tác động như
chim, cơn trùng, các lồi gặm nhấm, sâu bệnh hại tấn công nên công tác ươm giống
và tạo vườn sâm bước đầu chưa đạt hiệu quả như mong muốn. Vì vậy, để duy trì,

mở rộng và nâng cao giá trị nguồn dược liệu quý này cần phải áp dụng những biện
pháp canh tác theo hướng hiện đại hóa, trong đó ni cấy mơ là một trong những kỹ
thuật nuôi cấy hiệu quả trong công tác nhân giống cây trồng quý này. Dựa trên
phương pháp này nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô được tiến hành, đã cho kết
quả tích cực từ đó xác định được nhu cầu dinh dưỡng, khả năng thích ứng mẫu cấy
theo từng thời điểm sinh trưởng khác nhau mà phát sinh hình thái khác nhau như tạo
phôi, chồi, tạo rễ, củ…
Trong nghiên cứu của đề tài này với mong muốn tìm ra mơi trường thích hợp
cho sự sinh trưởng cũng như khả năng phát sinh hình thái từ mẫu phơi, chồi của
sâm Lang Bian trong thời điểm tạo cây hoàn chỉnh phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật cũng được áp dụng và thử nghiệm.
1.2. Thành phần hóa học
Sâm là lồi có chứa hàm lượng saponin cao có trong rễ và rễ củ, là thành
phần hoạt chất chủ yếu trong các loài sâm trên thế giới cũng như sâm Việt Nam
(Panax vietnamensis). Bên trong lồi sâm P. vietnamensis có tới 52 hợp chất
saponin gồm 26 saponin có cấu trúc tương đồng với các lồi sâm khác và 26
saponin có cấu trúc mới gồm 25 vina ginsenosid R1 – R25 (VG -R1– R25) và 20 O - Me - G.Rh1. Đặc biệt, saponin dammaran gọi chung là ginsenoside chúng
chiếm tới 50/52 saponin được phân lập, là hoạt chất quyết định tác dụng sinh học
của sâm.

4


Theo Nguyễn Thị Bình (2015) về bước đầu nghiên cứu di thực sâm Ngọc
Linh ở Việt Nam cho biết, tuổi cây là một trong những yếu tố quyết định đến hàm
lượng hoạt chất ginsenoside trong cây. Hàm lượng Rg1 tăng dần từ cây tuổi 1 đến
cây tuổi 11, ở tuổi 11 cây có lượng Rg1 cao gấp 2,4 lần so với cây tuổi 1. Trong khi
đó, hàm lượng MR2 ln cao trong suốt vịng đời cây. Có điểm đặc biệt trên sâm
Ngọc Linh là hàm lượng M-R2 tăng chậm khi cây ở tuổi 1 đến tuổi 4 và tăng đột
biến khi cây lên tuổi 5 cao gấp 2,7 lần cây tuổi 4, sau đó tăng chậm khi ở tuổi 6 đến

11 tuổi. Cây ở tuổi 11 thì hàm lượng M-R2 là 10,49 mg/ml gấp 30% cây 5 tuổi.
Hàm lượng ginsenosid tổng số cũng tăng dần theo độ tuổi của củ sâm Ngọc Linh,
và tăng rõ nhất ở tuổi thứ 5, khi củ đạt 11 tuổi thì hàm lượng ginsenoid tổng số đạt
18,49 mg/ml, cao gấp 2,93 lần so với củ sâm Ngọc Linh 1 tuổi. Cho thấy đặc tính
dược lý trên sâm có sự tác động của tuổi sinh lý.
1.3. Giá trị dược liệu
Theo sở y tế tỉnh Nam Định (30/11/2019) nhân sâm được coi là đầu vị của
thuốc bổ khí và đứng đầu trong 4 vị thuốc quý của Đơng y: sâm, nhung, quế, phụ.
Với cơng năng bổ khí, ích huyết, sinh tâm, định thần, ích trí. Dùng để trị chứng
chân khí suy kém, cơ thể thường xuyên mệt mỏi, đoản hơi, đoản khí, chân tay lạnh,
mạch yếu, người gầy yếu, cơ thể mới ốm dậy, kém ăn, trí nhớ suy giảm, người ở
trạng thái căng thẳng thần kinh, trong người nóng, háo khát, đái tháo, tim loạn nhịp,
sinh dục kém, trẻ em quá gầy yếu, chậm lớn,...
Với giá trị dược lý trên sâm cũng đứng đầu trong danh sách dược liệu có giá
thành cao nhất trong các lồi dược liệu quý trên thế giới. Theo văn phòng của Cơ
quan Xúc tiến Thương mại và Đầu tư Hàn Quốc tại TP.HCM (KOTRA), Hàn Quốc
xuất khẩu hơn 1,3 tấn nhân sâm đến Việt Nam vào năm 2015, với tổng giá trị lên
đến 9,46 triệu USD, tăng 93% về sản lượng và 32% về giá trị so với năm 2010. Việt
Nam là nước nhập khẩu sâm lớn thứ 6 của Hàn Quốc và lớn nhất trong ASEAN.
Qua khảo sát cho thấy 85% người tiêu dùng Việt Nam đã từng mua các sản
phẩm nơng nghiệp Hàn Quốc ít nhất một lần và 29% trong số này đã từng mua nhân
sâm. KOTRA cũng cho biết với các sản phẩm giá rẻ, Trung Quốc đã thu được
nguồn lợi lớn trong việc xuất khẩu nhân sâm vào thị trường Việt Nam. Trong vòng
5 năm qua, Trung Quốc đã tăng gấp đôi sản lượng xuất khẩu sâm tươi sang Việt

5


Nam và hiện chiếm 28% thị phần, trong khi đó thị phần của Hàn Quốc giảm từ 83%
xuống còn 55%. Cho thấy sự cạnh tranh ngày càng lớn trong thị trường xuất khấu

sâm.
Bên cạnh đó, KOTRA cũng cảnh báo xuất khẩu nhân sâm của Hàn Quốc
sang Việt Nam có thể bị ảnh hưởng khi Việt Nam trồng loại sâm riêng của mình để
giảm bớt sự phụ thuộc vào nhập khẩu. Điều này cho thấy xu hướng phát triển mới
trong ngành dược liệu nước ta là sâm, trong đó chủ lực là các loại sâm nổi tiếng như
sâm Ngọc Linh và một số giống sâm quý đang dần được tìm thấy tại nước ta có các
hoạt chất sinh học tương tự sâm Ngọc Linh.
1.4. Sơ lược về sâm Langbian
1.4.1. Phân loại thực vật học
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Apiales
Họ: Araliaceae
Chi: Panax
Loài: Panax vietnamensis
Thứ: Panax vietnamensis var. langbianensis (Nông Văn Duy và ctv 2016)
Sâm P. vietnamensis var. langbianensis là một giống sâm mới chưa được
nhiều người biết đến nên việc nghiên cứu và nhân giống bằng phương pháp nuôi
cấy in vtro sẽ mang lại lợi ít to lớn để nâng cao số lượng và sự đa dạng về loài sâm
ở Việt Nam. Đồng thời đây cũng là cơ hội và thách thức lớn trong việc nghiên cứu
sâm Lang Bian nhằm phục vụ công tác chọn giống, bảo tồn và nâng cao chất lượng
nguồn dược liệu quý này (hình 1).

6


Hình 1. Panax vietnamensis var. langbianensis (nguồn: Nơng Văn Duy và ctv 2016)
1.4.2. Phân bố
Hiện sâm Lang Bian (P. vietnamensis var. langbianensis) đang phát triển

khỏe trên vùng núi Lang Bian, huyện Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam với
quần thể nhỏ nằm rải rác với diện tích khoảng 1 km2, trên các sường dốc núi cao
1879 m đến 1900 m (Nông Văn Duy và ctg 2016). Đây cũng được xem là loại đặc
hữu quan trọng của vùng núi Tây Nguyên này.
1.4.3. Đặc điểm thực vật học
Theo Phạm Hoàng Hộ đã ghi nhận vào năm 1970, loài sâm này mọc dưới tán
rừng rậm lá rộng, ẩm ở vùng núi Lang Biang, tỉnh Lâm Đồng. Có thân rễ dạng đốt
rất gần với P. vietnamensis var. vietnamenis và P. vietnamensis var. fuscidiscus
(Hara 1970; Xiang và ctg 2007).
Qua nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các dữ liệu về hình
thái so với trình tự DNA Duy và ctg 2016 đã khẳng định đây là một thứ mới của
loài Panax vietnamensis Ha et Grushv. var. vietnamensis và được đặt tên khoa học

7


Panax vietnamensis Ha & Grushvitzky var. langbianensis N.V. Duy, V.T Tran &
L.N. Trieu, tên tiếng Việt đề xuất sâm Lang Bian.
Sâm Lang Bian là loài cây thân thảo lâu năm, cao 50-90 cm. Thân thẳng,
mảnh, màu xanh, nhẵn, có lỗi xốp. Có từ 3 đến 4 lá đơi khi 5 lá. Cuống lá dài 8-13
cm. Lá kép thường có 5 lá chét, gân lá chét từ 5-8 cặp, viền lá có rang cưa. Thân rễ
dạng đốt nằm ngang, đường kính từ 1-2,5 cm, khoảng cách giữa các đốt rất gần
nhau từ 2-5 mm, bên ngồi màu nâu vàng. Cây có chứa rễ củ dưới thân rễ, phình to
hình chóp hoặc nón có đường kính từ 2-4 cm, dài 3-5 cm. Đây là loài phát hoa dạng
tán gồm 40 đến 80 hoa, hoa có đường kính 1,5-2 cm, cuống nhỏ, đế hoa đài hoa
xịe. Đài hoa có 5 cánh hình tam giác, nhẵn. Quả có dạng hình trứng nhỏ, có đường
kính từ 4-5 mm, hạt chắc, quả thường mang 1 hạt.
1.5. Các vấn đề liên quan đến đề tài nghiên cứu
1.5.1. Sự phát sinh hình thái ở thực vật
1.5.1.1. Phát sinh phơi vơ tính

Phơi vơ tính hay cịn gọi là phơi soma được hình thành khơng thơng qua q
trình tạo mơ sẹo, chúng có thể được tạo ra trực tiếp hoặc qua nhân sinh khối. Các tế
bào này có khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh. Lượng cytokinin có trong tế bào
cao thường có khả năng phát sinh phơi thấp. Ngoài ra, một số yếu tố ảnh hưởng đến
sự phát triển bình thường của phơi như auxin, tỉ lệ đạm ammonium và nitrate, pH
môi trường thấp… Trong nuôi cấy phôi, q trình sinh trưởng phát triển phơi ln
có sự thay đổi. Phơi có thể phát triển thành khối callus từ đó có thể tái sinh cây hồn
chỉnh từ khối callus, cây tái sinh sẽ có sự thay đổi về mặt di truyền. Năm 1959,
Rangaswamy đã phát hiện rằng nuôi cấy phơi tâm-nucellar có khả năng tạo mơ sẹo,
phân hóa thành “pseudolbils” (dạng củ giả) có khả năng hình thành cây hồn chỉnh.
1.5.1.2. Phát sinh chồi
Trong ni cấy thực vật có sự phát sinh hình thành chồi bất định phát sinh
trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus. Sự phát sinh chồi bất định trực
tiếp bắt đầu từ các tế bào nhu mơ nằm trong biểu bì hoặc ngay dưới bề mặt thân.
Chồi hình thành trực tiếp trên mẫu ni cấy được xem là q trình phát sinh chồi
trực tiếp, những chồi này thường đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, ở quá trình
tạo chồi gián tiếp, chồi phải trải qua giai đoạn hình thành callus từ đó hình thành

8


phơi và chồi hồn chỉnh, các chồi này thường có khả năng biến dị cao, tức không
đồng nhất với mẫu ban đầu do cấy chuyền nhiều lần nên không ổn định về mặt di
truyền. Để hạn chế quá trình biến dị trên cần hạn chế quá trình cấy chuyền nhiều lần
trên các mơi trường có chứa các chất kích thích sinh trưởng và khiến mẫu callus đi
vào quá trình biệt hóa tạo chồi sớm sẽ giúp ổn định di truyền cho cây con nuôi cấy.
1.5.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường là yếu tố quan trọng trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái
tế bào và mơ thực vật trong nuôi cấy in vito. Thành phần môi trường thay đổi cũng
làm thay đổi sự sinh trường, phát sinh hình thái trên thực vật. Hàm lượng dinh

dưỡng trên mỗi môi trường ni cấy là khác nhau và có rất nhiều cơng thức môi
trường từ nghèo dinh dưỡng như White (1963), Knop đến mơi trường trung bình,
giàu dinh dưỡng như Gamborg’B5 (1976), Murashige-Skoog (1962). Ngồi tác
động của mơi trường khống lên q trình sinh lý, sinh hóa thực vật, các hợp chất
hữ cơ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, độ pH, … cũng góp phần làm thay đổi
khả năng sinh trưởng và phát sinh hình thái trên thực vật.
1.5.2.1. Nguồn carbon (C)
Đường sucrose hay saccharoza là nguồn cacbon chủ yếu được sử dụng để
cung cấp năng lượng cho quá trình quang hợp ở thực vật. Mô và tế bào thực vật
nuôi cấy in vitro số chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, ít có khả năng tự dưỡng. Vì
vậy đưa nguồn cacbon hữu cơ vào môi trường nuôi cấy là điều bắt buộc. Thậm chí
các mơ bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong
suốt q trình ni cấy đã khơng tự dưỡng cacbon. Việc bổ sung lượng cacbon bên
ngồi vào mơi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi xanh. Nguồn
cacbon có hiệu quả và thơng dụng nhất hiện nay là đường sucrose, nồng độ thường
dùng từ 2-3%. Tiếp đến là glucose, nhưng lại có giá thành cao và hữu hiệu với cây 1
lá mầm hơn là cây 2 lá mầm. Ngồi ra, glucose và sucrose có khả năng duy trì áp
suất thẩm thấu của mơi trường trong nuôi cấy phôi.
Sucrose khi hấp khử trùng sẽ biến đổi thành gucose và fructose, được các tế
bào và mô nuôi cấy sử dụng từ từ cho thấy sự sinh trưởng tốt hơn hẳn mơi trường
chỉ có glucose hoặc fructose.

9


Thông qua một số nghiên cứu về nồng độ đường trong nuôi cấy sâm Ngọc
Linh của Nguyễn Trung Thành và ctv (2007), đã cho thấy nồng độ đường thích hợp
cho sâm sinh trưởng là 30g/l, khi tăng nồng độ đường lên sẽ làm giảm sự sinh
trưởng của tế bào cũng như tổng hợp chất ginsenoside. Không chỉ Nguyễn Trung
Thành, nhiều tác giả cũng sử dụng nồng độ đường là 30g/l như trong nghiên cứu

của Nguyễn Thị Quỳnh và ctv về sự hình thành và tăng trưởng rễ bất định trên sâm
Đương Quy Nhật Bản (2013). Hay nghiên cứu về sự ảnh hưởng của hàm lượng
khoáng đa lượng và bổ sung dinh dưỡng trong nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc
Linh của Nguyễn Văn Kết, Trương Thị Lan Anh (2016).
1.5.2.2. Khống đa lượng
Khơng chỉ trong ni cấy mơ, khống đa lượng là yếu tố không thể tiếu cho
giới thực vật. Hiện có khoảng 12 nguyên tố đa lượng được biết đến là cần thiết cho
q trình sinh lý, sinh hóa diễn ra bên trong thự vật. Các nguyên tố này được bổ
sung vào môi trường nuôi cấy in vitro ở dạng hợp chất, đơn chất tùy thuộc loại môi
trường nuôi cấy khác nhau. Mỗi ngun tố kháng đóng vai trị khác nhau trong tế
bào sống thực vật, khi vắng mặt một ngun tố khống nào đó cũng ảnh hưởng rất
lớn đến sự sinh trưởng, phát sinh hình thái bình thường trên thực vật.
1.5.2.3. Các vitamin
Tất cả tế bào thực vật đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ
bản nhưng thường với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mơ có sức sinh trưởng tốt
cần bổ sung vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Vitamin rất cần thiết cho
các phản ứng sinh hố. Thơng thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho
sự tăng trưởng và phát triển. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến
dưỡng khác nhau. Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro là:
thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Vitamin kết
hợp với các thành phần khác trong mơi trường ni cấy có tác động hình thành mơ
sẹo, tế bào, hình thành phơi, rễ, chồi trên mẫu cấy.
1.5.2.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc
“nội sinh”, là chất có khả năng tự sản sinh ra trong cây và có ngồn gốc “ngoại sinh”,
tức phải bổ sung từ bên ngồi vào mơi trường ni cấy. Chúng rất cần thiết để kích

10



thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô
và các tổ chức. Tùy theo lồi thực vật, loại mơ, hàm lượng chất điều hòa sinh
trưởng nội sinh mà điều chỉnh cho thích hợp.
Cytokinin là dẫn xuất của adenine, là những hormone liên quan đến sự phân
chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong ni cấy mơ. Vai trị
của cytokinin là hoạt hóa sự phân chia tế bào mạnh mẽ, hình thành nên các tế bào
mới. Hiệu quả này có được là do khả năng kích thích sự tổng hợp axit nucleic,
protein và có mặt trong ARN vận chuyển. Bên cạnh đó, cytokinin cịn kìm hãm sự
hóa già và kéo dài tuổi thọ của cây, hàm lượng cytokinin nhiều làm cho lá xanh lâu
do tăng quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng đặc biệt là protein, axit nucleic và
diệp lục về nuôi lá đồng thời ức chế các quá trình phân hủy nên được gọi là
hormone trẻ hóa (Hồng Minh Tấn và ctv 2006).
Auxin là chất phân chia tế bào, các hormone nhóm này có hoạt tính tăng
trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân
hóa mạch dẫn. Ngồi ra, auxin cịn tác động hoạt hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián
tiếp làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản
ứng với áp suất trương.
Tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa quyết định
trong quá trình phát sinh hình thái của cây trong nuôi cấy in vitro. Đối với sự phát
sinh phôi, để tạo callus và rễ cần có tỉ lệ axin/cytokinin cao và ngược lại, sẽ sản sinh
chồi và chồi nách. Lợi dụng hiệu quả này mà người ta sử dụng auxin và cytokinin
để điều chỉnh sự phát sinh hình thái trong ni cấy mơ thực vật theo đúng mục đích
nghiên cứu và sản xuất.
1.5.2.5. Nước dừa
Bên trong nước dừa rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích
thích sinh trưởng (George 1993; George 1996). Nước dừa đã được sử dụng để kích
thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Trong nuôi cấy phôi, sử dụng
nước dừa không qua khử trùng bằng autoclave, phôi sẽ tăng chiều dài nhưng khơng
có dấu hiệu nảy mầm sớm. Tác dụng tích cực này của nước dừa trong ni cấy mô
thức vật đã được nhiều nhà nghiên cứu công nhận. Theo Nguyễn Việt Cường và ctv

(2013) nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat lên sự sinh

11


trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro cho rằng sâm Ngọc
Linh sinh trưởng và phát triển tốt nhất trên mơi trường ni cấy có bổ sung 50 ml/l
nước dừa. Khi tăng nồng độ dung dịch nước dừa vượt ngưỡng này mẫu ni cấy có
chiều hướng giảm khả năng sinh trưởng, điều này cũng tương tự khi mẫu được nuôi
cấy trong môi trường không hoặc sử dụng nước dừa với nồng độ thấp. Nguyên nhân
mẫu giảm khả năng sinh trưởng có thể là do lượng cytokinin và một số chất kích
thích sinh trưởng nhóm gibberellin và auxin trong nước dừa tác động gây kích thích
hoặc ức chế q trình sinh trưởng trên mẫu ni cấy (Yong và ctv 2009). Đây là cơ
sở khoa học để mở đầu cho các nghiên cứu mới trên sâm Panax vietnamensis var.
langbianesis và các loài sâm khác trên thế giới.
1.5.2.6. Agar
Agar là chất làm rắn môi trường, tránh cho mô bị chìm trong mơi trường
lỏng và chết vì thiếu oxy. Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số lồi
tảo, chúng có ưu điểm là khơng cảm ứng với các thành phần của môi trường. Đặc
biệt, không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các
nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành. Lượng agar sử dụng trông nuôi cấy mô thực vật
phụ thuộc vào mục đích, loại mẫu ni cấy mà điều chỉnh từ 0,5-1%.
1.5.2.7. pH môi trường
Tế bào và mơ thực vật địi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong
nuôi cấy. Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion trong môi trường nuôi
cấy, pH được điều chỉnh trước hấp khử trùng từ 5,0-6,0 là tối ưu. Sau hấp pH lệch
0,5 trước hấp. Độ pH ảnh hưởng đến khả năng đông đặc môi trường, pH cao sẽ làm
môi trường rất cứng trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar.
1.5.2.8. Các loại môi trường nuôi cấy sâm hiện nay
Trong nhân giống theo phương pháp ni cấy in vitro việc tìm ra môi trường

nuôi cấy là điều quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật. Đặc biệt trên đối
tượng là cây dược liệu q có giá trị như sâm thì việc xác định môi trường nuôi cấy
được xem là bước đầu trong nhân giống in vitro. Với những nghiên cứu trước đây,
nhiều tác giả đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại mơi trường khác nhau trong đó
một số mơi trường điển hình thường gặp nhứ MS, SH, WPM, B5… Theo Hoàng
Ngọc Nhung và ctv (2012), Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào

12


cây Đương quy Nhật Bản đã sử dụng môi trường MS, MS cải biên, Gamborg’ B5,
B5 cải biên đã có cảm ứng tích cực hình thành mơ sẹo, rễ bất định. Trong đó mơi
trường B5 cải biên có số rễ hình thành trên mẫu, khối lượng tươi, khối lượng khơ
cao nhất lần lượt là 31 rễ/ mẫu, 86,5 mg khối lượng tươi và 9,9 mg khối lượng khô.
Các môi trường cịn lại đều cảm ứng tạo rễ và mơi sẹo ở mức tỉ lệ tăng dần theo chỉ
tiêu tạo mô sẹo, rễ là môi trường MS cải biên đến B5 cải biên. Điều nay cho thấy
mơi trường MS, B5 có hiệu quả trong nuôi cấy sâm.
Vào năm 2013, Mai Trường và ctv đã nghiên cứu về nuôi cấy mô sẹo có khả
năng sinh phơi và mơ phơi soma sâm Ngọc Linh đã sử dụng môi trường MS kết hợp
1 mg/l 2,4D – 1 mg/l NAA – 0,2 mg/l kinetin – 10% nước dừa và 30 g/l đường
succcharose, để tiến hành nghiên cứu tạo mơ sẹo có khả năng phát sinh phơi đã cho
thấy mơ sẹo ở trạng thái cứng, có hình thành diệp lục tố, có khả năng phát sinh phơi
và phát sinh hình thành phơi soma dạng cầu. Từ phơi này cấy chuyền sang mơi
trường MS lỏng có 0,5 mg/l 2,4D và 0,5 mg/l NAA nhân sinh khối thu được khối
lượng tươi tăng gấp 3 lần khối lượng trước đó. Từ phơi soma nghiên cứu này cũng
cho thấy chúng có khả năng cảm ứng tạo chồi, rễ hình thành cây hồn chỉnh. Khi
cấy chuyền sang mơi trường 1/2 MS có sử dụng 2 mg/l NAA – 0,1 mg/l BA nuôi
cấy trong môi trường lỏng các phôi này sinh trưởng phát sinh hình thái dạng phơi
đơn, cụm đa phơi, các phơi này có khả năng tạo chồi khi cấy chuyền sang 1/2 MS
có 0,5 mg/l BA. Ngồi ra từ mơ phơi trên cịn được dùng để tạo rễ khi ni cấy vào

môi trường 1/2 MS lỏng với 2 mg/l NAA sau 30 ngày bắt đầu hình thành rễ trên
phơi. Mai Trường và ctv đã dùng các mẫu phơi có khả năng tạo rễ trên vào môi
trường B5 với 3 mg/l NAA cho kết quả tương tự như nghiên cứu tạo sinh khối rễ
sâm Panax gisneng từ phôi cầu giai đoạn sớm của Gu (2003). Vậy tùy giai đoạn
phát triển và mục đích nghiên cứu mà sử dụng các mơi trường khống ni cấy
khác nhau trong nghiên cứu mẫu sâm.
Ngơ Thị Ngọc Hương và ctv (2015) đã tiến hành nghiên cứu về sự ảnh
hưởng của thành phần khoáng lên sinh trưởng của cây sâm Việt Nam (Panax
Vietnamensis Ha et Grushv.) trong điều kiện quang tự dưỡng cho rằng mơi trường
MS có hàm lượng khoáng đa lượng KNO3 và NH4NO3 giảm một nửa (MM), chồi
sâm P.vietnamensis sinh trưởng tốt hơn môi trường MS, ES (Enshi-Shoho), Heller

13


(HE). Sau 90 ngày nuôi cấy khối lượng tươi đạt cao nhất là 261,3 mg/cây, ít nhất là
HE với 148 mg/cây. Trong khi đó mơi trường MS, ES khơng có sự khác biệt nhiều
về khối lượng tươi. Khôi lượng khô trên môi trường MM cũng đạt cao nhất trong
các môi trường nuôi cấy trên với 61 mg/cây so với môi trường MS là 42,3 mg/cây
hay HE 39,2 mg/cây. Tuy nhiên các mơi trường trên khơng có sự khác biệt thống kê
so với môi trường ES. Theo kết quả trên môi trường MS có hàm lượng đa lượng
giảm ½ lại có khả năng gia tăng trọng lượng mẫu chồi trên sâm Ngọc Linh.
Nghiên cứu vào năm 2017 của Nguyễn Lê Thụ Minh và ctv về ảnh hưởng
của nồng độ đường, vitamin, cường độ ánh sáng và thành phần khoáng lên sự tăng
trưởng của sâm Bố Chính (Hibiscus sagittifolius Kurz) trên mơi trường MS, MS cải
biên có thành phần khống đa lượng giảm 1/2 (1/2 MS), khống NH 4NO3 giảm ½
(1/2 NH4), SH, B5, ES. Trên mơi trường SH có diện tích lá cao nhất là 12,4 cm2 với
rễ phát triển mạnh sau 42 ngày nuôi cấy, số rễ đạt 8,2 rễ/cây dài 58,1 mm/cây. Trên
mơi trường ES lại có số lượng lá và thân cao nhất với số lá 6,4 lá/cây, thân 49,6
mm/cây. Trong thí nghiệm này mơi trường MS sâm Bố Chính sinh trưởng chậm

nhất so với các mơi trường ni ½ MS, ½ NH4, chỉ 5,1 lá/cây và 3,6 rễ/cây. Trên
mơi trường ½ MS, ½ NH4 có các chỉ tiêu trên gần như tương đương nhau.
Ngồi mơi trường MS, 1/2 MS, B5, SH thường được sử dụng trong nghiên
cứu về chi nhân sâm, môi trường WPM cũng được một số tác giả sử dụng để thử
nghiệm khả năng phát sinh hình thái chồi mới trên mẫu chồi sâm ni cấy. Theo
nghiên cứu nhân giống in vitro cây nhân sâm (Panax gingeng C.A Meyer) của
Nguyễn Thị Tình và ctv (2018) đã khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
MS, B5 và WPM có bổ sung inositol 100 mg/l – 30 g/l đường sucros đến khả năng
tái sinh chồi cho kết quả tích cực. Sau 20 ngày ni cấy tất cả các mơi trường đều
có cảm ứng tạo chồi mới, trong đó mơi trường khống MS có khả năng tái sinh
chồi cao nhất 60 chồi, chồi mập xanh, nhưng trên mơi trường B5 chỉ hình thành 36
chồi, các chồi này mập, xanh và cao. Tuy mơi trường WPM có khả năng sinh chồi
mới nhưng số lượng chồi sau khảo sát lại thấp nhất trong các môi trường nuôi cấy
chỉ đạt 22,5 chồi. Môi trường WPM trong nghiên cứu này tuy khơng có tác dụng tạo
chồi cao nhưng đây cũng là môi trường tiềm năng cho các nghiên cứu phát sinh
hình thái khác trên chi Panax.

14


Dựa trên các nghiên cứu về sự tác động của mơi trường khống trong ni
cấy in vitro trên một số đối tượng dược liệu, ta có thể sử dụng một số mơi trường
khống như SH, MS, 1/2 MS, WPM, B5 vào nghiên cứu về ảnh hưởng của mơi
trường khống đến khả năng phát sinh hình thái của phơi, chồi sâm Lang Bian này.

15


Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện

Nhiên cứu được tiến hành tại phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học Thực
Vật - Khoa Nông Lâm - trường Đại học Đà Lạt.
Thời gian tiến hành từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 3 năm 2020.
2.2. Vật liệu nuôi cấy
Nguồn mẫu là phôi và chồi sâm Lang Bian được cung cấp từ phịng thí
nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Khoa Nông Lâm trường Đại học Đà Lạt.
2.3. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu nhằm tìm ra loại mơi trường thích hợp cho q trình phát sinh
hình thái (phơi thứ cấp, chồi, tạo rễ,,...) từ mẫu phôi và chồi của sâm Lang Bian.
2.4. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số mơi trường khống (MS; 1/2 MS; B5;
SH, WPM) đến sự phát sinh hình thái trên mẫu phơi sâm Lang Bian in vitro
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường khoáng (MS; 1/2 MS; B5;
WPM; SH) đến sự phát sinh hình thái trên mẫu chồi sâm Lang Bian in vitro
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số mơi trường khống (MS; 1/2 MS; B5;
SH; WPM) đến sự phát sinh hình thái trên mẫu phơi sâm Lang Bian in vitro
Cách tiến hành: Cấy mẫu phôi sâm Lang Bian có kích thước 3-5 mm vào
một số mơi trường khống (MS; 1/2 MS; B5; SH; WPM), có bổ sung 0,5 mg/l BA
và 0,1 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 8,8 g/l agar, 5 % (v/v) nước dừa. pH môi trường
được điều chỉnh đến 6.0 trước hấp khử trùng. Môi trường nuôi cấy được hấp khử
trùng ở 1210C, 1atm, trong 25 phút.
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp hồn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm
thức lặp lại tối thiểu 3 lần. Các chỉ tiêu về tỉ lệ mẫu tạo phôi, số lượng phôi/mẫu, tỉ
lệ mẫu tạo chồi, số lượng chồi/mẫu, khối lượng tươi, khối lượng khô được ghi nhận
30, 60, 90 ngày sau nuôi cấy.

16



2.5.2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số môi trường khoáng (MS; 1/2 MS;
B5; WPM; SH) đến sự phát sinh hình thái trên mẫu chồi sâm Lang Bian in vitro
Cách tiến hành: Chồi sâm Lang Bian in vitro 3 tháng tuổi được tách nhẹ
bằng dao, có kích thước từ 8-10 mm được cấy vào mơi trường khống MS; 1/2 MS;
B5; SH; WPM; có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 8.8 g/l agar, 5 % (v/v)
nước dừa. pH môi trường được điều chỉnh đến 6.0 trước hấp khử trùng. Môi trường
nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1210C, 1atm, trong 25 phút.
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm
thức lặp lại tối thiểu 3 lần. Các chỉ tiêu: Tỉ lệ mẫu tạo phôi, số lượng phôi/mẫu, tỉ lệ
mẫu tạo chồi, số lượng chồi, chiều cao cây, khối lượng tươi, khối lượng khô được
xác định sau 120 ngày nuôi cấy.
2.6. Điều kiện nuôi cấy
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vơ trùng
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày
Nhiệt độ phòng: 25±20C
Độ ẩm: 75-80%
2.7. Chỉ tiêu theo dõi
Sau thời gian nuôi cấy các chỉ tiêu như tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái khác
nhau (cảm ứng tạo chồi, phát sinh phôi, tạo rễ, số rễ/mẫu...) được ghi nhận.
Tỷ lệ mẫu phát sinh phôi =

Số mẫu phát sinh phôi
Tổng số mẫu

Tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi =

Tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ =

×100


Số mẫu cảm ứngtạo chồi
Tổng số mẫu

Số mẫu cảm ứng tạo rễ
Tổng số mẫu

×100

×100

Số lượng phơi (phơi/mẫu): Quan sát dưới kính lúp và đếm số phơi trên mẫu.
Số lượng chồi (chồi/mẫu): Quan sát và đếm số chồi trên mẫu.
Số lượng rễ (rễ/mẫu): Quan sát và đếm số lượng rễ trên mẫu.
Chiều cao chồi (mm/chồi): Đo chiều cao chồi bằng thước có vạch đến mm.

17


Chiều dài củ (mm/mẫu): Đo chiều dài củ bằng thước có vạch mm.
Khối lượng tươi (mg/mẫu): Mẫu chồi được xác định khối lượng bằng cân
trên cân phân tích.
Khối lượng khơ (mg/mẫu): Mẫu sấy ở nhiệt độ 600C, trong 3 ngày đến khi
khối lượng khơng đổi, sau đó xác định khối lượng khơ bằng cân phân tích.
2.8. Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel 2010 để phân tích và tổng hợp các số liệu thơ thu thập
được từ các thí nghiệm.
Dùng phần mền MSTATC thống kê và phân tích các số liệu từ bảng ANOVA
ban đầu với mức sai số có ý nghĩa là α = 0,05.

18